現(xiàn)代儀器方法在中藥分析檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

王曉玲，王子明，付藝萱，張旭超，李來明

（西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041）

目前，隨著人們對化學(xué)藥局限性的認(rèn)識和了解，以及當(dāng)今世界“回歸自然”思潮的影響下，全球日益重視天然藥物的研究.中藥具有歷史悠久、理論獨(dú)特、療效顯著、資源豐富等特點(diǎn)，在天然藥物中占據(jù)重要地位，這為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展帶來重大機(jī)遇. 由于中藥主要取材于天然產(chǎn)物及其加工品，包括植物藥、動物藥、礦物藥及部分化學(xué)、生物制品，其中還包括民族民間習(xí)用藥材等，因此每味藥材以及處方所含成分極其復(fù)雜.其質(zhì)量控制和安全有效性評價(jià)都缺乏高效的方法和明確的標(biāo)準(zhǔn)，這在一定程度上制約了中藥的開發(fā)和利用.因此，如何充分利用現(xiàn)代化科學(xué)技術(shù)手段與方法，建立合理可靠的中藥分析方法來保證藥物的質(zhì)量穩(wěn)定可控和安全有效，闡明藥理機(jī)制，促進(jìn)中藥新藥的研究與開發(fā)，這是當(dāng)下也將是今后中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中所需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題.

本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行綜述:色譜及其質(zhì)譜、核磁共振譜等聯(lián)用技術(shù)、紫外光譜、紅外光譜、電化學(xué)分析、顯微技術(shù)、電泳技術(shù)以及其他新型中藥分析技術(shù)在中藥研究、開發(fā)與生產(chǎn)中的最新應(yīng)用. 希望對中藥分析檢測感興趣的研究者有所啟發(fā)和幫助.

1 色譜在中藥分析檢測中的應(yīng)用

色譜是一種應(yīng)用廣泛且經(jīng)典的方法，隨著現(xiàn)代技術(shù)及自動化和智能化的發(fā)展，現(xiàn)代色譜已經(jīng)發(fā)展出較多分支，主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、電泳色譜及其聯(lián)用技術(shù)等，其在現(xiàn)代中藥分析中的優(yōu)越性和適用性各具特色.

1.1 薄層色譜(TLC)及其聯(lián)用技術(shù)

TLC 是一種廣泛應(yīng)用于中藥材、飲片及制劑的研究和生產(chǎn)的檢測方法，具有專屬性強(qiáng)、操作簡單、成本低、速度快等特點(diǎn). TLC 主要用于某種(類)成分的定性鑒別.近年衍生的高效薄層色譜法(HPTLC)，正在廣泛地應(yīng)用于中藥成分的定性定量分析. 馬來西亞MARA 大學(xué)的Ahmad Tamim Ghafari 等[1]首次使用經(jīng)驗(yàn)證的HPTLC 評估三葉蔓荊葉水醇提取物中潛在抗炎、抗癌作用的酚類化合物的含量. 結(jié)果表明所建立的HPTLC 方法具有良好的線性、精密度和準(zhǔn)確度.沙特吉達(dá) KAUST 的 Raha Orfali 等[2]采用 HPTLC 對沙特藥用植物西葫蘆的兩種提取物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化.準(zhǔn)確分離得到五種次生代謝產(chǎn)物，方法簡便精確、靈敏且選擇性高，可用于二級代謝產(chǎn)物的同時(shí)定量測定，分析結(jié)果可作為植物分類鑒定和評價(jià)的植物標(biāo)記物.

此外，薄層色譜與其他技術(shù)聯(lián)用已成為中藥現(xiàn)代化高效定性定量的方法之一，如Chen 等[3]提出來一種HPTLC 與實(shí)時(shí)離子源直接分析(DART)相結(jié)合的方法，即HPTLC 與超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，明確大果飛蛾藤的化學(xué)成分，提高其質(zhì)量控制水平.采用 TLC 對 2，2′-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH)和黃嘌呤氧化酶進(jìn)行TLC 生物自顯像，以快速篩選用于高效液相色譜法(HPLC)測定大果飛蛾藤中的標(biāo)記物，結(jié)合TLC 自顯影和TLC 生物自顯影結(jié)果，篩選出8 個(gè)化合物作為HPLC 檢測的標(biāo)志化合物. 經(jīng)DARTMS 鑒定，中藥大果飛蛾藤的生物堿成分為包公藤A和包公藤C，這一研究結(jié)果作為對該藥材的質(zhì)量控制有一定促進(jìn)作用. 又如Huck-Pezzei 等[4]介紹了一種新的分析平臺，即TLC、HPLC、質(zhì)譜(MS)和振動光譜等分離技術(shù)進(jìn)行協(xié)同結(jié)合對圣約翰草提取物和組織進(jìn)行分析和質(zhì)量鑒定，TLC 成功地鑒別出來自中國某些產(chǎn)地樣品的摻雜成分.采用該方法一方面清楚地區(qū)分開了歐洲和中國的樣品，另一方面成功地用于未知成分的半制備分離，利用紅外成像光譜技術(shù)對高分辨成分分布進(jìn)行了研究. 最后，根據(jù)德意志阿茲內(nèi)米特藥典(DAC)，該分析平臺可用于快速和非破壞性定量和質(zhì)量控制，以識別藥材中的摻假.

1.2 高效液相色譜法(HPLC)及其聯(lián)用技術(shù)

由于HPLC 靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、分析速度快、適用性廣，被廣泛應(yīng)用于中藥分析檢測領(lǐng)域.《中國藥典》(一部)2020 版中已有 348 種藥材、26 種提取物，以及1 384 種制劑使用HPLC 法作為定性定量的工具.HPLC 還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能與許多檢測器聯(lián)用，比如二極管陣列檢測器(DAD)、蒸發(fā)光閃射檢測器(ESLD)、示差折光檢測器(RI)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振譜(NMR)等，可以針對不同類型的成分提供豐富的檢測信息.據(jù)大量文獻(xiàn)資料報(bào)道，HPLC 及其聯(lián)用技術(shù)主要用于中藥有效成分定性與定量、指紋圖譜、中藥炮制以及代謝組學(xué)分析等. 其目的是確保中藥材、飲片炮制及制劑生產(chǎn)的質(zhì)量和療效[5].

付藝萱等[6]利用HPLC-DAD 對藏藥二十五味松生等丸中的毒性成分烏頭堿的含量限度進(jìn)行了檢測，數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性，為此類含烏頭堿的藏藥制劑的安全性檢查提供了依據(jù).王鴻麗等[7]建立高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)法，測定中藥冬蟲夏草中三價(jià)砷和五價(jià)砷等6 種價(jià)態(tài)砷的含量. 結(jié)果表明建立的HPLC-ICP-MS 法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于測定冬蟲夏草中所含不同價(jià)態(tài)砷含量，為蟲草中砷限量檢測改進(jìn)研究提供新思路和新方法.Balkrishna 等[8]使用 HPLC-DAD 定量分析一種用于治療COVID-19 的含鈣草藥(DSV)成分中選定的11種標(biāo)記成分.結(jié)果表明11 個(gè)標(biāo)記物線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度都滿足定量的要求.

目前，由于小顆粒、高性能微粒固定相的出現(xiàn)，超高效液相色譜儀(UHPLC 或UPLC)問世，與傳統(tǒng)的HPLC 相比其分析速度快約3 倍、靈敏度高約3 倍以及分離度高出約1.7 倍，大大縮短了分析時(shí)間，減少了溶劑的用量，從而降低了分析成本. 如Wang 等[9]利用UPLC 和超高效超臨界流體色譜(UHPSFC)研究中藥紅芪的分離特性，建立了一種高通量測定中藥多組分的方法，該研究同時(shí)測定紅芪中10 種化合物的高通量方法，在UHPSFC 和UPLC 分離條件下，色譜參數(shù)比較表明，這兩種分離技術(shù)相結(jié)合可以有效分離紅芪中的10 個(gè)目標(biāo)化合物，從而建立一種新的綜合評價(jià)紅芪樣品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化方法.

HPLC 的聯(lián)用技術(shù)多用于中藥代謝產(chǎn)物的分析.陳紅影等[10]運(yùn)用高分辨HPLC-MS/MS 技術(shù)對黃連堿生物樣品中的藥物原型及代謝物進(jìn)行鑒定.結(jié)果在大鼠尿液、糞便等七種生物樣品中發(fā)現(xiàn)了黃連堿的17個(gè)代謝產(chǎn)物，為黃連堿的藥效學(xué)和藥理學(xué)研究提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ). 王璐等[11]運(yùn)用高效液相色譜-二極管陣列-電噴霧-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLCDAD-ESI-IT-TOF-MSn)技術(shù)，對當(dāng)歸乙醇提取物在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析.結(jié)果從大鼠含藥尿液中共指認(rèn)出2 個(gè)原型成分和17 個(gè)代謝產(chǎn)物. 該法能準(zhǔn)確、快速地指認(rèn)藥材提取物中主要成分及生物樣品中的代謝產(chǎn)物，為闡明當(dāng)歸的藥效物質(zhì)及顯效形式提供了科學(xué)依據(jù).

HPLC 還在中藥指紋圖譜的確定中有著舉足輕重的地位，中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià).《中國藥典》(一部)2020 版已有27 個(gè)品種規(guī)定了指紋圖譜鑒別. 近來，劉娟等[12]采用HPLC法對12 批不同來源的川芎樣品進(jìn)行指紋圖譜研究，結(jié)果建立了川芎藥材HPLC 指紋圖譜，標(biāo)定了17 個(gè)共有峰，指認(rèn)了7 個(gè)成分，指紋圖譜的相似度達(dá)0.900以上.羅蘭等[13]用HPLC 建立何首烏標(biāo)準(zhǔn)飲片的特征圖譜，結(jié)果構(gòu)建了由7 個(gè)色譜峰組成的何首烏標(biāo)準(zhǔn)飲片HPLC 特征圖譜，能更好地反映原型飲片的內(nèi)在質(zhì)量，可用于何首烏飲片的質(zhì)量控制. Khan 等[14]用HPLC 研究生長在孟加拉國的大蓬葉乙醇莖皮提取物的指紋圖譜，結(jié)果不僅測定了提取物中的多酚含量，也為大蓬葉乙醇莖皮提取物的質(zhì)量控制提供了借鑒.

1.3 氣相色譜法(GC)及其聯(lián)用技術(shù)

GC 是除了HPLC 以外，在中藥分析檢測領(lǐng)域應(yīng)用較多的一種技術(shù).《中國藥典》(一部)2020 版中有159 個(gè)品種使用了GC 作為定性定量的檢測方法.GC可單獨(dú)用于中藥中熱穩(wěn)定、易揮發(fā)組分，以及溶劑和農(nóng)藥殘留等外源性污染的定性定量. 比如胡丹等[15]用GC 建立參蘇丸的指紋圖譜，結(jié)果表明該法簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于評價(jià)參蘇丸的質(zhì)量.

GC 還常與其他檢測技術(shù)聯(lián)用，其中聯(lián)用最多的是MS.GC-MS 因具有GC 的高分離度和MS 的高分辨率、高靈敏度，被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，尤其適合于低分子化合物(分子量＜1 000)的分析.特別是中藥中易揮發(fā)性成分的定性定量方面，GC-MS技術(shù)的優(yōu)勢顯得更為明顯[16].裴建云等[17]用GC-MS聯(lián)用技術(shù)定性定量分析當(dāng)歸不同部位揮發(fā)油成分.結(jié)果從當(dāng)歸根和須揮發(fā)油中分別鑒定出67 和65 個(gè)化學(xué)成分，為中藥當(dāng)歸的加工及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).沈廷明等[18]采用GC-MS 對畬藥十二時(shí)辰花揮發(fā)油的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析研究，并采用面積歸一化法測定各成分的百分比含量，為十二時(shí)辰規(guī)?；侠碓耘嗉百|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考. 王瑞芳等[19]利用GC-MS 和氣相色譜-嗅聞聯(lián)用技術(shù)(GC-O)對陳皮和九制陳皮中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定.結(jié)果共鑒定出93 個(gè)揮發(fā)性成分，46 種香氣活性物質(zhì).

印度的Sharma 等[20]用GC-MS 鑒定百花布葉中具有抗菌活性的成分，結(jié)果鑒定出16 個(gè)生物活性化合物.Kumarl 等[21]用GC-MS 分析雷公藤和大戟葉提取物中的植物化學(xué)物質(zhì)，用于后續(xù)的體外試驗(yàn)研究.尼日利亞的Idu 等[22]采用GC-MS 對復(fù)方葉水提物(PALE)進(jìn)行植物化學(xué)篩選，并對其中具有生物活性的化合物進(jìn)行分析確定.

2 紫外和紅外光譜法在中藥分析檢測中的應(yīng)用

中藥來源渠道多樣，真?zhèn)坞y以辨認(rèn)，貴重中藥罕見稀有.中藥市場上經(jīng)常出現(xiàn)以次充優(yōu)、以假充真的不良情況，造成中藥市場混亂，嚴(yán)重影響其安全性和有效性.紫外光譜和紅外光譜等光譜技術(shù)在中藥真?zhèn)巍絺?、產(chǎn)地鑒定、有效成分含量測定中有較多的應(yīng)用.這里主要綜述近年來紫外和紅外在中藥分析中的應(yīng)用情況.

2.1 紫外光譜法

中藥成分分子或離子對紫外光的吸收所產(chǎn)生的紫外光譜及吸收程度，可以對中藥中物質(zhì)的組成、含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、測定、推斷. 該方法具有原理簡單、操作方便、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、無污染、重現(xiàn)性好、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn).《中國藥典》(一部)2020 版已有67 個(gè)品種用到該方法作為定性定量的控制手段.

利用單一紫外光譜線法、紫外光譜組法、導(dǎo)數(shù)光譜法等紫外光譜方法可進(jìn)行中藥真?zhèn)舞b別[23]. 劉燕等[24]采用紫外光譜法進(jìn)行谷精草與華南谷精草、毛谷精草混淆品的鑒別.谷精草在330 nm 和261 nm 波長處出現(xiàn)最大吸收峰，華南谷精草在279 nm 波長處出現(xiàn)最大吸收峰，毛谷精草在272 nm 和332 nm 波長處出現(xiàn)最大吸收峰. 紫外光譜上存在明顯的區(qū)別，通過紫外光譜檢測可對三者進(jìn)行有效的鑒別. 左旭等[25]利用紫外指紋圖譜相似度來確定某苦蕎粉的閾值，通過摻假試驗(yàn)看出，當(dāng)苦蕎粉摻假物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于5%時(shí)，紫外指紋圖譜能在一定程度上反映苦蕎粉所含成分的差異，可以作為鑒別苦蕎粉質(zhì)量穩(wěn)定性的方法.李江維等[26]學(xué)者發(fā)現(xiàn)半夏的臨床用量較大，野生資源在不斷減少，用水半夏替代半夏或摻雜部分水半夏制成半夏曲現(xiàn)象十分常見.通過研究得到半夏曲與水半夏曲的紫外譜線組圖和一階導(dǎo)數(shù)譜線組圖存在差別，紫外光圖譜中水半夏曲區(qū)別于半夏曲的特征峰位在270 nm 處，因此可利用紫外光譜法鑒別半夏曲與水半夏曲. 王元忠等[27]人采用紫外指紋圖譜技術(shù)研究云南10 個(gè)不同產(chǎn)地三七樣品，結(jié)合偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對供試樣品進(jìn)行分類鑒別，結(jié)果表明三七的主要成分組成與產(chǎn)地相關(guān)性低，但是含量與產(chǎn)地存在相關(guān)性.

紫外光譜法在定量分析方面具有靈敏度高，以及準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性好的特點(diǎn).在中藥有效成分含量測定方面被廣泛應(yīng)用.如桔梗的活性組分之一桔梗多糖具有抗氧化和抗癌活性. 劉春娟等[28]采用苯酚-硫酸染色-UV 檢測法測定了重慶不同產(chǎn)區(qū)桔梗藥材中的多糖含量，發(fā)現(xiàn)桔梗多糖含量在13.06% ～58.70%之間；通過主成分分析法判定質(zhì)量最優(yōu)的桔梗含糖量也最高；且桔?？偠嗵桥c總黃酮和總皂苷的含量之間呈顯著相關(guān)性.

2.2 紅外光譜法

紅外光譜利用化合物中分子官能團(tuán)的紅外吸收頻率來分析樣品. 該分析方法對采樣方法要求靈活，具有快捷、簡單以及低廉的測試成本等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于中藥材的無損快速鑒別和定量分析.王璐[29]用紅外光譜來進(jìn)行中藥飲片金銀花摻偽鑒別.在紅外吸收光譜 3 600 ～ 2 800 cm-1、1 100 ～ 800 cm-1、700 ～ 500 cm-1處3 個(gè)區(qū)間的峰型和個(gè)數(shù)比較，金銀花正品吸收峰個(gè)數(shù)為2 個(gè)、1 個(gè)、2 個(gè)，金銀花偽品吸收峰個(gè)數(shù)為4 個(gè)、7 個(gè)、3 個(gè)，因偽品中含有蔗糖的O-H 伸縮振動峰相對應(yīng)，并存在蔗糖環(huán)骨架振動吸收峰型，還有硫酸根OS-O 的伸縮振動吸收.陳前鋒等[30]人用不同產(chǎn)地中藥黨參樣品的紅外指紋圖譜為依據(jù)，利用共有峰率和變異峰率兩個(gè)指標(biāo)，計(jì)算并建立所測樣品的共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列，同時(shí)結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)譜進(jìn)一步放大分析，來快速鑒別不同產(chǎn)地中藥黨參樣品. 為黨參藥材的質(zhì)量控制提供理論依據(jù). 王磊等[31]學(xué)者利用近紅外高光譜圖像對甘肅、青海、新疆、寧夏和內(nèi)蒙5個(gè)產(chǎn)地的寧夏枸杞進(jìn)行產(chǎn)地鑒別.使用近紅外高光譜圖像，基于 ZCA 白化、PLSDR 和 softmax 分類的模型表現(xiàn)最好，可以有效的鑒別寧夏枸杞產(chǎn)地. 在定量分析方面，王小亮等[32]基于近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合PLS 建立了快速測定燈盞花素注射液含量的方法.可對全國范圍內(nèi)不同生產(chǎn)企業(yè)的燈盞花素注射液進(jìn)行定性和定量.為近紅外光譜分析技術(shù)在中藥注射液定量分析方面的應(yīng)用提供了參考. 不過，《中國藥典》(一部)2020 版目前只有石榴皮用到紅外光譜法法作為定性手段，這方面的工作還有待加強(qiáng).

3 電化學(xué)法在中藥分析檢測中的應(yīng)用

隨著科技的進(jìn)步，越來越多的電化學(xué)分析技術(shù)被應(yīng)用到中藥分析領(lǐng)域，并得到了大家的認(rèn)可. 這類方法是根據(jù)溶液中物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律，對所測組分進(jìn)行定性和定量的一種方法.在中藥定性鑒別、主要成分含量測定、以及微量元素檢測等方面扮演著重要角色.目前主要應(yīng)用于中藥方面的有蛋白質(zhì)等電點(diǎn)法、色譜電化學(xué)法以及光譜電化學(xué)法.

王元媛等[33]對不同產(chǎn)地的多花黃精進(jìn)行電化學(xué)指紋圖譜研究.通過嚴(yán)格控制Belousov-Zhabotinski(BZ)振蕩反應(yīng)條件，得到具有明顯指紋特征的圖譜，從而對來自不同產(chǎn)地的多花黃精進(jìn)行了鑒別.與其他傳統(tǒng)鑒別方法相比，電化學(xué)指紋圖譜不需要對藥材進(jìn)行前處理，操作簡便，快速準(zhǔn)確，得到了顯著效果，并且提高了鑒別效率. Li 等[34]同樣利用電化學(xué)指紋圖譜進(jìn)行了五種石蒜鱗莖，包括中國石蒜、石蒜、金黃色石蒜、換錦花、稻草石蒜的鑒別.值得一提的是，Li 等人對電指紋圖譜進(jìn)行了改進(jìn)，他們將石墨烯嵌入植物組織，從而使得其對電化學(xué)信號表現(xiàn)出極高的靈敏度，從而達(dá)到研究目的. 但此種方法也存在缺陷. 由于受到外界因素和藥材本身的影響，在伏安掃描時(shí)會產(chǎn)生偏差，所以此種方法有待于進(jìn)一步改進(jìn). 電化學(xué)指紋圖譜不單單可以實(shí)現(xiàn)重要的分類，同時(shí)對于同一品種中藥中的有效成分也可以進(jìn)行鑒別. Ge 等[35]采用超聲輔助乙醇回流法提取到木香總黃酮后，對其進(jìn)行電化學(xué)指紋圖譜研究，通過定位二維密度圖的熱區(qū)實(shí)現(xiàn)了識別，效果令人滿意.

中藥不同的成分有不同的特定電化學(xué)活性基團(tuán).因此，針對特定的活性基團(tuán)，可以對其含量測定進(jìn)行電化學(xué)分析研究. 聶純等[36]對盾葉薯蕷中的皂苷組分進(jìn)行測定時(shí)采用了庫侖滴定法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意.此法不需要配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液或者使用基準(zhǔn)物質(zhì)，大大縮減了時(shí)間成本，并且測量結(jié)果更加準(zhǔn)確迅速.張慧芳等[37]通過金屬鎘離子與遠(yuǎn)志皂苷元形成絡(luò)合物，建立了遠(yuǎn)志總皂苷元單掃描極譜法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到預(yù)期.該方法靈敏，經(jīng)濟(jì)成本低，重現(xiàn)性好，值得深入研究.Wu 等[38]利用循環(huán)伏安法對水飛薊賓含量進(jìn)行測定，成果顯著. 相較于其他文獻(xiàn)中的測定方法更為準(zhǔn)確快速，目前已經(jīng)應(yīng)用于其含量測定.

另外，電化學(xué)分析法在測定微量元素方面具有高選擇性，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn).劉雄等[39]采用差分脈沖陽極溶出伏安法測定白茅根、益母草、夏枯草、地丁、公英、金銀花、魚腥草、蘆根八種藥材中銅、鉛、鎘三種微量元素，回收率良好，準(zhǔn)確快速. Li 等[40]采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)，建立了高血壓中藥藥膳中包括錳、鈷、鐵、硒、鎂在內(nèi)的十五種微量元素的元素分析方法，具有較高精密度和回收率，為防治心血管疾病提供了有意義的依據(jù). Shao 等[41]根據(jù)指紋圖譜探討了海洋中藥海螵蛸體內(nèi)所含有的無機(jī)元素，為一些海洋中藥的真?zhèn)舞b別提供了參考.

4 顯微技術(shù)在中藥分析檢測中的應(yīng)用

中藥顯微鑒別是利用顯微鏡對藥材切片、粉末、表面或者磨片制片，直接觀察. 該種方法可以根據(jù)組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等特征進(jìn)行相應(yīng)藥材鑒別. 作為重要四大鑒別手段之一，具有簡便、快速、準(zhǔn)確，應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn).

目前顯微技術(shù)發(fā)展迅速，新興技術(shù)有偏光顯微鏡、掃描電鏡以及顯微攝影與圖像分析. 偏光顯微鏡近年來得到廣泛應(yīng)用，它通過顯微鏡目鏡下方的一個(gè)可拆卸偏振片與正常顯微鏡區(qū)分開來，因?yàn)椴煌再|(zhì)的植物細(xì)胞壁的偏光現(xiàn)象不同從而達(dá)到鑒別的目的.Chen 等[42]利用普通光學(xué)顯微鏡、偏光顯微鏡以及掃描電子顯微鏡對三種典型雪蓮易混淆藥材進(jìn)行了鑒別，方法高效可靠，并且已經(jīng)成功應(yīng)用于三種雪蓮藥材的鑒定當(dāng)中.Xu 等[43]利用普通顯微鏡和偏光顯微鏡對五種ttcm 進(jìn)行鑒別，為石厥明、瓦楞子、葛橋、木里和珍珠母的鑒別提供了有力的證據(jù). 與此同時(shí)，在中藥鑒別方面，其他顯微技術(shù)的應(yīng)用也十分廣泛.Huang 等[44]利用熒光顯微技術(shù)對極易混淆的藥用樹皮橫切面標(biāo)本進(jìn)行了鑒別，在熒光顯微鏡下，各組織的熒光顏色不同，以顏色的不同和熒光強(qiáng)度來進(jìn)行區(qū)分鑒別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意. Yu 等[45]首次將顯微技術(shù)應(yīng)用于不同產(chǎn)地、不同栽培模式下麥冬鑒別，其進(jìn)行了三個(gè)質(zhì)量等級的鑒定，極大擴(kuò)展了顯微技術(shù)的應(yīng)用范圍，同時(shí)為中藥材質(zhì)量等級的評價(jià)提供了一種新的途徑.Kang 等[46]利用桌面掃描電子顯微鏡和立體顯微鏡相結(jié)合，對冬蟲夏草進(jìn)行觀察，與其相同屬進(jìn)行了區(qū)分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意，為蟲草摻假行為提供了鑒別依據(jù).

5 電泳技術(shù)在中藥分析檢測中的應(yīng)用

電泳技術(shù)是在電場的作用下，利用粒子帶電性質(zhì)、大小、形狀等差異，使帶電粒子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而應(yīng)用于中藥的分離、鑒定或提純.由于其具有分離效率高、所需溶劑少、樣本量小、運(yùn)行成本低等特點(diǎn)，并且其可再生、多功能的分離模式，使其成為現(xiàn)代中藥分析中一種強(qiáng)大工具.電泳技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的為毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)，如Zhang 等[47]建立了基于組織蛋白酶B 微反應(yīng)器的毛細(xì)管電泳方法來發(fā)現(xiàn)中藥中的抑制劑，采用固定化酶微反應(yīng)器(IMER)與毛細(xì)管電泳相結(jié)合快速篩選組織蛋白酶B 抑制劑，該方法對17 個(gè)中藥標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行抑菌活性測定，其中山奈酚、吳茱萸次堿、吳茱萸二胺、茶堿、石蒜堿等5 種天然產(chǎn)物對組織蛋白酶B 有潛在的抑制作用.Yang 等[48]首次報(bào)道了一種毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光法(CE-CL)同時(shí)從中藥枸杞、雙黃連口服液、蒲公英顆粒中中測定綠原酸、阿魏酸、香草酸和咖啡酸四種酚酸，結(jié)果表明，該方法對四種酚酸都呈良好的線性關(guān)系，回收率高，具有較高的靈敏度和可靠性，該方法可以成功的用于真實(shí)中藥樣品分析之中.

此外，隨著電泳技術(shù)的更新，電泳新技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中也占據(jù)重要地位，尤其是在中藥DNA 分子鑒定中的應(yīng)用發(fā)展十分迅速. 如Zheng 等[49]應(yīng)用第三代測序和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)兩項(xiàng)新技術(shù)來對中藥當(dāng)歸補(bǔ)血方進(jìn)行鑒定和質(zhì)量評價(jià)，建立了當(dāng)歸補(bǔ)血方的質(zhì)量綜合體系，為加強(qiáng)中藥整體質(zhì)量控制提供了新的見解.Perera 等[50]建立了一種十二烷基聚丙烯酰胺鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)方法檢測了13 種植物甲醇提取物中的蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物，其中包括了9 種抗糖尿病植物和3 種香料，結(jié)果成功檢測到了溶菌酶的二聚體、三聚體和四具體等高分子量蛋白產(chǎn)物.Zhang 等[51]開發(fā)了一種新的電泳方法，在單一的電泳系統(tǒng)中同時(shí)篩選多種生物活性化合物，最終，將所建立的方法應(yīng)用于枸杞提取物中篩選潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)枸杞樣品中蘆丁、杉杉素、槲皮素和綠原酸的峰面積在酶促反應(yīng)前后發(fā)生了變化，證實(shí)了這4 種化合物具有潛在的抑制活性.該研究為從植物提取物或混合物中快速發(fā)現(xiàn)具有生物活性的化合物提供了一種有前景的方法.

6 X 射線法、核磁共振法、質(zhì)譜法、拉曼光譜法在中藥分析檢測中的應(yīng)用

6.1 X 射線衍射法

X 射線衍射法是一種研究物質(zhì)的物相和晶體結(jié)構(gòu)的分析方法.其原理是當(dāng)X 射線通過晶體時(shí)產(chǎn)生衍射效應(yīng)，在空間形成一幅由不同晶面產(chǎn)生的衍射線構(gòu)成的圖譜，圖譜可反映物質(zhì)的組成、晶體類型等特有信息[52].不同中藥材所含有效成分不同，故衍射圖譜也各有特征，因此能夠達(dá)到鑒別鑒定的目的. X 衍射技術(shù)分為單晶 X 射線衍射和粉末 X 射線衍射(XRD)，目前XRD 已廣泛的應(yīng)用于中藥的鑒別.

楊德忠[53]等對中藥巴戟天的不同部位進(jìn)行XRD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴戟天肉和木芯的X 射線衍射圖譜的幾何拓?fù)涮卣饔幸欢ǖ南嗨菩?，這說明了二者歸屬的一致，但因所在部位的不同，故又呈現(xiàn)出較大的差異性.XRD 技術(shù)可以利用這種差異，對巴戟天不同部位的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別. 喬藝涵等[54]采用X 射線衍射技術(shù)對21 批不同產(chǎn)地珍珠層粉進(jìn)行分析，結(jié)果有18批樣品的衍射圖譜幾何拓?fù)涮卣骰疽恢? 用這21批珍珠層粉的衍射圖譜建立了指紋圖譜，經(jīng)過尋峰處理得到共有峰，用數(shù)學(xué)方法計(jì)算相似度.結(jié)果表明，不同樣品X 射線衍射圖譜具有較高的相似度，而劣質(zhì)珍珠層粉的X 射線衍射圖譜與正品存在顯著差別.楊丹等[55]用XRD 技術(shù)建立朱砂藥材及飲片的指紋圖譜，并比較朱砂炮制前后指紋圖譜的變化.結(jié)果顯示不同產(chǎn)地和批次的朱砂藥材及飲片的X 射線衍射圖譜峰均無明顯差異，且指紋圖譜相似度較好. 該研究為朱砂藥材及飲片的分析和質(zhì)量評價(jià)提供了一定的科學(xué)依據(jù).路大勇[56]等人采用粉末X 射線衍射技術(shù)，運(yùn)用有機(jī)分子晶體的XRD 譜模擬法，鑒別藏草和廉價(jià)蟲草中XRD 峰的成分來源. 其研究方法能夠作為冬蟲夏草真?zhèn)舞b別的一種快速、準(zhǔn)確、有效的工具，在有機(jī)分子晶體含量較高的中藥材鑒定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究上具有廣闊的應(yīng)用前景.

由上可知，粉末X 射線衍射是一種廣泛使用的定性分析方法，但由于未能很好解決內(nèi)標(biāo)物和定量峰選擇等相關(guān)的技術(shù)問題，粉末XRD 很少用于定量分析.不過近年來也有用于定量分析的研究，如Zhang[57]引入質(zhì)量吸收系數(shù)這一概念，采用全譜擬合定量計(jì)算的方法，解決了上述存在的技術(shù)問題，研究結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度、精密度和特異性較好，適用于消咳寧片劑中石膏的測定，該方法的建立也為中成藥中結(jié)晶成分的定量測定提供了一定的參考.

6.2 核磁共振法

核磁共振是根據(jù)處在某個(gè)靜磁場中的物質(zhì)原子核系統(tǒng)，當(dāng)受到相應(yīng)頻率的電磁波作用時(shí)，在它們的磁能級間產(chǎn)生共振躍遷的原理而采取的一種新技術(shù).核磁共振作為一種重要的分析手段，目前在中藥分析里具有廣闊的應(yīng)用前景，主要應(yīng)用于中藥結(jié)構(gòu)及組成的定性分析，同時(shí)還可用于定量分析. 中藥品種多種多樣，即使是同一歸屬，也存在多種分支.不同種類的中藥其化學(xué)成分大相徑庭，故可以用核磁共振技術(shù)來區(qū)別和鑒定中藥的品種和有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu).如李濤等[58]采用高分辨核磁共振指紋圖譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)識別模式建立了有效鑒別四裂紅景天和大花紅景天的方法，為紅景天屬藥用植物的品種鑒別和品質(zhì)評價(jià)奠定了基礎(chǔ)；Li，AP 等[59]以蔗糖/葡萄糖比值作為區(qū)分野生和栽培黃芪的簡單指標(biāo)，利用核磁共振的非靶向表型分析方法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，區(qū)分了不同栽培類型或生長年限的黃芪.

尹田鵬等[60]從中藥劍川烏頭的的根中分離得到兩個(gè)C19-二萜生物堿，采用1D 和2D 核磁共振技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，完善歸屬了這兩個(gè)化合物的的1H 和13C 的NMR 信號，為結(jié)構(gòu)的鑒定提供了一定的依據(jù)；方偉等[61]運(yùn)用多種色譜分離技術(shù)，結(jié)合核磁共振技術(shù)鑒定了從藏柴胡中提取出來的12 種三萜皂苷成分，結(jié)果表明均屬于齊墩果烷型的三萜皂苷類化合物；李佩[62]等人采用HPLC-NMR 技術(shù)對山黃連的有效成分進(jìn)行分離和鑒定，用傳統(tǒng)的柱層析法進(jìn)行分離，半制備反向HPLC 法進(jìn)行純化，用核磁和質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)的鑒定，最終分離鑒定出13 種化合物.

核磁共振技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥成分結(jié)構(gòu)的鑒定，隨著技術(shù)的發(fā)展，儀器各項(xiàng)性能得到優(yōu)化改善，為定量的分析奠定了基礎(chǔ)，目前通常用氫核磁共振定量法測定含量.通過建立含量測定條件，選擇合適的內(nèi)標(biāo)物和定量峰，方法學(xué)驗(yàn)證準(zhǔn)確后進(jìn)行含量的測定. 如李雪嬌等[63]將徐長卿中的活性成分丹皮酚進(jìn)行提取，用氘代甲醇作溶劑，H-6(δ7.78)用作定量分析特征信號，均苯三甲酸作為內(nèi)標(biāo)物，建立核磁共振氫譜分析的方法.該定量核磁共振氫譜法快速、準(zhǔn)確，因此可以作為代替HPLC 定量檢測徐長卿中有效成分的分析方法.

6.3 質(zhì)譜法

質(zhì)譜主要用于各種有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)分析，它提供了有機(jī)化合物最直觀的特征信息，即分子量及官能團(tuán)碎片結(jié)構(gòu)信息. 質(zhì)譜分析雖然起步較晚，但因與分離型儀器聯(lián)用的成功，使之成為復(fù)雜混合物成分分析的最有效工具. 電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)可用于中藥中無機(jī)(尤其是有毒重金屬)元素的測定，目前《中國藥典》(一部)2020 版中有32 個(gè)品種用到該方法作為檢查手段. 中藥組分多種多樣，含量也千差萬別，用其它方法分析耗時(shí)耗力，有時(shí)根本不可能進(jìn)行，而用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法則可以在較短時(shí)間內(nèi)對這些復(fù)雜成分進(jìn)行定性和定量的分析. 如李欣等[64]用超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定中藥瓜蔞的化學(xué)成分.通過建立瓜蔞化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫和一級質(zhì)譜獲得的離子數(shù)量以及色譜峰分離情況為指標(biāo)，初步鑒定出可能含有的化合物，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行靶向二級質(zhì)譜分析檢測，最終鑒定了91 個(gè)化學(xué)成分，為瓜蔞藥效基礎(chǔ)物質(zhì)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供一定的依據(jù). 梁軍等[65]用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜建立了定量測定類葉牡丹三萜皂苷的方法，并且定量檢測出9 個(gè)三萜皂苷化合物，為類葉牡丹的質(zhì)量評價(jià)及加工提供了科學(xué)依據(jù). 羅益遠(yuǎn)等[66]用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定首烏藤中13 種成分.為解決多元成分含量不一，難以直觀評價(jià)的問題，用Topsis 分析方法進(jìn)行綜合分析評價(jià)，根據(jù)結(jié)果優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，成功測定出13 種成分的含量.

6.4 拉曼光譜法

拉曼光譜分析法是利用激光來照射被檢物質(zhì)時(shí)發(fā)生散射現(xiàn)象而產(chǎn)生與入射光頻率不同的散射光譜所進(jìn)行的分析方法.拉曼光譜可以表征出物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的構(gòu)成及變化規(guī)律，因此可應(yīng)用于中藥的分析研究，比如藥材的成分分析、類別鑒別和質(zhì)量監(jiān)控[67].如史芳芳等[68]用拉曼光譜儀采集5 組麥冬樣品不同部位的拉曼光譜圖，結(jié)果顯示不同部位的拉曼光譜大體上相似，由于麥冬中間肥大，兩端尖的結(jié)構(gòu)特征致使相對峰強(qiáng)存在略微差異.根據(jù)拉曼光譜法成功分析出麥冬中含有的多糖類、烯類、蛋白質(zhì)類、酯類、氨基酸類、酰胺類和皂苷類化合物. 明晶等[69]采集了20批朱砂、輕粉、雄黃、信石、密陀僧、鉛丹和硫黃等7 種毒性礦物藥樣品的拉曼光譜圖.分析各類藥材拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，不同種藥材特征峰對比鮮明，而同種藥材譜圖一致性較好. 彭艷等[70]建立了拉曼光譜內(nèi)標(biāo)法快速測定煅石膏中無水硫酸鈣的含量的方法，以硝酸鈉為定量分析內(nèi)標(biāo)，6 批次煅石膏中無水硫酸鈣含量測定結(jié)果與EDTA-2Na 滴定法測定結(jié)果經(jīng)t 檢驗(yàn)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明建立的內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確度高，可用于礦物藥煅石膏的質(zhì)量評價(jià).又如青蒿素的光譜特征將為中藥復(fù)方中青蒿素的鑒定和分析提供標(biāo)準(zhǔn)的拉曼光譜.Li 等[71]證實(shí)了激光拉曼光譜為一種青蒿素定性分析的無損技術(shù)，該研究為激光拉曼光譜法定量測定青蒿素含量提供了一種基礎(chǔ)的分析方法，在中藥復(fù)方中具有較高的實(shí)用價(jià)值.

另外，原子吸收分光光度法也較多地應(yīng)用于中藥中重金屬及有害元素的分析檢測，目前《中國藥典》(一部)2020 版中已有28 個(gè)藥材、8 個(gè)制劑品種用到該方法作為控制手段，隨著將來藥材種植和制劑生產(chǎn)的水平提高，將會有更多應(yīng)用.

7 結(jié)語

隨著現(xiàn)代分析檢驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展，中藥的分析檢測方法已從簡單的分離分析方法發(fā)展到具有高分辨率、高精密度、高準(zhǔn)確度、高穩(wěn)定性的多種分析方法.特別是自動化聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，讓中藥的分析效率顯著提高.現(xiàn)代中藥分析檢測方法不僅能夠在中藥鑒定、鑒別中發(fā)揮重要作用，而且在體內(nèi)代謝分析、藥理毒理機(jī)制、定量分析等方面更是表現(xiàn)出很大優(yōu)勢，為保證臨床治療的安全高效提供科學(xué)依據(jù).但該領(lǐng)域仍然還存在許多問題，比如配伍協(xié)同分析方法還需要進(jìn)一步研究；復(fù)雜成分的分析還需要較多的采用聯(lián)用方法，成本較高；還應(yīng)多采用多源數(shù)據(jù)融合技術(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行全面表征；在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的分析技術(shù)還有待開發(fā)等. 總之，現(xiàn)代分析檢測技術(shù)在中藥研發(fā)與生產(chǎn)中的高效應(yīng)用，將極大地推動中藥現(xiàn)代化和國際化.