miR-128、ZEB1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其靶向關(guān)系驗(yàn)證

李品，蔡智慧，李晶晶，王琰，陳靜，杜曉欣，王蘭，閆麗偉

1 河北大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，河北 保定 071000；2 河北大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科

子宮內(nèi)膜癌（EC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，約占女性癌癥的4.8%，并且發(fā)病率和病死率均有上升趨勢(shì)［1］。侵襲或轉(zhuǎn)移是EC惡性發(fā)展的主要原因之一，盡管早期階段的EC患者的5年生存率可高達(dá)82%，但對(duì)于復(fù)發(fā)或晚期EC患者，5年生存率仍低于30%［2］。對(duì)于晚期EC患者采用手術(shù)切除、化療和放療等傳統(tǒng)治療策略效果較差，并且化療和放療通常會(huì)對(duì)健康組織和器官造成有害影響［3］。因此，了解EC內(nèi)在的分子機(jī)制對(duì)于尋找新的靶向治療方法、改善EC患者的治療效果和預(yù)后具有重要意義。

miRNA是一類小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與人類疾病發(fā)展的一系列生物學(xué)過程，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。miR-128是近年發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，其在人類多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性表型密切相關(guān)［5］。目前有關(guān)miR-128在EC中的研究甚少，并且其對(duì)EC細(xì)胞遷移和侵襲的影響尚不清楚。鋅指E盒結(jié)合同源框1（ZEB1）是近年來研究較多的與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，ZEB1在EC中表達(dá)異常升高，并且沉默ZEB1能夠顯著降低EC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力［8-9］。目前研究［10-11］發(fā)現(xiàn)，miR-128能夠調(diào)控ZEB1參與機(jī)體細(xì)胞重要的生命活動(dòng)，但miR-128是否通過調(diào)控ZEB1影響EC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。2021年8月—2022年4月，本研究觀察了EC細(xì)胞系中miR-128和ZEB1的表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討了miR-128對(duì)Ishikawa細(xì)胞的遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響以及其與ZEB1的靶向調(diào)控關(guān)系，探討miR-128與ZEB1在EC侵襲轉(zhuǎn)移中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑、儀器人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞hEEC及人EC細(xì)胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，均置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，應(yīng)用0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；miRNA抽取試劑、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒ZEB1-WT和ZEB1-MUT、miR-128模擬物（miR-128 mimics）、miRNA陰性對(duì)照（miRNA-NC）及PCR引物均購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1及GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PCR儀、光學(xué)顯微鏡、電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海力新儀器有限公司。

1.2 HEC-1A、Ishikawa、KLE及hEEC中miR-128的檢測(cè)采用qRT-PCR法。應(yīng)用miRNA抽取試劑提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，以cDNA為模板，加入PCR引物，按照qRTPCR試劑盒說明書操作配制PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃、2 min；95℃、15 s，60℃、15 s共40個(gè)循環(huán)。miR-128上游序列：5′-CGCCGATATTGGTCGGATGAT-3′，下游序列：5′-TTC AGCGTACACCTAATCGGTATG-3′；U6上游序列：5′-CCGTCGTAGGCAGCCTCTACGCT-3′，下游序列：5′-GCATCCAACGTACGCTCATCGT-3′。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-128基因相對(duì)表達(dá)量。由于miR-128在Ishikawa細(xì)胞系中的表達(dá)水平最低，因此本研究選擇Ishikawa細(xì)胞系作為后續(xù)過表達(dá)miR-128轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系，這樣過表達(dá)miR-128效果更加明顯。

1.3 細(xì)胞分組及miR-128轉(zhuǎn)染將Ishikawa細(xì)胞分為miR-128過表達(dá)組和陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染操作時(shí)，取對(duì)數(shù)增殖期的Ishikawa細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞板，按照Lipofectamine2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分別轉(zhuǎn)染miR-128 mimics和miRNA-NC至Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)置入37℃、5% CO2的恒溫環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Ishikawa細(xì)胞侵襲能力的觀察采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。首先取出Mgtrigel膠與無血清培養(yǎng)基混合，均勻鋪于Transwell小室上室底膜上室面。取轉(zhuǎn)染后48 h各組Ishikawa細(xì)胞，無血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL。取200 μL細(xì)胞懸液接種至小室上室，下室注入500 μL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，將小室于37℃、5% CO2的恒溫條件下，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，輕輕拭去小室上室面未穿膜的細(xì)胞，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，高倍光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)的視野計(jì)數(shù)拍照并計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.5 Ishikawa細(xì)胞遷移能力的觀察采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。①細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染后48 h各組Ishikawa細(xì)胞，制備細(xì)胞密度1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，均勻接種于6孔細(xì)胞板各孔中，充分混勻，置入37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度至100%時(shí)，應(yīng)用20 μL移液槍頭垂直6孔板底部劃出一字劃痕，PBS沖洗后，加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0和48 h時(shí)刻用光學(xué)顯微鏡拍照，Image J軟件計(jì)算劃痕愈合率。②Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)不對(duì)小室底膜上室面進(jìn)行Mgtrigel膠預(yù)鋪，余實(shí)驗(yàn)步驟同Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.6 Ishikawa細(xì) 胞 中E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、ZEB1蛋白的檢測(cè)采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，應(yīng)用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每泳道取同等量總蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，洗膜后，將PVDF膜置于5 %的脫脂牛奶封2 h，洗滌后將PVDF膜置入一抗E-cadherin（1∶1 000）、Fibronectin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、ZEB1（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）溶液中4℃孵育過夜，次日置于二抗溶液中孵育1 h，ECL顯影，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.7 miR-128靶向結(jié)合ZEB1 3′UTR區(qū)的驗(yàn)證采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。取對(duì)數(shù)增殖期的Ishikawa細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞板中，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，分別將野生型ZEB1熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒ZEB1-WT、突變型ZEB1熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒ZEB1-MUT與miR-128 mimics或miRNA-NC共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞，分別為miR-128 mimics+ZEB1-WT組、miRNA-NC+ZEB1-WT組、miR-128 mimics+ZEB1-MUT組、miRNA-NC+ZEB1-MUT組。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布檢驗(yàn)采用Shapiro-wilk法檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EC細(xì)胞系及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系hEEC中miR-128、ZEB1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較EC細(xì)胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE及 子 宮 內(nèi) 膜 上 皮 細(xì) 胞系hEEC中miR-128的相對(duì)表達(dá)量分別為0.43±0.12、0.28±0.09、0.48±0.11、1.02±0.04。與hEEC相比，HEC-1A、Ishikawa、KLE細(xì)胞中miR-128的相對(duì)表達(dá)量均降低（t=8.08、13.01、7.99，P均＜0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，EC細(xì)胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE及 子 宮 內(nèi) 膜 上 皮 細(xì) 胞系hEEC中ZEB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.91±0.14、1.14±0.18、1.06±0.19、0.21±0.11。與hEEC相比，HEC-1A、Ishikawa、KLE細(xì)胞中ZEB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均升高（t分別為6.81、7.64、6.71，P均＜0.05）。

2.2 過表達(dá)miR-128對(duì)Ishikawa細(xì)胞遷移、侵襲的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組和miR-128過表達(dá)組Ishikawa中miR-128相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.04、3.41±0.23。兩組比較，t=18.03，P＜0.05，提示轉(zhuǎn)染效率較高。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陰性對(duì)照組和miR-128過表達(dá)組Ishikawa細(xì)胞劃痕愈合率分別為（65.5±7.3）%、（25.2±4.1）%，兩組比較，t=8.34，P＜0.05。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陰性對(duì)照組和miR-128過表達(dá)組Ishikawa細(xì)胞遷移穿膜數(shù)量分別為（421±44）、（172±31）個(gè)，兩組比較，t=8.01，P＜0.05。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陰性對(duì)照組和miR-128過表達(dá)組Ishikawa細(xì)胞侵襲穿膜數(shù)量分別為（414±49）、（229±40）個(gè)，兩組比較，t=5.07，P＜0.05。

2.3 過表達(dá)miR-128對(duì)Ishikawa細(xì)胞E-cadherin、Fibronectin、Vimentin、ZEB1蛋白表達(dá)的影響miR-128過表達(dá)組Ishikawa細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組（t=5.55，P＜0.05），Vimen-tin、Fibronectin、ZEB1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照 組（t分別為5.38、5.32、12.55，P＜0.05）。見表1。

表1 兩組細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及ZEB1的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別miR-128過表達(dá)組陰性對(duì)照組E-cadherin 1.12±0.16*0.46±0.13 Fibronectin 0.56±0.14*1.26±0.18 Vimentin 0.43±0.10*0.99±0.15 ZEB1 0.19±0.07*0.96±0.08

2.4 miR-128與ZEB1的靶向關(guān)系雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-128 mimics+ZEB1-WT組、miRNA-NC+ZEB1-WT組、miR-128 mimics+ZEB1-MUT組、miRNA-NC+ZEB1-MUT組Ishikawa細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性分別為0.40±0.11、0.98±0.06、0.97±0.04、1.03±0.06。與miRNANC+ZEB1-WT組相比，miR-128 mimics+ZEB1-WT組Ishikawa細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低（t=8.02，P＜0.05）；而與miRNA-NC+ZEB1-MUT組相 比，miR-128 mimics+ZEB1-MUT組Ishikawa細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無明顯變化（t=1.44，P＞0.05）。

3 討論

EC是女性癌癥患者死亡的重要原因。近年來，EC的發(fā)病率和病死率一直居高不下，晚期EC患者通常有較高的復(fù)發(fā)率和不良預(yù)后，治療效果不能令人滿意［12-13］。至今EC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，因此探索EC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷和治療EC的靶向基因具有重要意義。

近年研究［14］發(fā)現(xiàn)，miRNA可以通過對(duì)下游關(guān)鍵基因mRNA翻譯的抑制或者降低mRNA的穩(wěn)定性從而影響下游分子通路的活性，起著重要的調(diào)控作用。將miRNA作為腫瘤分子治療的靶點(diǎn)，恢復(fù)細(xì)胞的正常分子表型，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)問題。SHIGETA等［15］發(fā)現(xiàn)，miR-152低表達(dá)與EC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，過表達(dá)miR-152能夠抑制EC細(xì)胞的增殖及侵 襲 遷 移。miR-29a-3p［16］、miR-543［17］、miR-379-5p［18］等miRNA也被相繼證實(shí)作為EC的抑制因子發(fā)揮作用。目前EC細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)的miRNA，這表明它們可能在EC發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［19］。但至今尚未發(fā)現(xiàn)在EC發(fā)生發(fā)展中起著最關(guān)鍵作用的miRNA。miR-128是一種在腦神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)的miRNA，既往研究主要集中在其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系，近期研究發(fā)現(xiàn)其與惡性腫瘤細(xì)胞的分子表型也密切相關(guān)［5］。在結(jié)直腸癌［19］、骨腫瘤［20］、口腔鱗癌［21］等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)miR-128作為抑癌因子發(fā)揮作用。本研究通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)EC細(xì)胞系HEC-1A、Ishikawa、KLE中miR-128表達(dá)均明顯降低，提示miR-128在EC發(fā)生發(fā)展中可能也起著抑癌因子的作用。由于miR-128在Ishikawa細(xì)胞系中的表達(dá)水平最低，因此本研究選擇Ishikawa細(xì)胞系作為后續(xù)過表達(dá)miR-128轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系。進(jìn)一步本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染miR-128模擬物至Ishikawa細(xì)胞過表達(dá)miR-128，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-128的Ishikawa細(xì)胞劃痕愈合率、遷移和侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)目均明顯下降，提示過表達(dá)miR-128能夠明顯抑制EC細(xì)胞的遷移及侵襲能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞表型由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換的生物學(xué)過程，腫瘤細(xì)胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，失去黏附能力和緊密連接從而獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力，因此上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-128的EC細(xì)胞中間質(zhì)源性標(biāo)志物Fibronectin、Vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯降低，而上皮源性標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，提示過表達(dá)miR-128能夠明顯抑制EC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

ZEB1是ZEB同源盒轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一，其定位于人第10號(hào)染色體上，在胚胎發(fā)育中起著重要調(diào)節(jié)作用。近年研究［6］發(fā)現(xiàn)，ZEB1在惡性腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中也發(fā)揮著調(diào)控作用，其表達(dá)異常與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。FENG等［22］在研究中發(fā)現(xiàn)，ZEB1在EC組織中表達(dá)升高，并且與腫瘤分級(jí)、肌層浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。XIAO等［8］研究證實(shí)，ZEB1能夠調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響EC細(xì)胞的侵襲遷移能力。近期研究［10］發(fā)現(xiàn)miR-128能夠調(diào)控ZEB1參與食管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。miR-128還能夠靶向ZEB1調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的化療敏感性和侵襲性［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-128的EC細(xì)胞中ZEB1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，并且雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示miR-128能夠與ZEB1的3′UTR區(qū)靶向結(jié)合。以上提示miR-128影響EC細(xì)胞的遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性表型，可能是通過靶向調(diào)控ZEB1實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-128可以抑制Ishikawa細(xì)胞的遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，ZEB1可促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，miR-128與ZEB1具有靶向調(diào)控關(guān)系。但由于條件限制，本研究沒有對(duì)miR-128與ZEB1在EC組織中的表達(dá)及臨床病理特征關(guān)系進(jìn)行研究，有待將來的實(shí)驗(yàn)中在組織學(xué)層面對(duì)miR-128、ZEB1在EC發(fā)生進(jìn)展中的作用進(jìn)行深入探討。