基于生物素連接酶的鄰近標(biāo)記技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的研究進(jìn)展

張雨欣，丁 明，柳 軍**

（1中國藥科大學(xué)新藥篩選中心，南京 210009；2中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009）

蛋白質(zhì)是生命體中真正發(fā)揮作用的物質(zhì)，大多數(shù)蛋白質(zhì)不能單獨(dú)發(fā)揮作用，它們與其他蛋白質(zhì)的相互作用決定了細(xì)胞的功能。因此，詳細(xì)了解蛋白質(zhì)間相互作用（PPI）是破譯細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控途徑的關(guān)鍵。在用傳統(tǒng)的親和純化方法分離純化蛋白復(fù)合物時(shí)，會(huì)導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)間的相互作用被破壞。同時(shí)，傳統(tǒng)方法會(huì)破壞細(xì)胞器的完整性，很難評估所得的純化產(chǎn)物是否保持了其在體內(nèi)的原始結(jié)構(gòu)［1］。近年來不斷發(fā)展的蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)極大地補(bǔ)充了尋找蛋白互作的方法。本文將介紹近期出現(xiàn)的基于生物素連接酶BirA 開發(fā)的蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 鄰近標(biāo)記技術(shù)

鄰近標(biāo)記技術(shù)是通過在需要研究的“誘餌”蛋白上融合一個(gè)能夠非特異性標(biāo)記周圍蛋白質(zhì)的酶，被打上標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以形象的稱為“獵物”蛋白。目前基于鄰近標(biāo)記酶的蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)有了快速的發(fā)展，有依賴生物素連接酶（BirA）建立的生物素連接酶突變體的非序列依賴標(biāo)記技術(shù)（proximity-dependent biotin identification，BioID），在存在生物素的條件下BirA 可以將鄰近蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上帶上生物素標(biāo)簽；依賴工程化抗壞血酸過氧化物酶（APEX）建立的生物素標(biāo)記，APEX 在過氧化氫的存在下可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速的生物素化，有利于研究空間和時(shí)間上的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。依賴于PUP 連接酶PafA 的鄰近標(biāo)記技術(shù)PUP-IT［2］，通過元基因組數(shù)據(jù)定點(diǎn)突變BirA 來制造的新鄰近標(biāo)記酶——AirID［3］，研究RNA 與蛋白相互作用的RaPID［4］，以及將CRISPR和PUP-IT 相結(jié)合的CRUIS［5］蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)等。這些方法所要求的pull-down 條件沒有傳統(tǒng)方法所需的條件苛刻，在分析蛋白質(zhì)復(fù)合物時(shí)也不需要其保持結(jié)合的狀態(tài)，能夠耐受更激烈的裂解條件，可以在正常生理狀態(tài)下對細(xì)胞中蛋白進(jìn)行標(biāo)記，且不會(huì)在裂解和親和純化的步驟中將相互作用的蛋白錯(cuò)配，減少了假陽性的結(jié)果［6］。自其報(bào)道以來已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞［7-8］、植物［9-10］、寄生蟲［11-12］、黏菌［13］、小鼠［14］、酵母［15］、斑馬魚［16］、果蠅和蠕蟲［17］等中成功應(yīng)用。

2 鄰近標(biāo)記技術(shù)的分類

2. 1 BioID

BioID 是一種在真核細(xì)胞中近距離依賴標(biāo)記的蛋白質(zhì)的技術(shù)。該方法可以將物理空間上靠近誘餌蛋白附近的蛋白標(biāo)記上生物素，以作為蛋白質(zhì)相互作用的證據(jù)，生物素化蛋白可通過鏈酶親和素俘獲分離并通過質(zhì)譜鑒定。該技術(shù)的核心功能組件是生物素連接酶，在大腸桿菌中，生物素連接酶BirA（231 AA）識(shí)別的底物具有特異性，僅能生物素化一段特定的氨基酸序列。如果將BirA 的118 位進(jìn)行突變（R118G，表示為BirA*，也被稱作BioID1［18］），會(huì)極大降低其識(shí)別底物的特異性，使其作用的蛋白不需要帶有特定的氨基酸序列也能被生物素化［7］。能夠高活性低特異性的生物素化誘餌蛋白的相互作用蛋白，當(dāng)生物素連接酶被活化時(shí)可以破壞活性生物素分子（生物素酰-5-AMP），使其與連接酶分離，并能與鄰近蛋白中暴露的賴氨酸殘基上的游離伯胺發(fā)生反應(yīng)，從而將生物素共價(jià)結(jié)合在底物蛋白的賴氨酸殘基上，生物素化在細(xì)胞內(nèi)是一個(gè)很罕見的修飾，所以通過生物素特異性親和純化分離生物素化蛋白，再通過LCMS/MS分析就可以鑒定候選蛋白［6］。

2. 2 Split-BioID

Split-BioID 是一種基于BirA*酶的蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析方法，可以從空間和時(shí)間上分析蛋白質(zhì)復(fù)合體［19］。Split-BioID 通過將BirA*分為兩個(gè)片段，分別連接到兩個(gè)相互作用的蛋白上，在兩個(gè)相互作用的蛋白融合在一起時(shí)，BirA*可以重新組裝恢復(fù)活性。在運(yùn)用該方法時(shí)，可以通過實(shí)驗(yàn)選擇合適的分裂位點(diǎn)，常用的方法有將分裂后的BirA*分別與FKBP12-rapamycin 復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)（FKBP12-rapamycin binding，F(xiàn)RB）和FK506結(jié)合蛋白（FKBP）融合，在加入雷帕霉素后，F(xiàn)RB 可以和FKBP 相互作用，使BirA*的兩個(gè)片段重新連接，以此可以驗(yàn)證其生物素化活性的恢復(fù)情況［19-20］。BioID 在體內(nèi)可以給10 nm 范圍內(nèi)感興趣的蛋白標(biāo)記上生物素，無論其是否產(chǎn)生了相互作用［21］。而Split-BioID 只有在兩種蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，才會(huì)在天然細(xì)胞環(huán)境中被激活，能夠在單一和簡單的分析中無偏見地檢測一對相互作用的蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物，因此該方法在PPI分析方法中是獨(dú)一無二的［19］。De Munter［20］等運(yùn)用該方法將BirA*分為兩個(gè)無活性的部分，分別融合到蛋白質(zhì)磷酸酶PP1的催化和調(diào)節(jié)亞基上，用于篩選PP1全酶的底物和其他蛋白相互作用物。

2. 3 Contact-ID

Contact-ID 也是split-BioID 的一種，將BirA*分為N-G78（B1）和G79-C（B2）兩個(gè)片段，并將這兩個(gè)片段分別與位于ER 膜（ERM）的SEC61B 氮端（B1-SEC61B）和位于線粒體膜的外膜（OMM）的TOM20碳端（TOM20-B2）融合［22］，生物素化活性依賴于線粒體相關(guān)膜（MAM）的形成，用于研究線粒體膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的接觸位點(diǎn)的蛋白質(zhì)組。只有當(dāng)它們在膜接觸位點(diǎn)物理地相互作用和重組時(shí)才能恢復(fù)生物素化能力。在原位標(biāo)記兩個(gè)細(xì)胞膜接觸點(diǎn)的蛋白質(zhì)組時(shí)，必須滿足以下兩個(gè)條件：（1）Split-BioID系統(tǒng)的生物素化活性僅在兩片段鄰近后恢復(fù)，并可以通過鄰近可控的生物系統(tǒng)驗(yàn)證，例如雷帕霉素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩個(gè)分裂片段之間的內(nèi)在親和力應(yīng)忽略不計(jì)，以避免人為的MAM 形成和隨后的假陽性鑒定［22］。該方法專門對定位在MAM 上的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化，并通過質(zhì)譜鑒定生物素化的位點(diǎn)，從而明確揭示了活細(xì)胞中的MAM蛋白質(zhì)組。

2. 4 BioID2

BioID2（231 AA）是來源于A．a(chǎn)eolicus的生物素連接酶R40G突變體，自然缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生物素連接酶，比BioID 小約三分之一，體積的減小增強(qiáng)了與其融合的蛋白的靶向性和定位性［7，23］。與BioID 相比，BioID2 誘導(dǎo)生物素化所需要的生物素濃度更低，所需要的時(shí)間更短，這一特性有利于其在難以補(bǔ)充生物素的體系中運(yùn)用，且BioID2 的最適反應(yīng)溫度約50 ℃（BioID 最適溫度約37 ℃），適用于嗜熱菌的標(biāo)記，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)顯著大于BioID2 的標(biāo)記半徑或當(dāng)融合蛋白是較大的蛋白質(zhì)復(fù)合物時(shí)，可以通過增加柔性連接鏈擴(kuò)大其標(biāo)記范圍［6］。目前也有將BioID2 運(yùn)用在體內(nèi)的研究，F(xiàn)eng 等［14］通過CRISPR-Cas9 將BioID2 敲入小鼠連接蛋白-2（JPH2）用于識(shí)別體內(nèi)心臟二聯(lián)體蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了JPH2 的多個(gè)突變與人類心肌病的相關(guān)性。

2. 5 2C-BioID

所有的標(biāo)記蛋白與靶蛋白融合都需要考慮一個(gè)問題，即融合蛋白是否會(huì)影響靶蛋白的功能與定位。BioID1 的大小為35 kD，有研究表明BioID1的存在可能會(huì)限制內(nèi)核膜（INM）蛋白通過核孔復(fù)合物（NPC），從而干擾它們的正確靶向，在INM 蛋白的核質(zhì)結(jié)構(gòu)域延伸超過60 ~ 70 kD 時(shí)，它們進(jìn)入細(xì)胞核的過程就會(huì)受到阻礙［24］。即使是天然缺失DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的BioID2 的大小也達(dá)到了26. 6 kD，對于許多INM 蛋白來說，BioID2 仍然會(huì)影響其在內(nèi)核膜的分選和定位［18］。

為了解決這個(gè)問題，Chojnowski 等［18，25］開發(fā)了新的方法——雙組分BioID（2C-BioID），該方法將生物素連接酶與靶蛋白分別表達(dá)，但在生物素連接酶上融合了FKBP，在靶蛋白上融合了FRB，在加入無生物活性的雷帕霉素模擬物AP21967 后，AP21967 可以利用FKBP-FRB 二聚系統(tǒng)將FKBP：FRB 低聚化，以達(dá)到將生物素連接酶與內(nèi)核膜蛋白連接且不影響其定位的效果。以INM 蛋白層相關(guān)多肽2β（LAP2β）為例，LAP2β 的核質(zhì)結(jié)構(gòu)域的大小約46 kD，由于大小的限制，將BioID1 或BioID2 連接到LAP2βN 末端可能會(huì)限制融合蛋白進(jìn)入INM。 將FKBP 與BioID2 融合，將FRB 與LAP2b 的N 端融合，F(xiàn)RB 結(jié)構(gòu)域?yàn)?1. 2 kD，因此，F(xiàn)RB 結(jié)構(gòu)不會(huì)影響LAP2β 在INM 上的定位。2CBioID 的設(shè)計(jì)確保了生物素連接酶與感興趣蛋白的結(jié)合只發(fā)生在加入AP21967之后，加入AP21967之前的體系可以作為對照，排除非特異性結(jié)合。因此，與傳統(tǒng)的BioID 相比2C-BioID 改善了融合蛋白的靶向問題，并減小了假陽性的可能，增強(qiáng)了生物素連接酶標(biāo)記的特異性。

2. 6 TurboID & miniTurbo

TurboID 和miniTurbo 是 由Branon 等［17］以R118S 突變的BirA 通過出錯(cuò)率高的PCR 產(chǎn)生并通過將其表達(dá)在酵母表面而篩選出來的，它們的催化效率比BirA 的更高，在添加生物素10 min內(nèi)即可起到鄰近標(biāo)記的作用。TurboID的大小也為35 kD，相較于野生型的BirA 具有15 個(gè)突變；miniTurbo的大小為28 kD，缺少N 末端結(jié)構(gòu)，相較于野生型BirA 有13 個(gè)突變［17］。雖然miniTurbo 的生物素化活性比TurboID 低，但在添加外源生物素之前，其標(biāo)記較少，背景干凈，在需要精確控制標(biāo)記時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中miniTurbo 是一個(gè)更好的選擇。 在HEK 293T細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜這4 個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，TurboID 的鄰近標(biāo)記效果均優(yōu)于miniTurbo，且穩(wěn)定性更強(qiáng)，另外TurboID也可用于果蠅和蠕蟲的體內(nèi)鄰近標(biāo)記［17］。

Split-TurboID［26］與split-BioID 相似，通過將TurboID 分成有較高重組能力的兩個(gè)非活性片段并將其分別與FRB-FKBP連接，再將其分別與不同亞細(xì)胞區(qū)室表達(dá)的蛋白融合，建立了生物素和雷帕霉素依賴性的表達(dá)體系，研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸位點(diǎn)的蛋白質(zhì)組成。當(dāng)?shù)鞍?蛋白相互作用時(shí)或膜-膜接觸時(shí)，TurboID 的兩個(gè)組分重組被激活，達(dá)到鄰近標(biāo)記的作用。

May 等［27］建立了穩(wěn)定表達(dá)BioID 和TurboID 融合蛋白的細(xì)胞系，并通過免疫印跡、免疫熒光和基于生物素親和純化的蛋白質(zhì)組學(xué)對兩者進(jìn)行了對比。發(fā)現(xiàn)TurboID 存在蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的跡象，在沒有外源生物素的情況下也可以進(jìn)行持續(xù)的生物素化，實(shí)際標(biāo)記半徑也有所增加。不過，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中TurboID的生物素化較BioID作用更強(qiáng)。

2. 7 AirID

AirID在2020年被首次報(bào)道，是Kido等［3］從自己建立的文庫（由Blastp Web 服務(wù)器和自定義Python腳本建立的一個(gè)和E．coliBirA 有30% 同源性的文庫）中篩選得到，是在原始BirA 的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的新型生物素標(biāo)記酶。BirA*的近端生物素化活性明顯低于TurboID 和AirID，AirID 標(biāo)記時(shí)較TurboID需要的生物素量低（TurboID 需要50 μmol/L 生物素，而AirID 在5 μmol/L 生物素甚至不含生物素的體系中也能達(dá)到鄰近標(biāo)記的目的［3，17］），且AirID 的生物素化發(fā)生在鄰近的賴氨酸殘基上，并且沒有特殊的序列優(yōu)先性，生物素化準(zhǔn)確性高還可用于檢測藥物對PPI的抑制作用。

3 BioID在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用

3. 1 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組傳統(tǒng)上是通過免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）和生化分離分析的。然而，這兩種方法都需要先裂解細(xì)胞，這容易失去低親和與短暫的蛋白質(zhì)相互作用，同時(shí)co-IP也受到可用抗體的限制，生化分離往往做不到純化完全［28］。此外，并不是所有的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)都能夠被分離［29］。BioID 在最開始開發(fā)出來即被Roux 等［7］用于研究組成核層的組成部分——層蛋白A（lamin-A，LaA），鑒定出名為SLAP75的新核膜相關(guān)蛋白。兩年后，開發(fā)者將BioID 與核孔的Nup107-160 復(fù)合體和Nup93 復(fù)合體中的成分融合，利用穩(wěn)定的Nup107-160結(jié)構(gòu)作為分子標(biāo)尺，定義了BioID的實(shí)際標(biāo)記半徑［8］。該技術(shù)也已成功的應(yīng)用于中心體纖毛復(fù)合體［30-31］、線粒體［22］、應(yīng)力顆粒和加工體［32］等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

3. 2 病毒宿主相互作用

病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，病毒-宿主蛋白相互作用是病毒生命周期進(jìn)行調(diào)控的主要方式［33］。V′Kovski 等［34］對BioID，APEX 等的小分子鄰近標(biāo)記技術(shù)在冠狀病毒中的應(yīng)用做了總結(jié)，通過將BioID、TurboID 和APEX2 與冠狀病毒的nsp2 蛋白融合，能夠識(shí)別冠狀病毒復(fù)制酶/轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物微環(huán)境中包含的關(guān)鍵宿主因子?？赡苡兄诮沂颈粐?yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）改變或劫持的細(xì)胞過程，提供有希望的藥物治療靶點(diǎn)。鄰近依賴生物素化還可以用于研究與病毒相關(guān)的腫瘤進(jìn)展過程或病毒的靶向細(xì)胞器等［35-36］。

3. 3 在體內(nèi)的運(yùn)用

Rudolph 等［37］將BirA*敲入到小鼠的肌聯(lián)蛋白中，以識(shí)別連接肌節(jié)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和新陳代謝的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，并描繪了可能的肌絲滑行的動(dòng)態(tài)過程。Uezu 等［38］通過向出生第1 天的小鼠中注射腺相關(guān)病毒（AAV）將BirA*與抑制性突觸后致密物（post?synaptic density，PSD）的主要支架蛋白Gephyrin 和PSD-95 在小鼠體內(nèi)融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了InSyn1 和InSyn2 是對GABA 能抑制具有重要功能的iPSD 蛋白。除了小鼠體內(nèi)運(yùn)用外，其在斑馬魚［16］、果蠅和蠕蟲［17］體內(nèi)也有應(yīng)用。

3. 4 藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)

RAS 是一個(gè)藥物難以干預(yù)的癌基因，Kovals?ki［39］將BioID 與CRISPR 篩選相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了一組新的功能性RAS 相關(guān)蛋白，并將mTORC2 定義為直接RAS效應(yīng)因子，干擾Ras-mTORC2相互作用可削弱體內(nèi)RAS 依賴性腫瘤的發(fā)生，為難治性癌基因的治療提供了可能選擇。人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）Gag多蛋白是組裝非感染性顆粒所必需的，Le Sage等［40］通過BioID篩選其鄰近蛋白發(fā)現(xiàn)了DDX17 和RPS6 與HIV-1 Gag 的相互作用，為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療提供了潛在靶點(diǎn)［41］。除此之外，也有研究者將其運(yùn)用到了藥物耐藥性研究的方面。BioID 適用于研究不溶性蛋白質(zhì)的相互作用，這一特點(diǎn)在分析以蛋白質(zhì)聚集為特征的神經(jīng)退行性疾病時(shí)特別有用，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)之一，泛素連接酶突變導(dǎo)致的異常調(diào)節(jié)通常與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)［42］。而E3 泛素連接酶底物的鑒定由于其低親和、相互作用短暫、靶標(biāo)易降解一直具有挑戰(zhàn)性，Coyaud等［43］借助BioID 技術(shù)，驗(yàn)證了E3 泛素連接酶的12種新底物，并揭示了β-TrCP在維持核膜完整性、加工體轉(zhuǎn)換和翻譯控制中的作用。

3. 5 其 他

Wu 等［44］運(yùn)用BioID 研究了石斑魚中新加坡石斑魚虹彩病毒（SGIV）的發(fā)病機(jī)制，研究了ICP18，一種由SGIV ORF086R 基因編碼有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和病毒組裝來促進(jìn)病毒復(fù)制的蛋白，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了其與周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）之間的相互作用，進(jìn)一步闡明了SGIV的發(fā)病機(jī)制。BioID在植物中的運(yùn)用也越來越受到重視，特別是在研究煙草花葉病毒的方面，研究了煙草對病毒的免疫［10］，作用靶點(diǎn)［45］，蛋白質(zhì)組研究模型［46］等，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

4 BioID和APEX

鄰近依賴的生物素化方法，除BioID 外還有APEX，鄰近生物素化標(biāo)記克服了經(jīng)典方法純化的局限性，近年來在各個(gè)方面得到了廣泛的應(yīng)用。將過氧化物酶用于生物素化，可以在1 min 內(nèi)完成鄰近蛋白質(zhì)的標(biāo)記［47］。過氧化物酶可以從酚芳基疊氮化物衍生物、酪胺衍生物和H2O2分子中產(chǎn)生短壽命的自由基，這些自由基可以共價(jià)連接到氨基酸的電子富側(cè)鏈（例如色氨酸或酪氨酸的芳環(huán)側(cè)鏈），通過這種方式，過氧化物酶可以通過生物素-酪胺或生物素-酚芳基疊氮化物衍生物介導(dǎo)生物素或熒光素標(biāo)記蛋白質(zhì)［48］。通過改造APEX 得到的改進(jìn)突變體APEX2 具有更高的催化效率，可以在融合蛋白表達(dá)量更低的情況下達(dá)到鄰近標(biāo)記的作用。

5 討 論

近年來，基于生物素酶的蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)逐漸被研究人員應(yīng)用在各個(gè)研究領(lǐng)域。鄰近標(biāo)記酶不僅可以單獨(dú)運(yùn)用，還可以與其他方法結(jié)合，如將BioID 與AP-MS 融合產(chǎn)生的MAC-tag［49］能夠更加全面地映射蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互作用。鄰近標(biāo)記技術(shù)不僅可以用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，Ramanathan等［4］基于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）設(shè)計(jì)了一種新的BirA*突變體，稱為BASU，它的動(dòng)力學(xué)速度較BirA*提高了1 000 倍以上，可以在短至1 min 的時(shí)間內(nèi)直接研究活細(xì)胞中RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。雖然鄰近標(biāo)記酶具有捕獲微弱和/或瞬時(shí)蛋白質(zhì)相互作用的能力，但識(shí)別的相互作用不僅限于直接結(jié)合物，還可以包括空間上接近的蛋白質(zhì)，這是它們共同的缺陷。除此之外，由于鏈酶親和素與生物素的親和力極高，導(dǎo)致鑒定出的大部分是非生物素化的肽［50］。研究者針對親和力過強(qiáng)的問題提出了一些解決方法［50-51］，BioID 標(biāo)記蛋白的能力取決于這些蛋白質(zhì)中伯胺的數(shù)量和可用性，因此，生物素化蛋白的豐度不可用來表示相互作用的強(qiáng)度或豐度［7］。也因?yàn)檫@樣，BioID 介導(dǎo)的生物素化不能用于驗(yàn)證實(shí)際的蛋白質(zhì)相互作用，只能用作篩選手段?；罴?xì)胞中的鄰近標(biāo)記已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)行為、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成的一種強(qiáng)有力的方法［48］。蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)的蓬勃發(fā)展與其應(yīng)用范圍的拓展，不僅為蛋白質(zhì)組學(xué)研究者提供了新的思路，也為藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供了新的選擇。