植物內(nèi)生菌生物學(xué)功能及microRNA 對植物-內(nèi)生菌互作的影響

薛蓮英，楊智宇,2，李天芳，李麗麗

（1. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江省酶與類酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；3. 黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081）

0 引言

植物內(nèi)生菌是一類能夠與植物共生且對植物無明顯病害的微生物，其與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，并長期處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中[1?2]。內(nèi)生菌通常定殖于植物根際或葉際，也可通過種子傳播，因其具有促生、抗逆等獨(dú)特的生物學(xué)功能可用于開發(fā)生防菌劑[3?5]。此外，內(nèi)生菌還具有分泌抗菌、抗炎、抗腫瘤等藥理活性的次生代謝產(chǎn)物[6?8]。因此，內(nèi)生菌的資源挖掘與利用具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在內(nèi)生菌-植物的互作機(jī)制中，共生相關(guān)基因及microRNA 發(fā)揮了重要作用。植物microRNA 是一類20~24 nt、與mRNA 具有序列互補(bǔ)性的非編碼RNA，通過結(jié)合并切割編碼區(qū)或5′和3′UTR 區(qū)的靶基因，抑制靶基因翻譯，參與植物細(xì)胞中多種信號通路的基因表達(dá)和調(diào)控，是植物體內(nèi)重要的“調(diào)節(jié)劑”[9?10]。

植物內(nèi)生菌因其獨(dú)特的生物學(xué)功能，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。植物microRNA 在內(nèi)生菌-植物的互作過程中也發(fā)揮了不可替代的作用。本文針對植物內(nèi)生菌的功能和植物microRNA 對植物-內(nèi)生菌互作的影響進(jìn)行綜述，為植物內(nèi)生菌應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、林業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等提供參考，同時(shí)為研究microRNA 在植物與內(nèi)生 菌互作中的作用機(jī)制提供思路。

1 植物內(nèi)生菌的功能

1.1 植物內(nèi)生菌的促生作用

植物內(nèi)生菌對宿主植物的促生作用一般體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是內(nèi)生菌分泌促生物質(zhì)促進(jìn)植物生長發(fā)育，如生長激素和多酚氧化酶等。二是通過溶磷和固氮作用提高植物對土壤養(yǎng)分的利用效率。內(nèi)生菌具有能夠溶解土壤中難溶的磷酸鹽、產(chǎn)生鐵載體、分泌促生因子（如吲哚乙酸）、降解土壤中復(fù)雜的有機(jī)分子等作用。IAA 是植物體內(nèi)最普遍的生長激素，能夠促進(jìn)植物生長、根及果實(shí)的生長發(fā)育[11]。鐵載體能夠特異性的螯合Fe3+，使鐵元素富集在植物根際，利于植物對鐵元素的吸收[12]。

趙曉妍等[13]從野生大豆中分離出一株P(guān)rovidencia屬內(nèi)生細(xì)菌-YDX14，發(fā)現(xiàn)其可分泌IAA；接種菌株YDX14 后，可顯著提高小麥生長量，是潛在的微生物肥料。Ismail 等[14]從菜豆（Phaseolus vulgaris）根中分離出PF2（Alternaria sorghi）、PF3（Penicillium commune）2 株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)2 株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物在增加植物生物量、碳水化合物、蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)量方面明顯優(yōu)于外源激素。一些木霉屬真菌也被發(fā)現(xiàn)具有重要的促生作用，如哈茨木霉（Trichoderma harzianum）SQR-T037 能夠定殖于番茄根部并促進(jìn)其生長[15]。

上述研究結(jié)果表明，內(nèi)生菌與植物互作能夠提高農(nóng) 作物產(chǎn)量和質(zhì)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及發(fā)展前景。

1.2 植物內(nèi)生菌對宿主抗逆性的影響

生物和非生物脅迫是制約植物生長發(fā)育的兩大影響因素。大量研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌能夠作為植物的“天然保護(hù)劑”，幫助植物抵抗逆境脅迫[16?17]。

植物病害是農(nóng)業(yè)面臨的主要難題，在全球范圍內(nèi)，植物病害造成的損失高達(dá)16%[18]。傳統(tǒng)上一般使用化學(xué)藥劑防控植物病害，但大量使用化學(xué)藥劑不但對人類健康及環(huán)境產(chǎn)生危害，還會(huì)提高病原體抗性[19]。因此，利用生防制劑防控植物病害是近年的研究熱點(diǎn)。植物寄生線蟲可寄生于多種作物，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。此外，由于線蟲寄生過程中在植物根部形成創(chuàng)傷，給其他病原體提供了侵染途徑[20]。內(nèi)生菌能夠在多種作物和林木中作為生物殺線蟲劑被廣泛使用，如蔬菜、果樹和松樹等[21]。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是最經(jīng)典的昆蟲病原真菌之一，在一定條件下也能進(jìn)入植物體內(nèi)，促進(jìn)植物生長并提高宿主植物對病蟲害的抗性[22]。蒙怡等[23]發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌定殖于牛蒡植株后，可促進(jìn)牛蒡的生長并增強(qiáng)牛蒡的抗性。

當(dāng)前，干旱、高溫、鹽堿、重金屬脅迫是植物面臨的主要非生物脅迫。內(nèi)生菌能夠針對脅迫做出應(yīng)答，如產(chǎn)生赤霉素和IAA[24?25]，促進(jìn)植物生長或抵御逆境脅迫；此外，內(nèi)生菌也能夠調(diào)節(jié)植物產(chǎn)生某些內(nèi)源性物質(zhì)來適應(yīng)逆境脅迫[26]。內(nèi)生菌可通過促進(jìn)碳氮代謝和基因表達(dá)，減少活性氧損傷，產(chǎn)生植物激素等途徑來緩解極端溫度對植物的生長影響；通過提高植物解毒酶活性和光合作用，減少活性氧損傷，產(chǎn)生ACC 脫氨酶和滲透調(diào)節(jié)因子等方式應(yīng)對鹽脅迫；還可通過改變重金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累來緩解重金屬脅迫對植物的危害[27]。

總體來看，內(nèi)生菌定殖于植物組織內(nèi)，可能是在環(huán)境壓力下植物與微生物共進(jìn)化過程中的一個(gè)優(yōu)化 選擇。

1.3 應(yīng)用植物內(nèi)生菌修復(fù)環(huán)境污染

為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，研究人員一直在尋找經(jīng)濟(jì)、高效、可行的污染控制技術(shù)。近年來，植物修復(fù)技術(shù)作為一種經(jīng)濟(jì)有效的綠色修復(fù)技術(shù)，已成為水體和土壤凈化的研究熱點(diǎn)[28]。然而，植物修復(fù)還存在植物生長緩慢、生物量小、揮發(fā)性污染擴(kuò)散等問題[29?30]。

網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)抓取采用大數(shù)據(jù)理念，強(qiáng)調(diào)獲取網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)，用整體來表征整體，而不是用部分來代表整體，它采取的是普查方式，調(diào)查對象的規(guī)模、抓取到的數(shù)據(jù)規(guī)模均要比傳統(tǒng)抽樣調(diào)查方法大得多，大數(shù)據(jù)方法的主要工作由計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)完成。大數(shù)據(jù)給社會(huì)調(diào)查帶來的一個(gè)重大影響表現(xiàn)為對抽樣方法的沖擊，“在大數(shù)據(jù)時(shí)代，我們可以分析更多的數(shù)據(jù)，有時(shí)候甚至可以處理和某個(gè)特別現(xiàn)象相關(guān)的所有數(shù)據(jù)，而不再依賴于隨機(jī)抽樣”。[6]

人工濕地具有低能耗、低成本、高效能等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前解決水體污染的有效措施[31]。人工濕地中，植物-內(nèi)生菌協(xié)同作用能夠提高工業(yè)廢水的修復(fù)效果，廢水中化學(xué)需氧量（Chemical oxygen demand，COD）、5 天 內(nèi) 的 生 化需 氧 量（Biochemical oxygen demand，BOD5）和鉻（Cr）的含量分別降低82%、94%和95%，明顯優(yōu)于單獨(dú)使用植物處理[32]。在植物-內(nèi)生菌協(xié)同作用體系中，內(nèi)生菌可促進(jìn)植物生長發(fā)育，降低重金屬對植物的危害，影響重金屬在植物體內(nèi)的遷移和積累[33]。

植物-內(nèi)生菌在復(fù)合土壤污染修復(fù)中的作用機(jī)制正逐步被解析[34]。在重金屬污染的土壤中，植物-內(nèi)生菌可通過溶磷作用、產(chǎn)鐵載體及植物激素、編碼重金屬解毒蛋白等方式來降低土壤的重金屬污染。對于含有機(jī)污染物土壤，植物-內(nèi)生菌通過減少土壤及植物中污染物含量及毒性、共代謝和酶降解機(jī)制對土壤進(jìn)行修復(fù)。Kaneez 等[35]利用植物-內(nèi)生細(xì)菌的協(xié)同作用修復(fù)原油污染土壤，將3 株內(nèi)生細(xì)菌與雙稃草（Leptochloa fusca）和巴拉草（Brachiaria mutica）共 生，其協(xié)同作用可顯著提高原油的生物降解效率。

1.4 應(yīng)用植物內(nèi)生菌提高植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量

屠呦呦團(tuán)隊(duì)從黃花蒿中提取出青蒿素是植物源藥物開發(fā)的一個(gè)里程碑。盡管化學(xué)制藥飛速發(fā)展，目前仍有較多藥用成分來源自植物組織?；诮?jīng)濟(jì)利益考慮，人們對一些野生藥用植物進(jìn)行毀滅性采集，使一些藥用植物瀕臨滅絕，如紅豆杉。接種內(nèi)生菌是促進(jìn)藥用植物生長和積累次生代謝產(chǎn)物的重要手段。此外，一些藥理活性物質(zhì)來源自藥用植物，研究發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)生菌可直接生產(chǎn)這些藥理活性物質(zhì)，因而能夠保護(hù)這些瀕危藥用植物物種。

Ye 等[36]從魚腥草根莖中分離出3 種內(nèi)生真菌，將其回接到魚腥草中并共培養(yǎng)后，內(nèi)生真菌Ilyonectria liriodendra 可促進(jìn)魚腥草生長并積累大量酚類物質(zhì)和揮發(fā)物；桔青霉（Penicillium citrinum）能夠增加魚腥草植株的鮮重、總?cè)~面積、株高及根莖生長，但對其代謝產(chǎn)物影響較小，而其中一株未知種屬的內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)魚腥草體內(nèi)多種藥用化合物（如2-十一烷酮和冰片）的積累且不影響宿主植物生長。印度梨形孢（Piriformospora indica）是一種植物根部內(nèi)生真菌，可定殖于多種植物根部。將姜黃與印度梨形孢共培養(yǎng)，能夠顯著提高姜黃的次生代謝產(chǎn)物姜黃素的產(chǎn)量[37]。與此類似，丹參內(nèi)生真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）DF20 能夠促進(jìn)丹參根中丹參酮的生物合成和積累，且在菌株DF20 與丹參共生初期，丹參酮生物合成途徑中一些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平會(huì)顯著增高，后期這些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平 又會(huì)有不同程度的下降[38]。

2 植物microRNA 對植物內(nèi)生菌的影響

研究表明，植物microRNA 具有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、提高植物對脅迫環(huán)境的耐受性等生物學(xué)功能[39]。目前，關(guān)于植物microRNA 在植物與內(nèi)生菌互作中作用的相關(guān)研究較少。較多研究集中于豆科植物與根瘤菌，植物microRNA 能夠影響豆科植物與根瘤菌的共生，可影響內(nèi)生菌在植物中的定殖，調(diào)節(jié)植物激素在內(nèi)共生體系中的表達(dá)，調(diào)節(jié)脅迫環(huán)境對植物內(nèi)共 生體系的影響。

2.1 植物microRNA 對豆科植物-根瘤菌共生的影響

在豆科植物與根瘤菌共生過程中，植物為根瘤菌提供碳源（如蘋果酸和琥珀酸）促進(jìn)其生長及定殖，而根瘤菌通過固氮反應(yīng)為豆科植物提供氮素營養(yǎng)[40]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)植物microRNA 能夠影響豆科植物與根瘤菌共生過程中一些基因和蛋白的變化，并且對根瘤菌在豆科植物中的共生產(chǎn)生影響[41]。

Adnane 等[42]研 究 了 蒺 藜 苜 蓿（Medicago truncatula）與根瘤菌共生過程中miR166 的變化及其功能。結(jié)果顯示：MIR166 過表達(dá)能夠減少共生根瘤和側(cè)根的數(shù)量，并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因根中維管束發(fā)育模式的改變，且能夠?qū)追NHD-ZIP III 轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著性影響。Manish 等[43]解析了鷹嘴豆與鷹嘴豆中慢生根瘤菌（Mesorhizobium ciceri）共生過程中一些microRNA 的功能，發(fā)現(xiàn)cat-miR319 通過靶向與生長素誘導(dǎo)基因相互作用的TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF （TCP）來調(diào)控生長素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Xu 等[44]研究了在不同氮素水平條件下蒺藜苜蓿中miR169c-GmNFYA-C-GmENOD40 的功能，發(fā)現(xiàn)高氮能夠誘導(dǎo)miR169c 表達(dá)，且其靶基因GmNFYAC 在根瘤菌誘導(dǎo)下在根瘤中優(yōu)先表達(dá)。在miR169c 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，miR169c 通過靶向GmNFYAC 的3′-UTR 抑制結(jié)瘤，而敲除miR169c 能夠促進(jìn)大豆根部結(jié)瘤。此外，GmNFYA-C 的過表達(dá)能夠促進(jìn)根瘤菌的定殖和GmENOD40 的表達(dá)，促進(jìn)大豆根部結(jié)瘤。

2.2 植物microRNA 功能及其對植物內(nèi)生真菌定殖的影響

自然條件下，柑橘（Citrus reticulata Blanco）根毛短而稀疏，因而叢枝菌根真菌的定殖對柑橘生長尤為重要，可使柑橘生長量、抗旱性得到提升[46]。接種叢枝菌根真菌后，自柑橘砧木枳（Poncirus trifoliata）中篩選到20 個(gè)差異表達(dá)的miRNA 和miRNAs菌根真菌的定殖對柑橘生長[47]。篩選內(nèi)生真菌定殖差異表達(dá)microRNA 后，一些研究也通過分析差異表達(dá)microRNA 的靶基因來分析其功能，其中 miR399g、miR473、miR1446b/c 和miR477a/c能夠靶向叢枝菌根共生的相關(guān)基因，如SbtM（Subtilisin-like serine protease）、 RAD1 （Required for arbuscule development 1）和 RFC （Replication factor C）。Isabella 等[48]研究了番茄與厚垣普可尼亞菌（Pochonia chlamydosporia）內(nèi)共生過程中microRNA的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一些預(yù)測的microRNA 靶基因表達(dá)下調(diào)， 如miRNA6022 的靶基因Solyc02g087840.2（Homeobox-leucine zipper-like protein, HD-Zip）、Solyc01g005720.2、Solyc01g005730.2（LRR receptor-like serine/ threonine-protein kinase，RLP）和Solyc01g008410.1在番茄根中表達(dá)下調(diào)； miR156a/b/c 靶基因Solyc07g062980.2 和 Solyc02g077920.2（SQUAMOSA promoter binding protein-like, SBP）在P. chlamydosporia定殖的根中也持續(xù)下調(diào)。

Piriformospora indica 是一種能夠定殖于多種植物的內(nèi)生真菌。蘭花生長緩慢，但與內(nèi)生真菌共生能夠明顯促進(jìn)生長。對P. indica 在文心蘭（Oncidium hybridum）根中定殖后microRNA 的差異表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在P. indica 定殖的文心蘭根中，其特異轉(zhuǎn)錄組序列與941 個(gè)microRNA 家族具有同源性，共篩選到46 個(gè)新的microRNAs，其預(yù)測的靶基因主要參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、發(fā)育和植物防御[49]。

在植物與叢枝菌根真菌共生初期，植物根系會(huì)釋放獨(dú)腳金內(nèi)酯（Strigolactone），刺激叢枝菌根真菌釋放共生因子—Myc-LCOs，為植物與叢枝菌根真菌共生做準(zhǔn)備[50?51]。Dominique 等[52]發(fā)現(xiàn)了一種由Myc-LCOs 觸發(fā)的調(diào)控機(jī)制，可通過microRNA 介導(dǎo)的NSP2 負(fù)調(diào)控來阻止叢枝菌根真菌對苜蓿根的過度定殖。將靶向NSP2 的microRNA-miR171h 過表達(dá)，會(huì)抑制真菌定殖；而在miR171h 沉默的NSP2 轉(zhuǎn)基因植株中，真菌的定殖能夠增加并延伸到根的伸長區(qū)；顯示miR171h 介導(dǎo)的NSP2 負(fù)調(diào)控可將苜蓿根系中的菌根菌定殖控制在一定范圍內(nèi)。

MicroRNA 能夠通過調(diào)節(jié)植物的生長素受體（Auxin receptor）表達(dá)來影響叢枝菌根真菌在植物中的定殖[53]。生長素是植物發(fā)育中重要的生長調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長、細(xì)胞和器官極性。Etemadi等[54]研究了影響生長素受體的microRNA-miR393 在叢枝發(fā)育中的作用。結(jié)果表明，miR393 能夠抑制含叢枝細(xì)胞對生長素的感知，是叢枝形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子。其中， miR393 前體在番茄（Solanum lycopersicum）、蒺藜苜蓿（M. truncatula）和水稻（Oryza sativa）3 種植物中的表達(dá)均下調(diào)，miR393 在根組織中的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生長素受體基因（TIR1，AFB）表達(dá)下調(diào)，叢枝發(fā)育不足。

以上研究表明，在內(nèi)生真菌與植物互作過程中，植物microRNA 能夠調(diào)節(jié)菌根共生相關(guān)基因以及植物生長必需的調(diào)節(jié)因子來影響內(nèi)生菌在植物中的定 殖。

3 小結(jié)及展望

當(dāng)前，較多研究集中于挖掘植物內(nèi)生菌資源及內(nèi)生真菌的促生抗逆作用，對植物內(nèi)生菌的新功能、解析植物-內(nèi)生菌的互作機(jī)制相關(guān)研究較少；已有的互作機(jī)制研究主要針對內(nèi)生菌對植物的影響，植物對內(nèi)生菌影響的相關(guān)研究較少。

在豆科植物-根瘤菌體系中，目前已解析了豆科植物-根瘤菌互作的關(guān)鍵基因、microRNA 及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有利于調(diào)控環(huán)境因子促進(jìn)此共生體系發(fā)揮生物學(xué)功能。受基因組序列等信息的限制，對于非模式植物、微生物共生互作研究進(jìn)展較緩慢。此外，自然條件下多種內(nèi)生菌與植物共生，其互作更為復(fù)雜，其互作的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。因而，有必要加強(qiáng)非模式植物、微生物互作及多種內(nèi)生菌與植物互作中microRNA 的變化及功能研究。

近年來，高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有利于解析植物-內(nèi)生菌互作中的microRNA種類及功能。宏轉(zhuǎn)錄組、互作轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，既有利于分析植物microRNA 對內(nèi)生菌定殖的調(diào)控，也有利于解析互作過程中內(nèi)生菌microRNA 表達(dá)的變化，可進(jìn)一步基于過表達(dá)及沉默策略分析植物及內(nèi)生菌microRNA 的功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而有利于明晰植物-內(nèi)生菌的互作機(jī)制并進(jìn)一步調(diào)控此共生體系，使其充分發(fā)揮生物學(xué)功能。