缺氧誘導(dǎo)因子在骨肉瘤中的相關(guān)研究進(jìn)展*

盛奇智 李廣磊 劉平 阮鋒 魏優(yōu)秀

骨肉瘤（osteosarcoma）是臨床上常見(jiàn)的惡性原發(fā)性骨腫瘤，好發(fā)于青少年或65歲以上老年人的長(zhǎng)骨干骺端（以脛骨上端及股骨下端最多見(jiàn)），其轉(zhuǎn)移早，惡性程度高，愈后差，特別是首診即發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者的5年生存率不足20%。骨肉瘤組織細(xì)胞普遍存在缺氧的現(xiàn)象，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）作為缺氧條件下起重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，為處于缺氧環(huán)境下骨肉瘤細(xì)胞的存活、增殖和侵襲發(fā)揮了重要作用。本文就HIFs與骨肉瘤干細(xì)胞、HIFs與骨肉瘤的放療抵抗、HIFs與骨肉瘤的多藥耐藥及HIFs抑制劑在骨肉瘤治療的研究的相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 缺氧誘導(dǎo)因子的概述

現(xiàn)有的研究表明，在腫瘤細(xì)胞缺氧應(yīng)答體系中，缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）居于核心調(diào)控位置。HIFs家族的3個(gè)成員HIF-1、HIF-2和HIF-3分別由α和β亞基組成，其中α亞基受細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度精密調(diào)控，對(duì)HIFs功能的發(fā)揮起關(guān)鍵作用；在常氧條件下α亞基極易被脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain proteins，PHDs）羥基化，然后與希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白（vov-Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL）靶向結(jié)合，最后經(jīng)泛素化—蛋白酶途徑而被降解；在正常氧狀態(tài)下，HIF-α的半衰期＜5 min。而缺氧條件時(shí)α亞基的羥基化作用被完全抑制，致使α亞基和β亞基發(fā)生異二聚化并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，然后通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄共激活因子p300/CBP，與靶基因的啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia responsive elements，HREs）相結(jié)合，調(diào)控多種缺氧反應(yīng)基因。HIF-1α和HIF-2α在絕大多數(shù)正常組織中無(wú)表達(dá)，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[1]。HIF-1α通過(guò)誘導(dǎo)VEGF和糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)，增加供血、供氧、供能，改善低氧狀態(tài)[2]；通過(guò)誘導(dǎo)MMP-2、MMP-7和MMP-9表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移[3-4]；通過(guò)誘導(dǎo)EMT相關(guān)蛋白SNAI1、TWIST、SLUG、Zeb1、SIP1、LOX、Vimentin、N-cadherin表達(dá)促進(jìn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移[5]。HIF-2α則通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體和下游的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/蘇氨酸激酶（ERK/Akt）等信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)腫瘤增殖的調(diào)控作用[6]。Keith等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和HIF-2α在疾病發(fā)展的不同階段發(fā)揮作用，HIF-1α主要在早期腫瘤、急性炎癥和缺氧中起作用，而HIF-2α在中晚期腫瘤階段、慢性炎癥和缺氧中作用更大。相對(duì)于HIF-1α和HIF-2α而言，人們對(duì)HIF-3α的認(rèn)識(shí)和研究較為匱乏。目前學(xué)者普遍認(rèn)為，HIF-3α可能在抑制HIF-1α和HIF-2α的功能中發(fā)揮作用，其功能有待深入研究[8]。

2 HIFS與骨肉瘤干細(xì)胞

有研究顯示，缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）在骨肉瘤干細(xì)胞（osteosarcomastem cells，OSCs）中高表達(dá)，而選擇性抑制HIF-1α或HIF-2α后發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞增殖及遷移活性明顯下降[9]。缺氧條件下，HIF-1和HIF-2能夠通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路（TGF-β、Notch、Hedgehog、Wnt/β-catenin等）調(diào)控骨肉瘤干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)自我更新和侵襲遷移。轉(zhuǎn)化因子β1（TGF-β1）是一種影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、遷移的多功能蛋白質(zhì)。缺氧條件下，HIF-1/2α通過(guò)激活TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)可顯著增強(qiáng)骨肉瘤干細(xì)胞（OSCs）的侵襲轉(zhuǎn)移活性、干細(xì)胞成瘤性和瘤組織內(nèi)新生血管生成能力[10]。有研究表明，TGF-β1的活性被抑制后，低氧誘導(dǎo)骨肉瘤去分化以及OSCs的自我更新受到明顯抑制，這表明TGF-β1在維持OSCs的“干”性和多樣性的作用十分重要[11]，進(jìn)一步研究表明TGF-β1的作用還與干細(xì)胞基因Sox2、Nanog、Oct3/4的表達(dá)略微增加有關(guān)[10,12]。Wnt/β-catenin通路是骨肉瘤干細(xì)胞的一條經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在調(diào)控OSCs的自我更新、“干”性維持、侵襲轉(zhuǎn)移等發(fā)揮作用[13]。低氧條件下HIF-1α與靶基因的HREs序列結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，該復(fù)合物能促使磷酸化的β-catenin不被降解，致使β-catenin蓄積而進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)下游基因的表達(dá)[14]。Liu等[15]用薯蕷皂苷抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)OSCs的“干”樣表型活性及增殖侵襲能力下降。Notch蛋白是一種跨膜蛋白，被配體激活后，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（intracelluar domain of the Notch receptor，NICD）被釋放入胞核，進(jìn)而調(diào)控Hes及Hey蛋白家族[16]。Tohda等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，HIF-1α可激活Notch通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲。Notch信號(hào)通路的激活對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的維持及對(duì)骨肉瘤的演進(jìn)起重要作用，同時(shí)Notch通路與骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移表型以及乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）活性密切相關(guān)。Dai等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用DAPT（一種新型γ-分泌酶抑制劑）靶向阻斷Notch通路的活性后明顯增加了OSCs的損耗，增強(qiáng)了順鉑對(duì)鉑耐藥骨肉瘤細(xì)胞的殺傷力。HIFs能誘導(dǎo)激活Hedgehog通路，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞侵襲和EMT的發(fā)生，調(diào)節(jié)和維持OSCs“干”性表型活性[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)被異常激活，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的Hedgehog通路異常激活與骨肉瘤的發(fā)生密切相關(guān)，而抑制Hedgehog通路時(shí)OSCs的“干”性表型活力下降及骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移受抑制[13,21-22]。HIF-3在骨肉瘤干細(xì)胞有表達(dá)，但其對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的作用研究并不多，作用機(jī)制尚不明確，HIFs在OSCs的研究多集中在HIF-1和HIF-2。

3 HIFs與骨肉瘤的放療抵抗

傳統(tǒng)認(rèn)為骨肉瘤對(duì)放療是不敏感的，DeLaney等[23]研究發(fā)現(xiàn)，組織病檢已確診患者給予低劑量分次放療（2 Gy/次），總劑量達(dá)到或超過(guò)68 Gy，5年局部控制率僅40%。更高的輻射劑量有助于局部控制，但總體效果亦不是很明顯。放療主要破壞細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)，一方面通過(guò)高能量直接使DNA雙鏈斷裂以及雙螺旋的空間結(jié)構(gòu)喪失，另一方面高能量輻射使細(xì)胞所在的內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，使DNA雙鏈氧化斷裂。雖然細(xì)胞有完整高效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，但不能保證所有的DNA損傷都能完整正確的修復(fù)，若不能修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)則導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，現(xiàn)有的正常血管往往不能供給充足的營(yíng)養(yǎng)和氧，雖然骨肉瘤組織會(huì)誘導(dǎo)新生血管，但由此產(chǎn)生的血管經(jīng)常是結(jié)構(gòu)和功能不完整的，因此骨肉瘤瘤體內(nèi)部組織的細(xì)胞周?chē)纬扇毖跷h(huán)境。缺氧微環(huán)境下HIFs能使骨肉瘤細(xì)胞維持低代謝和低增殖水平，減少產(chǎn)生活性氧（ROS）以及減少DNA損傷，在缺氧環(huán)境下高代謝水平的骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生死亡，但部分能耐受缺氧，在極低代謝水平下存活，這些“冬眠”細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。這些“冬眠”的骨肉瘤干細(xì)胞的DNA復(fù)制基本“停滯”，放射線(xiàn)對(duì)其DNA損傷程度相對(duì)降低而導(dǎo)致放療抵抗[23]。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1、HIF-2在骨肉瘤細(xì)胞表達(dá)水平與其放療效果呈負(fù)相關(guān)性[24]。HIF-1α通過(guò)促進(jìn)骨肉瘤血管形成、提高糖酵解水平等作用對(duì)逃脫電離輻射損傷的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生有利的作用。一般認(rèn)為，HIF-2α在慢性缺氧過(guò)程中作用更持久[7]，據(jù)此推斷HIF-2α對(duì)骨肉瘤的放療抵抗起主要作用。Saint-Martin等[25]發(fā)現(xiàn)在相同放療條件下敲去HIFs基因，細(xì)胞自噬和凋亡水平明顯升高；敲去HIFs基因同時(shí)抑制細(xì)胞自噬細(xì)胞凋亡并無(wú)減少，而抑制HIF-2α活性后ROS含量顯著上升使細(xì)胞大量死亡，說(shuō)明缺氧條件下HIF-2α對(duì)細(xì)胞的放療抵抗起重要作用。目前，HIF-2在骨肉瘤放療抵抗的確切機(jī)制尚不清楚，HIF-3與骨肉瘤的放療抵抗有無(wú)相關(guān)性亦未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

4 HIFs與骨肉瘤的多藥耐藥

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是骨肉瘤化療面臨的主要難題，也是決定骨肉瘤患者療效的重要因素。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HIFs作為缺氧條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答的主要細(xì)胞因子，與骨肉瘤化療的多藥耐藥性密切相關(guān)。HIFs誘導(dǎo)的MDR主要是通過(guò)HIF-1α激活靶基因，啟動(dòng)MRP1/P-GP過(guò)表達(dá)。MRP1/P-GP幾乎在所有機(jī)體細(xì)胞胞質(zhì)都有表達(dá)，少量分布于細(xì)胞膜，是最早被認(rèn)識(shí)的MRP（多藥耐藥相關(guān)蛋白）。MRP1/P-GP是一種包含2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與胞內(nèi)藥物帶正電或中性亞基結(jié)合，通過(guò)消耗2分子ATP耗能，將1分子藥物排出至細(xì)胞膜外，泵出藥物后使得細(xì)胞內(nèi)藥物作用靶點(diǎn)周?chē)幬餄舛冉抵了幬锲鹦ч撝禎舛纫韵拢蛘咄ㄟ^(guò)藥物外泵使藥物與作用靶點(diǎn)而產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象。缺氧條件下骨肉瘤細(xì)胞HIF-1α、MRP1/P-GP都上調(diào)表達(dá)，而人為抑制HIF-1α表達(dá)后MRP1/P-GP的表達(dá)明顯受抑制，表明HIF-1α調(diào)控MRP1/P-GP基因的表達(dá)，HIF-1α與骨肉瘤細(xì)胞化療多藥耐藥有關(guān)[26-27]。Comerford等[28]在分析上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞MRP1/P-GP缺氧下表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)在MDR1基因啟動(dòng)子－49－45序列上有HRE能與HIF-1α結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，這為研究HIF-1α骨肉瘤細(xì)胞的MRP1/P-GP表達(dá)提供了新思路。HIF-2/HIF-3對(duì)骨肉瘤多藥耐藥蛋白的調(diào)控的作用尚不明確。曾濤等[29]研究表明，骨肉瘤細(xì)胞MRP1/P-GP高表達(dá)與MDR密切相關(guān)，還能促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移。缺氧條件下，HIFs對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的促進(jìn)作用在上文HIFs與骨肉瘤干細(xì)胞段落已闡述，骨肉瘤干細(xì)胞參與骨肉瘤多藥耐藥（MDR）也已被證實(shí)，但相關(guān)機(jī)制不明確。可能與下列因素相關(guān)：①骨肉瘤干細(xì)胞膜上高表達(dá)的ATPBinding Cassette蛋白，這類(lèi)蛋白大多可運(yùn)輸并外排包括代謝產(chǎn)物、藥物、毒性物質(zhì)、內(nèi)源性脂類(lèi)物質(zhì)、多肽、核苷酸及固醇類(lèi)等多種物質(zhì)，使之產(chǎn)生MDR。Tirino等[30]用免疫熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ABCG2在OSCs表達(dá)明顯高于骨肉瘤細(xì)胞，而且其外排泵的作用不被維拉帕米等藥物抑制。②骨肉瘤干細(xì)胞能高效自我修復(fù)DNA雙鏈。臨床使用的鉑類(lèi)、烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶制劑等抗腫瘤藥物作用機(jī)制是破壞雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，從而干擾細(xì)胞代謝導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此OSCs能高效修復(fù)DNA而對(duì)這幾類(lèi)藥物耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，MLH1、MSH2等DNA修復(fù)基因在OSCs高表達(dá)[31]。田吉光[32]的研究發(fā)現(xiàn)，具有修復(fù)DNA作用的DNA-PK（DNA依賴(lài)蛋白激酶）在具有干細(xì)胞特性的骨肉瘤細(xì)胞MG63中有表達(dá)，而下調(diào)DNA-PKcs能提高骨肉瘤細(xì)胞MG63藥物敏感性。③OSCs具備較強(qiáng)的自身解毒能力。ALDH（乙醛脫氫酶）是一種重要的細(xì)胞解毒酶，Gangemi等[33]研究表明在OSCs中ALDH的表達(dá)及活性都強(qiáng)于骨肉瘤細(xì)胞。④Bcl-2、IAP-1、IAP-2及survivin等抗凋亡蛋白在OSCs中上調(diào)明顯，故OSCs的抗凋亡能力較骨肉瘤細(xì)胞明顯增強(qiáng)。骨肉瘤中晚期多出現(xiàn)MDR，目前研究認(rèn)為HIF-2α在中晚期腫瘤階段、慢性炎癥和缺氧中發(fā)揮作用更大，HIF-2與骨肉瘤的MDR有無(wú)相關(guān)性以及在其中發(fā)揮多大作用有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

5 HIFs抑制劑在骨肉瘤治療中的研究

目前，有多種HIFs抑制劑用于骨肉瘤治療的研究，其中有些藥物已證實(shí)對(duì)骨肉瘤有效。目前已發(fā)現(xiàn)的HIFs抑制劑的作用機(jī)制有以下幾種：①抑制HIF-αmRNA的轉(zhuǎn)錄或HIF-αs蛋白翻譯合成；②影響HIF-αs的穩(wěn)定性或HIF-αs與HIF-β的二聚化；③阻止HIFs與靶基因DNA的結(jié)合；④抑制HIFs轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成。多柔比星是骨肉瘤常見(jiàn)化療藥，通過(guò)靶向抑制HIF-1與DNA的HRE序列結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄過(guò)程[34]。張斌等[35]研究表明，依維莫司通過(guò)抑制mTOR通路減少其下游感受器p70S6K而抑制HIF-1α的翻譯，從而能增強(qiáng)阿霉素對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞增殖侵襲抑制作用。EZN-2968是目前研究較多的人工合成的反義寡鏈脫氧核苷酸，它包含有16個(gè)和人HIF-1αmRNA完全配對(duì)的核苷酸殘基，并以劑量依賴(lài)的方式下調(diào)人HIF-1α亞基表達(dá)，當(dāng)濃度達(dá)5 mmol/L時(shí)即可完全抑制人HIF-1αmRNA的活性，試驗(yàn)表明：EZN-2968能下調(diào)腫瘤組織HIF-1α蛋白亞基的表達(dá)[36]，而EZN-2968僅有3個(gè)核苷酸殘基能與人HIF-2α mRNA配對(duì)，故EZN-2968對(duì)HIF-2αmRNA的活性幾乎無(wú)影響。目前EZN-2968正用于晚期肝癌的第三階段I試驗(yàn)，將來(lái)有望用于骨肉瘤的治療。姜黃素是從植物姜黃的莖和根中提取的活性色素成分，能發(fā)揮蛋白酶的活性降解HIF-1α到達(dá)下調(diào)腫瘤細(xì)胞HIF-1的作用，已證實(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用。李丁[37]通過(guò)研究姜黃素對(duì)骨肉瘤U-2OS細(xì)胞放療敏感性的影響發(fā)現(xiàn)，姜黃素是通過(guò)抑制NF-κB通路減少ATM蛋白合成致使細(xì)胞的DNA自我修復(fù)能力下降來(lái)增強(qiáng)對(duì)放療的敏感性。雌激素的代謝產(chǎn)物2-甲氧基雌二醇（2-ME）通過(guò)抑制HIF-1α和HIF-2α亞基的生成進(jìn)而下調(diào)HIF-1和HIF-2，進(jìn)而影響HIFs靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。湯小燕等[38]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2-ME在小鼠體內(nèi)能有效抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制與缺氧條件下2-ME下調(diào)HIF-1和HIF-2而抑制Bcl-2、VEGF、Caspase-3等基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)，2-ME在動(dòng)物體內(nèi)未見(jiàn)明顯毒副作用，有望成為治療骨肉瘤的新型化療藥物。伏立諾他已證實(shí)能促進(jìn)HIF-α降解但機(jī)制不明確，只是認(rèn)為它作為一種組蛋白脫乙酰酶抑制發(fā)揮作用。Zhang等[39]通過(guò)研究伏立諾他聯(lián)合順鉑對(duì)骨肉瘤U-2OS細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)伏立諾他聯(lián)合順鉑通過(guò)JNK/caspase通路阻滯骨肉瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，該研究為骨肉瘤的化療增敏提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前在HIFs抑制劑治療骨肉瘤的研究中多數(shù)是研究HIF-1抑制劑，少量是HIF-2抑制劑，對(duì)于中晚期骨肉瘤HIF抑制劑能否發(fā)揮理想的效果有待進(jìn)一步研究。

6 小結(jié)

缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）能維持骨肉瘤干細(xì)胞的“干”性，促進(jìn)骨肉瘤干細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，能增強(qiáng)骨肉瘤的放療抵抗，增強(qiáng)骨肉瘤的多藥耐藥性，缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑能抑制骨肉瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到治療目的。目前，HIFs在骨肉瘤的研究多集中在HIF-1，對(duì)HIF-2的研究相對(duì)較少，而HIF-3的研究更是缺乏。深入研究骨肉瘤細(xì)胞中HIFs的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可為發(fā)現(xiàn)骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)和新方法提供思路，對(duì)研究骨肉瘤的復(fù)發(fā)、化療藥物的多重耐藥、放療抵抗及治療骨肉瘤的新藥研發(fā)都具有重大意義。