miR-874-3p靶向GALNT4調(diào)控宮頸癌細胞增殖與凋亡的分子機制研究

李 娜 李 焱 高雪梅 朱一麟 賀 漪 （武漢市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022）

宮頸癌是全球女性常見惡性腫瘤和女性癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，每年新發(fā)病例569847例，死亡病例311 365例［1］。研究證明異常表達的微小RNA（microRNA，miRNA）與宮頸癌發(fā)展有關(guān)［2-4］。miR-874-3p是一種與癌癥進展密切相關(guān)的miRNA，上皮性卵巢癌中miR-874-3p表達下調(diào)，過表達時抑制上皮性卵巢癌惡性發(fā)展［5］。結(jié)直腸癌中miR-874-3p表達下調(diào)，抑制其表達可增加化療抗性［6］。但miR-874-3p在宮頸癌中的生物學(xué)功能尚未闡明。GALNT4已被證明在多種癌癥中具有致癌作用，如前列腺癌中GALNT4表達上調(diào)，其低表達抑制癌細胞生長［7］。結(jié)腸癌中，GALNT4呈高表達，低表達時顯著抑制細胞增殖并促進其凋亡［8］。但miR-874-3p對GALNT4的靶向調(diào)控作用尚不清楚。本研究通過與GALNT4結(jié)合，評估m(xù)iR-874-3p對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討miR-874-3p影響宮頸癌進展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸上皮永生化細胞H8、宮頸癌細胞SiHa、HeLa、Caski（中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細胞資源中心）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；β-actin、GALNT4、細 胞 周 期 蛋 白D1（CyclinD1）、Cleaved-Caspase-3、β-catenin一抗、辣根過氧化物酶（HPR）標記的二抗購自（Abcam公司）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；BDFACSAriaTM流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H8、SiHa、HeLa、Caski細胞采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2中培養(yǎng)，細胞融合度超過80%時，采用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代，選擇對數(shù)生長期HeLa細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的HeLa細胞，按LipofectamineTM2000說明分別轉(zhuǎn)染miR-874-3p mimics（過表達miR-874-3p）、miR-NC、miR-874-3p inhibitors（低表達miR-874-3p）、anti-miR-NC、si-GALNT4（低表 達GALNT4）、si-NC、pcDNA-GALNT4（過 表 達GALNT4）、pcDNA-NC，由上海GenePharma公司合成。調(diào)整各組HeLa細胞密度為5×104個/ml，接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合達50%～70%時進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后采用RPMI1640培養(yǎng)基替代原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-874-3p和GALNT4 mRNA表達 采用TRIzol試劑提取HeLa細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green試劑盒和ABIPrism 7500實時PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR，以U6為miRNA內(nèi)源性對照，以GAPDH為mRNA內(nèi)源性對照，2-ΔΔCt分析數(shù)據(jù)。miR-874-3p F：5'-GAACTCCACTGTAGCAGAGATGGT-3'，R：5'-CATTTTTTCCACTCCTCTTCTCTC-3'，GALNT4 F：5'-AAAGATTGCTGGGTCACACC-3'，R：5'-TGTCAAAAGGGAAATGAGGC-3'，U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，GAPDH F：5'-CCACCTTCGATGCCGGGGCT-3'，R：5'-GGGGCCGAGTTGGGATAGGG-3'。

1.2.4 Western blot檢測GALNT4、CyclinD1、Cleaved-Caspase-3、β-catenin蛋 白 表 達 提 取H8、SiHa、HeLa、Caski細胞總蛋白，檢測GALNT4蛋白表達；提取轉(zhuǎn)染后的HeLa細胞總蛋白，檢測GALNT4、CyclinD1、Cleaved-Caspase-3、β-catenin蛋白表達。BCA試劑盒檢測蛋白濃度。加入5×SDS加樣緩沖液，95℃變性5 min，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉4℃密封過夜，Tris緩沖鹽水、1%Tween20（TBST）洗滌，加入一抗GALNT4、CyclinD1、Cleaved-Caspase-3、β-catenin和β-actin（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST清洗，加入HPR標記的二抗，TBST洗滌，化學(xué)發(fā)光顯影，Image J軟件分析目標條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖 將HeLa細胞接種至96孔板（5×103個/孔），培養(yǎng)48 h，添加CCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定450 nm處吸光度。細胞增殖率（%）=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后收集HeLa細胞，PBS沖洗3次，加至預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液（500μl），向細胞懸液中加入5μl Annexin VFITC和5μl PI，輕輕混合，流式細胞儀測定細胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶活性檢測 starBase網(wǎng)站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測發(fā)現(xiàn)GALNT4可能是miR-874-3p的靶基因。構(gòu)建含miR-874-3p結(jié)合位點的GALNT4-3'UTR野生型（GALNT4-WT）及突變型（GALNT4-MUT）報告基因載體，HeLa細胞中轉(zhuǎn)染miR-874-3p mimics或陰性對照miR-NC和GALNT4-WT或GALNT4-MUT報告基因載體，48 h后雙熒光素酶報告試劑盒測定HeLa細胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細胞系miR-874-3p和GALNT4表達qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與宮頸上皮永生化細胞H8比較，宮頸癌SiHa、HeLa、Caski細胞miR-874-3p表達明顯減少，GALNT4 mRNA和蛋白表達顯著增加（P＜0.05），其中HeLa細胞差異最為顯著（圖1）。

圖1 宮頸癌細胞系miR-874-3p和GALNT4表達Fig.1 Expressions of miR-874-3p and GALNT4 in cervical cancer cell lines

2.2 過表達miR-874-3p對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響 qRT-PCR、Western blot、CCK-8和流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC比較，過表達miR-874-3p可提高宮頸癌HeLa細胞miR-874-3p表達，降低CyclinD1蛋白表達，增加Cleaved-Caspase-3蛋白表達，降低細胞增殖率，提高細胞凋亡率（P＜0.05，表1、圖2）。

圖2 過表達miR-874-3p對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of over-expression of miR-874-3p on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells

表1 過表達miR-874-3p對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of over-expression of miR-874-3p on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells（±s，n=3）

表1 過表達miR-874-3p對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of over-expression of miR-874-3p on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells（±s，n=3）

Note：Compared with miR-NCgroup，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-874-3p tP miR-874-3p 1.00±0.08 2.66±0.231）11.807 0.001 Cell proliferation rate（%）100.00±10.15 56.89±5.101）6.573 0.000 Apoptosis rate（%）7.22±0.61 24.97±2.151）13.757 0.000

2.3 低表達GALNT4對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響 Western blot、CCK-8和流式細胞術(shù)結(jié)果表明，與si-NC比較，低表達GALNT4減少宮頸癌HeLa細胞GALNT4、CyclinD1蛋白表達，提高Cleaved-Caspase-3蛋白表達，并降低細胞增殖率，提高細胞凋亡率（P＜0.05，表2、圖3）。

表2 低表達GALNT4對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of low expression of GALNT4 on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells（±s，n=3）

表2 低表達GALNT4對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of low expression of GALNT4 on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells（±s，n=3）

Note：Compared with si-NCgroup，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-GALNT4 tP GALNT4 0.94±0.11 0.36±0.011）9.095 0.001 Cell proliferation rate（%）100.00±9.86 46.83±4.101）8.624 0.001 Apoptosis rate（%）7.20±0.63 25.29±2.031）-14.741 0.000

圖3 Western blot檢測GALNT4、CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白表達Fig.3 Western blot detection of GALNT4，CyclinD1，Cleaved-Caspase-3 protein expressions

2.4 miR-874-3p靶向調(diào)控GALNT4表達 starBase預(yù)測miR-874-3p與GALNT4核苷酸存在靶向結(jié)合位點（圖4A）。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-874-3p與GALNT4-WT共轉(zhuǎn)染HeLa細胞后，熒光素酶活性明顯低于miR-NC與GALNT4-WT共轉(zhuǎn)染（P＜0.05，圖4B）；miR-874-3p或miR-NC與GALNT4-MUT共轉(zhuǎn)染HeLa細胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖4B）。Western blot結(jié)果表明，與miR-NC比較，miR-874-3p組HeLa細胞GALNT4蛋白表達明顯降低；與anti-miR-NC比較，anti-miR-874-3p組GALNT4蛋白表達顯著提高（P＜0.05，圖4C）。

圖4 miR-874-3p靶向調(diào)控GALNT4表達Fig.4 miR-874-3p targeting regulates GALNT4 expression

2.5 過表達GALNT4可部分逆轉(zhuǎn)miR-874-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響 Western blot、CCK-8和流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-874-3p和pcDNA-NC共轉(zhuǎn)染比較，miR-874-3p和pcDNAGALNT4共轉(zhuǎn)染明顯提高GALNT4、CyclinD1蛋白表達和細胞增殖率，顯著降低Cleaved-Caspase-3蛋白表達和細胞凋亡率（P＜0.05，圖5）。

圖5 過表達GALNT4部分逆轉(zhuǎn)miR-874-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響Fig.5 Over-expression of GALNT4 partially reverses effect of over-expression of miR-874-3p on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells

2.6 Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC比較，miR-874-3p組宮頸癌HeLa細胞β-catenin蛋白表達明顯減少；與miR-874-3p和pcDNA-NC共轉(zhuǎn)染比較，miR-874-3p和pcDNA-GALNT4共轉(zhuǎn)染顯著提高β-catenin蛋白水平（P＜0.05，圖6、表3）。

圖6 Western blot檢測β-catenin蛋白表達Fig.6 Western blot detection ofβ-catenin protein expression

表3 Western blot檢測β-catenin蛋白表達（±s，n=3）Tab.3 Western blot detection ofβ-catenin protein expression（±s，n=3）

表3 Western blot檢測β-catenin蛋白表達（±s，n=3）Tab.3 Western blot detection ofβ-catenin protein expression（±s，n=3）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05；compared with miR-874-3p+pcDNA-NCgroup，2）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-874-3p miR-874-3p+pcDNA-NC miR-874-3p+pcDNA-GALNT4 FP β-catenin 0.84±0.08 0.34±0.041）0.36±0.05 0.73±0.072）50.773 0.000

3 討論

宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制尚未闡明。更好地了解宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制有助于尋找新的生物標志物和治療靶點，對改善宮頸癌患者預(yù)后至關(guān)重要。miRNA廣泛存在于真核生物，越來越多證據(jù)表明，miRNA在包括宮頸癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤中起重要作用，已證明多種miRNA參與宮頸癌進展。本研究發(fā)現(xiàn)，與宮頸上皮永生化細胞H8比較，宮頸癌SiHa、HeLa、Caski細胞miR-874-3p表達明顯減少，與既往報道結(jié)論一致［5-6］。研究表明，miR-874-3p是食管鱗狀細胞癌患者的獨立預(yù)后因素，在食管鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達低于正常對照組，轉(zhuǎn)染miR-874-3p mimic后細胞增殖、遷移和侵襲受到顯著抑制［9］。miR-874-3p通過靶向ADAM19抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲［10］。提示miR-874-3p是一種重要的抑癌因子，具有抗癌作用。但鮮有研究關(guān)注miR-874-3p在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。CyclinD1屬于高度保守的細胞周期家族，其表達變化預(yù)示細胞增殖變化，Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，活化后生成Cleaved-Caspase-3，執(zhí)行細胞凋亡。本研究功能實驗結(jié)果顯示，過表達miR-874-3p顯著降低HeLa細胞增殖率、CyclinD1蛋白水平，而提高細胞凋亡率和Cleaved-Caspase-3蛋白表達，提示miR-874-3p可有效抑制宮頸癌細胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，顯示出抑制腫瘤功能，與前述研究結(jié)論相符［9-10］。

本 研 究 中，宮 頸 癌SiHa、HeLa、Caski細 胞GALNT4 mRNA和蛋白表達明顯增加。據(jù)報道，結(jié)腸癌組織和細胞系中GALNT4表達上調(diào)，miR-4262通過靶向GALNT4抑制結(jié)腸癌細胞增殖［11］。GALNT4在乳腺癌組織中表達上調(diào)，miR-365下調(diào)可能通過GALNT4促進乳腺癌細胞生長［12］。本研究中，低表達GALNT4顯著降低HeLa細胞CyclinD1蛋白表達及細胞增殖率，提高Cleaved-Caspase-3蛋白表達和細胞凋亡率，說明低表達GALNT4對宮頸癌細胞增殖具有抑制作用，對細胞凋亡具有促進作用。miRNA通過與靶mRNA 3'UTR特定序列結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達，從而調(diào)節(jié)人類癌細胞生長和分化［13］。本研究starBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GALNT4 3'UTR包含假定的miR-874-3p結(jié)合位點。熒光素酶報告基因分析證實miR-874-3p可與GALNT4結(jié)合。上調(diào)miR-874-3p表達明顯抑制GALNT4表達，下調(diào)時則相反，進一步表明miR-874-3p靶向調(diào)控GALNT4表達。

研究表明，癌基因途徑如Wnt/β-catenin過度激活與宮頸癌進展有關(guān)［14-16］。抑制Wnt/β-catenin信號通路可部分恢復(fù)宮頸癌致癌基因的生物特征［17］。此外，多個宮頸癌預(yù)后生物標志物通過Wnt/βcatenin途徑發(fā)揮功能［18］。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵成員之一。本研究證明miR-874-3p負調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。而過表達GALNT4可部分逆轉(zhuǎn)miR-874-3p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖、CyclinD1、β-catenin蛋白表達的抑制作用，以及對細胞凋亡、Cleaved-Caspase-3蛋白表達的促進作用。表明miR-874-3p通過靶向GALNT4負調(diào)控Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑，抑制宮頸癌細胞增殖，促進其凋亡。

總之，本研究表明miR-874-3p在宮頸癌細胞系中表達下調(diào)，miR-874-3p可能充當(dāng)宮頸癌生長的腫瘤抑制因子，抑制宮頸癌細胞增殖，促進其凋亡，其機制與靶向GALNT4調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，為宮頸癌發(fā)展的潛在機制研究提供了新見解和治療策略。