腎臟類器官血管化的研究進(jìn)展

丁坤 ，管勇 ，孔峰 ，趙升田

1山東大學(xué)，山東濟(jì)南 250100；2山東省立醫(yī)院泌尿外科，山東濟(jì)南 250021；3山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿外科，山東濟(jì)南 250021

慢性腎臟?。–KD）指各種因素引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙，高血壓和糖尿病是重要的原因［1］，同時，伴隨著人口老齡化，其已經(jīng)呈現(xiàn)出流行的態(tài)勢［2］。除了作為心血管系統(tǒng)疾病、腦卒中等的危險因素外［3-4］，其進(jìn)展導(dǎo)致的終末期腎病（ESRD）也成為人口死亡的重要因素之一［5］。透析或腎臟移植是主要治療手段，然而透析需要定期進(jìn)行，長期治療可能導(dǎo)致諸如溶血［6］、炎癥綜合征［7］等并發(fā)癥，嚴(yán)重時可能危及生命；腎臟移植作為目前最為有效的腎臟替代治療方案，目前存在腎源緊張［8］、排斥反應(yīng)［9］等難點(diǎn)，這些都為CKD、ESRD的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。當(dāng)前，再生醫(yī)學(xué)成為ESRD治療的研究熱點(diǎn)，腎臟類器官作為其研究方向之一，獲得了廣泛關(guān)注，它是以體內(nèi)腎臟發(fā)育過程為指導(dǎo)，通過控制Wnt等多個信號通路［10］，以干細(xì)胞等作為種子細(xì)胞，經(jīng)歷自原條到腎祖細(xì)胞各個分化階段后構(gòu)建的3D細(xì)胞團(tuán)組織［11］。然而，現(xiàn)有的腎臟類器官在構(gòu)建過程的后期普遍存在內(nèi)部氧氣、營養(yǎng)分布不均的問題［12］，導(dǎo)致其無論在體積還是內(nèi)部結(jié)構(gòu)的成熟性都不足以應(yīng)用于再生領(lǐng)域，而血管化則是突破這些局限的重要因素?，F(xiàn)就腎臟類器官血管化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 體內(nèi)移植血管化

腎臟作為高度血管化的器官，接收全身約五分之一血流量，了解腎臟血管的來源，是促進(jìn)腎臟類器官血管化的重要一步。血管的產(chǎn)生包括血管新生和血管形成兩種形式［13］，目前多認(rèn)為，腎臟的血管來源具有雙重性：一方面，胚胎的腎間充質(zhì)自身便存在著血管前體細(xì)胞，其能夠通過分化、遷移等產(chǎn)生腎臟血管，這屬于“血管新生”的過程；另一方面，胚胎發(fā)育的過程中，一些來自外部的血管也會通過出芽等方式生長至腎臟內(nèi)部，即“血管形成”，并與腎內(nèi)的血管祖細(xì)胞共同形成腎臟血管系統(tǒng)［14］。

由于腎臟發(fā)育過程中血管存在雙重來源的機(jī)制，將培養(yǎng)后的類器官進(jìn)行體內(nèi)移植便有可能通過“血管形成”過程將其血管化。因此VAN DENBERG等［15］所在的研究團(tuán)隊(duì)使用人多能干細(xì)胞構(gòu)建腎臟類器官后，進(jìn)行了長期培養(yǎng)和體內(nèi)移植培養(yǎng)的對比試驗(yàn)。相較于體外的單純長期培養(yǎng)，移植入小鼠腎被膜的類器官在2周后出現(xiàn)了宿主來源的血管內(nèi)皮，且隨著培養(yǎng)時間的延長，其小管組織也開始成熟，內(nèi)皮亦出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)。此外，RYAN等［16］使用胚胎干細(xì)胞構(gòu)建腎臟類器官時，在培養(yǎng)早期，類器官內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)不斷增加的內(nèi)皮細(xì)胞，然而12 d后，內(nèi)部的血管結(jié)構(gòu)便開始減少，而被植入小鼠體內(nèi)的類器官則表現(xiàn)出良好的血管化。

除了將類器官進(jìn)行小鼠腎被膜下移植外，雞絨毛尿囊膜（CAM）也是良好的移植選擇。GARRETA等［17］將分化至第16天的類器官移植入CAM中維持5 d，發(fā)現(xiàn)類器官中出現(xiàn)多條肉眼可見的血管，且觀察到類似鮑曼囊和小管樣的結(jié)構(gòu)，提示類器官具有了一定程度的血管化并開始成熟化。由于CAM自身即是一種天然免疫缺陷環(huán)境，不需同腎被膜下移植一樣需要使用免疫缺陷小鼠，移植的過程相對而言更為經(jīng)濟(jì)且簡便。

另外，優(yōu)化移植前的培養(yǎng)方案，也可以促進(jìn)移植后的血管化。以往的腎臟類器官誘導(dǎo)方案中，每一步均是對所有細(xì)胞的同步誘導(dǎo)分化，但有研究認(rèn)為，這并不符合腎臟發(fā)育的自然過程，因?yàn)槟I臟發(fā)育并不是單一的時間線，而是祖細(xì)胞逐漸流入已分化的細(xì)胞群中繼續(xù)分化［18］。因此KUMAR等［19］提出將不同時段分化的前體細(xì)胞進(jìn)行混合后繼續(xù)培養(yǎng)的誘導(dǎo)方案，他們在細(xì)胞誘導(dǎo)第11天時，再次加入誘導(dǎo)第9天時獲取的腎祖細(xì)胞，通過異時相混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，前一批次細(xì)胞優(yōu)先分化為遠(yuǎn)端小管上皮和間質(zhì)細(xì)胞，后一批次則優(yōu)先分化為足細(xì)胞和近端小管。隨后他們將其進(jìn)行了體內(nèi)移植，相比普通誘導(dǎo)培養(yǎng)的類器官，混合培養(yǎng)后的類器官表現(xiàn)出更為廣泛的血管化，并具有更多的腎單位結(jié)構(gòu)，提示其成熟度的提升。

總體而言，體內(nèi)移植后的腎臟類器官有較好的血管化及成熟性，對比傳統(tǒng)培養(yǎng)有著極大的優(yōu)勢，改善了腎臟類器官進(jìn)行疾病模擬或藥理毒理驗(yàn)證時的效能。但是目前而言，其內(nèi)部的血管網(wǎng)絡(luò)尚不成熟，無法實(shí)現(xiàn)功能性的灌注，且仍不能達(dá)到近似成人腎臟的成熟度，因此暫時不能滿足再生醫(yī)學(xué)的需求。而移植前對類器官的培養(yǎng)方式等也會影響移植后類器官的血管化及發(fā)育程度，因此，單純依靠體內(nèi)移植進(jìn)行血管化可能并不足夠，在移植前進(jìn)行體外培養(yǎng)的調(diào)整或者體外部分血管化，可能會有助于獲得更為成熟的腎臟類器官［20］。

2 體外培養(yǎng)血管化

對比體內(nèi)移植的方案，體外培養(yǎng)環(huán)境缺乏體內(nèi)血流、因子作用等相關(guān)有利因素的影響，但也帶來了更為靈活的調(diào)整空間，能夠?yàn)轭惼鞴偬峁└鼮槎鄻拥呐囵B(yǎng)模式。因此，各研究團(tuán)隊(duì)采用多種方法嘗試調(diào)整體外構(gòu)建與培養(yǎng)方案，如對環(huán)境條件進(jìn)行模擬，或者對信號通路進(jìn)行更為精確的調(diào)控等，從而驗(yàn)證促進(jìn)其血管化的條件要素，進(jìn)一步完善培養(yǎng)方案，以通過“血管新生”等途徑在體外實(shí)現(xiàn)類器官血管化。

2.1 物理環(huán)境模擬 傳統(tǒng)靜態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)的類器官相比體內(nèi)移植的類器官而言，產(chǎn)生血管網(wǎng)絡(luò)的難度較大，而以往的報道指出，體液流動等帶來的剪切應(yīng)力與內(nèi)皮血管網(wǎng)絡(luò)的形成存在相關(guān)性［21-22］。因此，HOMAN等［23］在培養(yǎng)過程中引入流體控制系統(tǒng)，從而模擬腎臟發(fā)育時體液流動的環(huán)境。培養(yǎng)方案以微流控芯片作為類器官的載體，其上方為流動的培養(yǎng)基，為腎臟類器官提供流體剪切應(yīng)力環(huán)境。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過流體培養(yǎng)的類器官有了明顯的成熟化表現(xiàn)，出現(xiàn)了小管上皮和足細(xì)胞，并有類似血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)向腎小球結(jié)構(gòu)擴(kuò)張的現(xiàn)象，測定顯示其血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）的表達(dá)也顯著上調(diào)，這些都是有利于血管產(chǎn)生的因素。同樣，LEE等［24］所在的研究團(tuán)隊(duì)通過構(gòu)建腎臟類器官芯片，比較了在流體作用下腎臟類器官的發(fā)育情況，與HOMAN團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果相似，在流體剪切應(yīng)力的影響下，類器官內(nèi)出現(xiàn)了更為明顯的血管形成和足突狀結(jié)構(gòu)，提示其促進(jìn)了類器官的內(nèi)皮分化及成熟。由此可見，進(jìn)行體外培養(yǎng)時，模擬體內(nèi)臟器發(fā)育時的力學(xué)等物理因素具有促進(jìn)腎臟類器官成熟及血管化的潛力，這是既往單純的靜態(tài)培養(yǎng)條件下無法實(shí)現(xiàn)的效果。

2.2 細(xì)胞信號通路水平的精細(xì)化調(diào)控 隨著腎臟類器官體外培養(yǎng)方案的日益成熟，構(gòu)建簡單的類器官已經(jīng)不會有較大的困難，但培養(yǎng)方案大多無法控制類器官內(nèi)部單位的結(jié)構(gòu)組成，難以在體外產(chǎn)生更好的脈管結(jié)構(gòu)。由于發(fā)育中的腎單位，其結(jié)構(gòu)與βcatenin活性具有節(jié)段性相關(guān)，而Wnt信號通路能夠通過典型β-catenin信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)腎單位的形成［25］，因此LOW等［26］提出從細(xì)胞信號通路著手，嘗試通過調(diào)控類器官生長過程中的誘導(dǎo)信號強(qiáng)度，形成相對合適的腎單位結(jié)構(gòu)比例，從而產(chǎn)生血管。他們計劃性地使用GSK-3抑制劑CHIR99021控制Wnt通路，從而調(diào)節(jié)腎單位不同節(jié)段的誘導(dǎo)分化，使腎小球結(jié)構(gòu)所在的近端節(jié)段與小管結(jié)構(gòu)所在的遠(yuǎn)端階段達(dá)到最佳比例，保證其具有能夠自主維持一定水平VEGF-A的能力，從而在類器官中產(chǎn)生了血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)。將誘導(dǎo)過程進(jìn)行分節(jié)段精細(xì)化調(diào)控是腎臟類器官培養(yǎng)模式的一大突破，實(shí)現(xiàn)了對類器官分化結(jié)構(gòu)更為細(xì)致的可控性，這對于其他類器官的血管化誘導(dǎo)也具有參考意義。

2.3 結(jié)合生物材料的培養(yǎng)模式 隨著材料科學(xué)的進(jìn)步，生物材料的引入使得腎臟類器官的血管化有了新的突破。已有的研究證實(shí)，多能干細(xì)胞等種子細(xì)胞結(jié)合腎臟脫細(xì)胞支架后可以出現(xiàn)相應(yīng)分化，產(chǎn)生腎小球等結(jié)構(gòu)［27-29］，表明腎臟的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）可以為干細(xì)胞向腎單位結(jié)構(gòu)分化、成熟提供機(jī)械支持以及相應(yīng)的生化微環(huán)境。因此，KIM等［30］將豬腎進(jìn)行脫細(xì)胞處理后獲取的ECM制備成為水凝膠，并使用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行腎臟類器官的培養(yǎng)，通過與普通培養(yǎng)方式獲取的類器官相比，添加ECM后的腎臟類器官表現(xiàn)出了更為明顯的血管內(nèi)皮網(wǎng)，這一現(xiàn)象在加入VEGF后更為明顯，且ECM水凝膠促進(jìn)了腎小球結(jié)構(gòu)的血管化以及腎小管結(jié)構(gòu)的生成?？梢姡珽CM對于腎臟的發(fā)育成熟具有重要作用，在促進(jìn)腎臟類器官的血管化及成熟方面具有不小的優(yōu)勢。但需要注意的是，研究應(yīng)用的ECM是生物來源材料，制備耗時長，過程復(fù)雜，在大規(guī)模應(yīng)用中存在限制。而目前的研究僅是將腎臟ECM作為整體進(jìn)行相關(guān)的培養(yǎng)試驗(yàn)，對于不同位點(diǎn)促進(jìn)細(xì)胞向腎單位不同結(jié)構(gòu)分化的細(xì)胞通路等機(jī)制尚不能完全明確，這也就不能為理想的人工合成ECM材料提供更加有效的參考信息，所以相關(guān)的機(jī)制需要后續(xù)研究進(jìn)一步闡明。

2.4 生物3D打印的潛力 生物3D打印技術(shù)是近些年組織工程學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，因其能夠通過受控沉積進(jìn)行復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，相比通過誘導(dǎo)產(chǎn)生血管網(wǎng)絡(luò)而言，其具有效率高、可控性強(qiáng)等優(yōu)勢，短時間內(nèi)即可完成類似“血管新生”的過程并形成灌注。因此，有關(guān)3D打印構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)的研究正在不斷推進(jìn)，目前主要通過使用含有特定細(xì)胞的生物墨水在水凝膠等材料中進(jìn)行血管等組織的“打印”，已有一些團(tuán)隊(duì)證實(shí)了3D打印血管結(jié)構(gòu)的可行性［31-32］。SINGH等［33］以ECM為基礎(chǔ)，分別制備含有腎近端小管上皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生物墨水，進(jìn)行了血管化近端腎小管芯片的打印，對打印后的組織芯片培養(yǎng)后進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，其具備了較好的成熟標(biāo)記物表達(dá)，將其進(jìn)行小鼠腎被膜下移植后，也出現(xiàn)了宿主來源的血管化，提示其構(gòu)建的有效性。需要注意的是，目前的相關(guān)研究以實(shí)現(xiàn)簡單原理式構(gòu)型打印為主，雖然有團(tuán)隊(duì)通過3D打印進(jìn)行了可重復(fù)性批量小型腎臟類器官的制備［34］，但其仍未能達(dá)到理想的血管化程度。受限于腎單位及其周圍血管復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)、打印體積的限制等，當(dāng)前對于更為復(fù)雜的大體積血管化腎臟類器官的打印尚未實(shí)現(xiàn)，但這一技術(shù)具備的巨大潛力不可忽視，隨著高精度生物3D打印技術(shù)的發(fā)展，其未來可能具有最大的優(yōu)勢。

3 結(jié)語

人口老齡化的加劇，高血壓、糖尿病等慢性病患病率不斷上升，導(dǎo)致全球CKD和ESRD患者數(shù)量不斷增長，給患者的健康和保健醫(yī)療機(jī)構(gòu)帶來巨大的壓力。近些年來腎臟類器官的出現(xiàn)是腎臟再生醫(yī)學(xué)的里程碑，而人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的出現(xiàn)，為類器官提供了豐富的種子細(xì)胞，也使得降低免疫排斥等風(fēng)險成為可能。腎臟類器官具有治療CKD、ESRD的巨大潛力，對于腎臟的再生醫(yī)學(xué)有著重要意義。但是目前的腎臟類器官還無法完全滿足這些需求，組織結(jié)構(gòu)的不成熟性、缺乏完善的血管灌注等，都限制了其進(jìn)一步發(fā)揮作用，因此，越來越多的研究開始致力于解決這些問題。

本文總結(jié)了近幾年來常見的腎臟類器官血管化的研究方案，就總體上看，將類器官進(jìn)行體內(nèi)移植依然是實(shí)現(xiàn)血管化最為有效的方式，但是其仍難以達(dá)到理想的血管化程度，可能需要體外培養(yǎng)的輔助，其距離投入臨床應(yīng)用還有很長的路要走。體外血管化方案雖然相對簡便，并且對類器官的生長培養(yǎng)環(huán)境有著極為靈活的可操作性，但目前已有的方案中，其形成的脈管網(wǎng)絡(luò)尚未能證實(shí)存在有效的血液灌流，3D打印雖然擁有解決這一問題的潛力，但其研究仍處于起步階段，這些都是當(dāng)下類器官體外培養(yǎng)需要面對的挑戰(zhàn)。

隨著干細(xì)胞技術(shù)水平的進(jìn)步，培養(yǎng)設(shè)備技術(shù)的更新，醫(yī)學(xué)新突破的不斷出現(xiàn)，腎臟類器官的研究將會被逐步向前推進(jìn)，直到具有理想結(jié)構(gòu)與功能性的類器官真正出現(xiàn)。在老齡人口不斷增加、患病人數(shù)不斷增長的現(xiàn)狀下，這將會為人類對于腎臟疾病的研究，新藥的研發(fā)，CDK、ESRD的治療帶來有力的支持，為再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)步提供源源不斷的動力。