營養(yǎng)小肽對黃金鯽血清生化指標(biāo)、腸和肝組織的影響

胡 賀，陳 鵬，萬 兵，袁 化

(1.江蘇福潤德科技有限公司，江蘇 南京 210036；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210036；3.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023)

黃金鯽(Carassiusauratus)是我國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖魚類鯉、鯽的雜交品種。該雜交組合具有雜交鯉鯽最好的雜種優(yōu)勢，生長速度超快(是普通鯽的2～3倍)、適應(yīng)性強(qiáng)、食性雜、抗病力強(qiáng)、飼料轉(zhuǎn)化率高、含肉率高、營養(yǎng)價值豐富，是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部向全國推廣養(yǎng)殖的淡水魚類品種。

蛋白質(zhì)在體內(nèi)代謝的最終分解產(chǎn)物是小肽和氨基酸，營養(yǎng)小肽能以完整形式直接被機(jī)體吸收[1]，具有提高養(yǎng)殖動物餌料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長，提高生產(chǎn)性能等作用[2-5]。

試驗選擇江蘇省東臺市弶港鎮(zhèn)養(yǎng)殖區(qū)，以養(yǎng)殖黃金鯽為試驗動物。在基礎(chǔ)飼料中添加營養(yǎng)小肽，經(jīng)投喂養(yǎng)殖128 d后，隨機(jī)抽樣檢測血清生化指標(biāo)、腸(前腸)和肝組織。通過觀察添加營養(yǎng)小肽后黃金鯽血清生化指標(biāo)的變化，以及腸和肝組織的組織結(jié)構(gòu)，探討營養(yǎng)小肽作為飼料添加劑對養(yǎng)殖黃金鯽健康的影響，為營養(yǎng)小肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基礎(chǔ)飼料和營養(yǎng)小肽

基礎(chǔ)飼料為混養(yǎng)魚配合飼料，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)Q/320924 YCHD 001-2021。產(chǎn)品成分分析執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 18823，粗蛋白≥28.0%，粗脂肪≥2.5%，賴氨酸≥1.35%，水分≤12.2%，粗纖維≤11.5%，粗灰分≤15.0%，總磷≥0.7%。

營養(yǎng)小肽為江蘇福潤德科技有限公司產(chǎn)品，商品名為天樂泰(SBP)。該產(chǎn)品以豆科植物為原料，選用四聯(lián)菌分階段式密閉深層發(fā)酵，通過生物發(fā)酵和物理處理等工藝消除抗?fàn)I養(yǎng)因子,同時保留豐富的不飽和脂肪酸，并充分分解釋放不同肽段，為營養(yǎng)小肽類產(chǎn)品。產(chǎn)品部份檢測指標(biāo)為：粗纖維0.9%，粗脂肪1.5%，粗蛋白4.32%，酸溶蛋白(占總蛋白)33.5%，水蘇糖和棉子糖均未檢出，活菌數(shù)：乳桿菌22.6×107CFU/g、酵母1.02×107CFU/g、芽孢桿菌105CFU/g，pH值 3.5。

1.2 試驗魚養(yǎng)殖與管理

試驗在江蘇省東臺市弶港鎮(zhèn)養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行，設(shè)2個試驗組和1個對照組。在苗種放養(yǎng)7 d后，對照組投喂基礎(chǔ)飼料，試驗組投喂添加營養(yǎng)小肽(天樂泰)的飼料。魚種放養(yǎng)時的平均體重50 g/尾。

試驗組營養(yǎng)小肽(天樂泰)添加量為基礎(chǔ)飼料重量的2.0%。每天投喂前用自來水將天樂泰溶解，充分混合后，在基礎(chǔ)飼料中均勻噴灑，待表面干燥后投喂。投飼量均按魚體重2.0%～3.0%計算。每天投喂4次，投喂時間為7:00、10:00、13:30和16:30。養(yǎng)殖期間水溫26～33 ℃，溶氧控制在3.5～8.3 mg/L，pH值8.5～8.8。

投飼養(yǎng)殖128 d后，試驗組和對照組隨機(jī)取樣黃金鯽10尾，進(jìn)行體重、體長和體高檢測，觀察黃金鯽的生長情況。

1.3 血清制備

試驗組和對照組隨機(jī)取樣黃金鯽各5尾，一次性注射器尾靜脈取血(無抗凝劑)，4 ℃靜置24 h后，2 500 r/min，-5 ℃離心5 min，取上層血清，-20 ℃保存，備用。

生化檢測儀為羅氏cobas C311全自動生化分析儀。檢測指標(biāo)為總蛋白(TP2)、白蛋白(ALB2)、堿性磷酸酶(ALP2L)、脂肪酶(LIPC)、血糖(GLUC3)和尿素氮(U-BUN)。

1.4 組織學(xué)觀察

試驗組和對照組隨機(jī)取樣黃金鯽各5尾，進(jìn)行解剖觀察，分別取前腸和肝組織。前腸以腸道開口處為起點(diǎn)至第一個回折處之間的部分，切取0.5～1.0 cm組織。肝組織取肝臟中間部分，修切0.5×0.5 cm組織。純凈水沖洗，浸泡4.0%甲醛溶液，固定24 h后，更換甲醛溶液(4.0%)，備用。

組織切片采用美國賽默飛公司全自動組織脫水機(jī)(Excelsior AS)，染色機(jī)(Gemini AS)，包埋機(jī)(Histo STAS)和切片機(jī)(HM 325)完成。切片厚度4～5 μm，HE染色，中性樹膠封片，Olympus光學(xué)顯微鏡觀察，顯微照片記錄。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以Excel整理，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示。采用GraphPad prisn 8.0軟件進(jìn)行方差分析和多因素比較分析，P≤0.01差異極顯著，0.01

2 結(jié)果

2.1 黃金鯽生長情況

在基礎(chǔ)飼料中添加2.0%天樂泰，經(jīng)128 d養(yǎng)殖，試驗組體重大于對照組(0.01

表1 添加營養(yǎng)小肽養(yǎng)殖128黃金鯽生長情況 (n=10)

2.2 血清生化指標(biāo)

在基礎(chǔ)飼料中添加營養(yǎng)小肽(天樂泰)投喂黃金鯽128 d后，試驗組間血清總蛋白無顯著差異(P≥0.05)，試驗Ⅰ組與對照組差異極顯著(P≤0.01), 試驗Ⅱ組與對照組無顯著差異(P≥0.05)；試驗Ⅰ組血清白蛋白與對照組差異極顯著(P≤0.01)，試驗Ⅱ組與對照組無顯著差異(P≥0.05)；試驗組與對照組、試驗組間血清堿性磷酸酶、脂肪酶和尿素氮均無顯著差異(P≥ 0.05)；試驗組與對照組間血清血糖有極顯著差異(P≤0.01)，試驗組間無顯著差異(P≥0.05)。見表2。

表2 營養(yǎng)小肽對黃金鯽血液生化指標(biāo)的影響 (n=5)

2.3 腸組織結(jié)構(gòu)觀察

解剖觀察：腸道緊連食道之后，管徑逐漸變細(xì)，前、中、后腸分界不明顯，呈粉色。

組織結(jié)構(gòu)觀察：試驗組前腸組織各層顯示清晰，由內(nèi)向外依次為黏膜層(A)、黏膜下層(B)、肌層(C)和漿膜層(D)。黏膜層是消化管的最內(nèi)層，有許多向腸腔凸出的腸絨毛組成，腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰，絨毛層非常豐厚。肌層有內(nèi)層環(huán)肌(F)和外層縱肌(E)兩層平滑肌組成。腸的外表均覆一層漿膜。試驗組兩層平滑肌結(jié)構(gòu)排列緊密，內(nèi)層環(huán)形肌層較為發(fā)達(dá)，外層縱行肌層則比較薄。黏膜下層與肌層之間的基底層(H)結(jié)構(gòu)清晰，明顯較厚且致密(見封三圖1a)。黏膜層的上皮層有單層柱狀上皮細(xì)胞(M)構(gòu)成，其間散布少量杯狀細(xì)胞(N)，上皮層下的固有層(L)清晰可見(見封三圖1b)。

對照組內(nèi)環(huán)肌(f)和外縱肌(e)結(jié)構(gòu)排列疏松，黏膜下層與肌層之間的基膜結(jié)構(gòu)不清晰(h)，固有層和黏膜下層細(xì)胞成分增多(b)(見封三圖1c)。

2.4 肝組織結(jié)構(gòu)觀察

肝臟形態(tài)觀察：肝臟大小形態(tài)正常，呈鮮亮的暗紅色，緊貼腸系膜上，胰腺彌散性地分布在肝臟組織中，膽囊與肝臟相連。

組織結(jié)構(gòu)觀察顯示：肝組織結(jié)構(gòu)較清晰，肝細(xì)胞形狀較規(guī)則(A)，呈略帶圓形的多角形，細(xì)胞核1個，核仁清晰，位于細(xì)胞中間，細(xì)胞界限分明，細(xì)胞質(zhì)HE紅染。肝細(xì)胞圍繞中央靜脈(C)呈放射狀排列，成串形成肝索樣結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞間可見肝血竇(B)，中央靜脈和血竇中可見血細(xì)胞(見封三圖2)。

3 討論

3.1 營養(yǎng)小肽對黃金鯽血清生化指的影響

魚類的血液與機(jī)體代謝、營養(yǎng)狀況和疾病有著密切的關(guān)系，是重要的生理、病理和營養(yǎng)評價的指標(biāo)[6]。血清指標(biāo)與營養(yǎng)狀況密切相關(guān)，不僅反映魚類的生理代謝狀態(tài)，還可以闡明營養(yǎng)對機(jī)體代謝變化的作用機(jī)制。血清總蛋白是反映動物的營養(yǎng)水平和動物對蛋白質(zhì)的消化程度，以及魚的健康狀況的指標(biāo)[6-7]。血清白蛋白是由肝實質(zhì)細(xì)胞合成，具有維持血漿滲透壓和pH的平衡，作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)被運(yùn)輸物質(zhì)的生理作用。當(dāng)營養(yǎng)狀況良好時，血清蛋白維持在較高的水平。檢測數(shù)據(jù)分析，血清總蛋白含量試驗組為(28.26±1.37)g/L和(25.54±3.41)g/L，對照組(25.20±0.92)g/L，均低于硬骨魚類血清總蛋白含量30～50 g/L范圍[6]。由于黃金鯽生長速度高于普通鯽2～3倍，基礎(chǔ)飼料28%的粗蛋白和營養(yǎng)小肽(天樂泰)2%的添加量，沒有滿足35%飼料蛋白的需求量[8]。營養(yǎng)小肽(天樂泰)作為飼料添加劑，對于不同的基礎(chǔ)飼料和養(yǎng)殖魚類的添加量還有待深入研究。

血清堿性磷酸酶主要來源于肝臟、腸道和骨骼等組織，是動物生長和生存的重要調(diào)控酶，其活性在一定程度上反映了動物的生長速度[9-10]。試驗組血清堿性磷酸酶均低于對照組，結(jié)合黃金鯽形體指標(biāo)檢測結(jié)果(表1)，試驗Ⅰ組與羅莉等[10]堿性磷酸酶活性與動物的生長呈正相關(guān)理論相符合，而試驗Ⅱ組與之相反。試驗組間的差異是否與取樣有關(guān)，還有待繼續(xù)跟綜檢測。

魚類的肝胰腺是生成脂肪酶的主要器官。脂肪酶的活性與餌料中的脂肪含量呈正相關(guān)[11-13]。脂肪含量高的食物會增加脂肪酶活性，而攝食脂肪含量低的食物，則脂肪酶的活性也隨之降低。試驗組血清脂肪酶平均值略高于與對照組，多重比較無顯著差異(P≥0.05)，反映了黃金鯽的脂質(zhì)代謝狀況良好，處于健康水平。

血糖是反映糖代謝和機(jī)體組織細(xì)胞功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，同時也反映餌料和營養(yǎng)的合理性[14]。在基礎(chǔ)飼料中添加2%營養(yǎng)小肽(天樂泰)后，試驗組血糖值均高于對照組，多重比較顯示，試驗組間無顯著差異(P≥ 0.05)，試驗組與對照組比較均有極顯著差異(P≤0.01)。分析認(rèn)為，低蛋白的飼料中碳水化合物的比例相對較高，養(yǎng)殖動物為攝食足量的蛋白質(zhì)而加大攝食量，間接增加了碳水化合物的攝入量，導(dǎo)致血糖水平的升高[15-16]。

血清中尿素氮水平反映了肝臟和腎臟功能，以及體內(nèi)蛋白質(zhì)分解和沉積情況[17-18]。試驗結(jié)果顯示試驗組血清尿素氮平均值均低對照組。試驗結(jié)果與小肽可以減少尿素在腎臟中的沉積，提高動物機(jī)體蛋白質(zhì)的沉積率的研究結(jié)果一致[19]。營養(yǎng)小肽(天樂泰)促進(jìn)了氨基酸的吸收，提高了蛋白質(zhì)沉積率作用。

3.2 營養(yǎng)小肽對黃金鯽腸組織的影響

黃金鯽攝食添加營養(yǎng)小肽(天樂泰)飼料128 d后，在一定程度上對黃金鯽的腸道結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。試驗組兩層平滑肌結(jié)構(gòu)排列緊密，對照組內(nèi)環(huán)肌和外縱肌結(jié)構(gòu)排列疏松。環(huán)肌的波狀收縮形成腸的蠕動，縱肌的舒縮形成腸的擺動。因此，試驗組前腸的腸壁收縮力強(qiáng)，有助于食物的混勻和運(yùn)輸。試驗組黏膜層的上皮層單層柱狀上皮細(xì)胞豐富，其間散布杯狀細(xì)胞。對照組單層柱狀上皮細(xì)胞排列緊密，杯狀細(xì)胞極少。杯狀細(xì)胞能分泌黏液和消化酶，柱狀上皮細(xì)胞具有吸收作用，黏膜褶的增多，表現(xiàn)出較大吸收面積，有助于食物的消化和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。黏膜下層由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，是腸黏膜的支柱，同時有利于腸壁相應(yīng)的擴(kuò)張，將營養(yǎng)物質(zhì)由此輸入血液并到達(dá)全身。試驗組黏膜下層與肌層之間的基底層結(jié)構(gòu)清晰，且致密。對照組黏膜下層與肌層之間的基膜結(jié)構(gòu)不清晰，固有層和黏膜下層細(xì)胞成分增多，有待于擴(kuò)大樣本的檢測量，進(jìn)一步研究探討。

3.3 營養(yǎng)小肽對黃金鯽肝胰腺組織的影響

試驗組黃金鯽肝臟表面被漿膜，大小形態(tài)正常，呈鮮亮的暗紅色。試驗組肝胰腺組織結(jié)構(gòu)較清晰，密集形成網(wǎng)狀，肝細(xì)胞呈略圓形的多角形，細(xì)胞界限分明。細(xì)胞核1個，核仁清晰，位于細(xì)胞中間。細(xì)胞質(zhì)豐富，HE紅染。肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，成串形成肝索樣結(jié)構(gòu)，每2～3層肝細(xì)胞間可見肝血竇，中央靜脈和血竇中可見血細(xì)胞。在飼料中添加營養(yǎng)小肽(天樂泰)有助于養(yǎng)殖黃金鯽營養(yǎng)的吸收，健康狀態(tài)良好。

通過對黃金鯽血清生化指標(biāo)、腸和肝組織病理觀察。在基礎(chǔ)飼料中添加2%營養(yǎng)小肽(天樂泰)，有助于食物的消化，促進(jìn)了氨基酸的吸收，提高了蛋白質(zhì)的合成，反映出黃金鯽良好營養(yǎng)狀況和健康水平。營養(yǎng)小肽(天樂泰)作為養(yǎng)殖魚類飼料添加劑，具有良好的促生長效果，無殘留，無抗藥性和無污染的優(yōu)勢，是作為綠色飼料添加劑的首選。