一株托拉斯假單胞菌(Pseudomonas tolaasii) G86的鑒定及其對亞硝酸鹽的降解作用

劉金珂，何忠偉，劉玉峰，殷 蕊，孫桂清，宮春光

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 海洋學院，河北 秦皇島 066000；2.河北省渤海魚類種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院 北戴河中心實驗站，河北 秦皇島 066100；3.河北省海洋與水產(chǎn)科學研究院，河北 秦皇島 066200)

近年來已發(fā)現(xiàn)的具有降解亞硝酸鹽能力的細菌包括芽孢桿菌屬、副球菌屬、假單胞菌屬等[1-4]的一些種類。已發(fā)現(xiàn)的可降解亞硝酸鹽的菌株往往存在性能不穩(wěn)定、受環(huán)境理化條件影響大(特別是溶氧水平)以及可能造成硝酸鹽累積等特點，多數(shù)并沒有大規(guī)模在養(yǎng)殖生產(chǎn)上應(yīng)用，僅在小試規(guī)模試驗上偶有一些使用。本文通過篩選虹鱒養(yǎng)殖池底泥微生物分離得到一株托拉斯假單胞菌(Pseudomonastolaasii)，該菌株可以較好地減少水體中的亞硝酸鹽氮含量，本試驗為養(yǎng)殖生產(chǎn)減少亞硝酸鹽氮對魚蝦的危害提供一種新的可選方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

培養(yǎng)基及配套試劑購自青島海博生物技術(shù)有限公司。在河北邯鄲某虹鱒養(yǎng)殖場養(yǎng)殖池均勻選取5個采樣點，每點分別采集底泥后混合在一起，養(yǎng)殖水體溫度為10 ℃。樣品采集后以冰水浴保存立即轉(zhuǎn)移至實驗室進行后續(xù)分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品中微生物的分離純化 用蒸餾水沖洗樣品袋外表，再用70%乙醇擦拭后，在超凈臺中打開。用滅菌的藥勺盡量均勻地從樣品袋內(nèi)5個點分別取一勺底泥，加入預(yù)先滅菌的液體三角瓶培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉 10 g/L，pH調(diào)至7.2)，在10 ℃搖床過夜培養(yǎng)。第二天從三角瓶中無菌吸取1 mL培養(yǎng)液，涂布至LB平板上，在10 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后根據(jù)菌落特征分別挑取單菌落，每種菌落挑取一個，再涂布于LB平板，做純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)24 h后送上海邁浦生物科技有限公司進行16S rRNA測序。擴增區(qū)域為16Sr RNA基因的全長序列，擴增長度為1 500 bp。擴展使用引物為：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1 492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。用DNA Sequencing analysis軟件分析測序結(jié)果，用Sequencing Analysis 5.2.0軟件進行解讀，結(jié)果進入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行比對。使用MEGA11的Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 生長特性 對得到的菌株進行搖瓶試驗，確定其基本的營養(yǎng)需求和生長所需的理化條件。以亞硝酸鈉為唯一氮源，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖分別作為碳源，pH值設(shè)6、7、8三個梯度，溫度設(shè)8、10、12 ℃三個梯度，轉(zhuǎn)速設(shè)150、180、210 r/min三個梯度，采用正交試驗方法，以培養(yǎng)48 h的有效活菌數(shù)作為判定指標。

1.2.3 減氮能力檢驗 以亞硝酸鈉為唯一氮源，亞硝酸鈉初始含量為200 mg/L，在500 mL搖瓶中裝入100 mL培養(yǎng)液，分別在第18、24、30、36、42 小時和48 小時測定亞硝酸氮和總氮含量，使用以下公式計算對氮的去除效率：

亞硝酸鹽氮去除效率(%)= 100×(初始亞硝酸鹽氮含量-終末亞硝酸鹽氮含量)/初始亞硝酸鹽氮含量；

總氮去除效率(%)= 100×(總氮含量-終末總氮含量)/初始總氮含量。

總氮用堿性過硫酸鉀消解法測定，亞硝酸鹽氮用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定，分別做三個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 菌種分離及鑒定結(jié)果

從樣品中共分離到12株菌，其中一株經(jīng)16S rRNA測序并與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫比對后，構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示其與托拉斯假單胞菌MW326021(Pseudomonastolaasii)和淺黃色假單胞菌MH669334(Pseudomonaslurida)最相似(圖1)，相似度分別為99.58%和99.51%。根據(jù)樣品中菌株分離順序?qū)⒈局昃幪枮镚86。顯微鏡下G86為桿菌，革蘭氏陰性，不生成芽孢。在LB平板上菌落粗糙，土黃色，邊緣不整齊，不產(chǎn)色素。生理生化試驗顯示，G86能利用內(nèi)消旋肌醇、L-纈氨酸、β-丙氨酸、山梨醇、中性酒石酸鹽、鹽酸，部分利用海藻糖、2-酮基葡萄糖酸、L-阿拉伯糖、核糖醇和乙醇，過氧化酶和氧化酶陽性(表1)。根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果，查閱伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊[5]，菌株G86和托拉斯假單胞菌高度相似，結(jié)合16S rRNA比對結(jié)果，確定G86為托拉斯假單胞菌。

表1 G86生理生化鑒定結(jié)果

圖1 G86的系統(tǒng)進化樹(MEGA11)

2.2 生長特性

根據(jù)3水平4因素正交試驗結(jié)果(表2)，確定G86的最適生長條件為：pH值 6，溫度10 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，此條件下有效活菌數(shù)可達到9.2×108CFU/mL。

表2 托拉斯假單胞菌G86的正交試驗設(shè)計表

2.3 減氮能力

以上述最優(yōu)條件搖瓶培養(yǎng)G86，測得不同時間培養(yǎng)液中亞硝酸鹽氮和總氮去除率，變化曲線見圖2。結(jié)果顯示，以亞硝酸鈉為唯一氮源，72 h對總氮和亞硝酸鹽氮的去除率分別為33.05%和31.85%。

圖2 接種G86后總氮和亞硝酸鹽氮的去除能力

3 分析與討論

水體中氨氮和亞硝酸鹽氮過高是造成水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體質(zhì)下降的重要原因之一，科研工作者一直在尋找高效、安全的解決方案。近年來已有很多學者對硝化和反硝化細菌進行了研究。王珺等[6]從污水底泥篩選到淺黃色假單胞菌，具氨氮降解率可達到96.4%。而淺黃色假單胞菌和托拉斯假單胞菌的16S rRNA序列相似度超過99%，表明此屬細菌中可能含有具反硝化能力的基因或基因群，今后可加大對此屬菌株降解氨氮能力的識別和開發(fā)。何騰霞等[7]從土壤中分離到一株托拉斯假單胞菌，48 h對亞硝酸鹽氮和總氮的去除率分別為100%和61.28%。新發(fā)現(xiàn)的具有降解氨氮能力的菌株很多營好氧生活，這對于在養(yǎng)殖生產(chǎn)上的擴培是有利的，但是從與養(yǎng)殖對象競爭氧氣的角度來講，這又是不利的一面。而周敏等[8]從污水混合樣品中分離到的大山芽孢桿菌，可在3 h將水體中的亞硝酸鹽從0.6 mg/L降低到0.0 mg/L。以上研究說明在自然界中存在著較多的能夠降低總氮和亞硝酸鹽氮濃度的菌株，這些菌株多具有開發(fā)成降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑產(chǎn)品的價值。

4 結(jié)論

通過顯微形態(tài)、16S rRNA基因序列比對，本試驗分離的菌株G86為托拉斯假單胞菌(Pseudomonastolaasii)。該菌株的最適生長條件為：溫度10 ℃、pH值 6、轉(zhuǎn)速180 r/min，在48 h對總氮和亞硝酸鹽氮的去除率分別為33.05%和31.85%。該菌株具有在有氧條件下去除亞硝酸鹽氮的能力，可以作為養(yǎng)殖生產(chǎn)上降解亞硝酸鹽的備選菌株，具有一定開發(fā)潛力。本研究中，菌株G86對氮的去除率低于其他文獻報道，可能是本次試驗沒有找到最適的接種量、接種時間和培養(yǎng)條件，下一步研究將更多考慮可能影響托拉斯假單胞菌株G86去除亞硝酸鹽氮的環(huán)境因素，以期找到適用于養(yǎng)殖生產(chǎn)的最優(yōu)使用方案。