柳葉臘梅葉乙醇提取物成分分析及其體外抗氧化研究

趙梓桐，李景恩，張清峰，趙 猛，韓 藝，何 靜，張 陽，王文君

（江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌 330045）

【研究意義】柳葉臘梅是我國特有的臘梅屬植物中的一個種，半常綠灌木[1]，主要分布于我國的江西省、浙江省、湖南省、安徽省、福建省，在一些地區(qū)又被稱為黃金茶、食涼茶等[2-4]。柳葉臘梅包含多種生物活性成分，根據(jù)古籍記載，柳葉臘梅有清熱解毒、健胃消食、祛風解表、芳香化濕之效[5]。近些年的研究表明，柳葉臘梅具有抗氧化[6]、降血脂[7]、降血糖[8]、保肝[9]、抑菌[10]等作用。黃酮類化合物作為柳葉臘梅中重要的生物活性物質(zhì)之一，被認為是促進人體健康的化學成分，但是關(guān)于柳葉臘梅葉中黃酮類化合物的報道較少。分析柳葉臘梅葉總黃酮中單體成分，確定出主要抗氧化活性物質(zhì)，為柳葉臘梅的開發(fā)提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】黃酮類化合物幾乎存在于每種植物所有部位中，通常情況下，植物的花、果、葉中含量較高，并且常以游離態(tài)（苷元）或與糖結(jié)合成苷（包括O-糖苷或C-糖苷兩種苷類）或者與鞣酸結(jié)合成酯的形式存在?，F(xiàn)在的黃酮類化合物是泛指具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的一類化合物。黃酮類化合物具有多種活性功能，Cheng等[11]研究結(jié)果表明黃酮類化合物具有良好的抗氧化和抑菌作用；Huang等[12]通過細胞實驗，表明黃酮類化合物可以有效抑制癌細胞的遷移和入侵；Chen 等[8]通過山臘梅乙醇提取物對糖尿病模型小鼠的研究，結(jié)果顯示山臘梅乙醇提取物顯著改善了糖尿病小鼠的脂代謝相關(guān)指標和糖耐量異常；黃酮類化合物對非酒精性脂肪肝的預(yù)防和改善同樣具有良好的作用[13]?！颈狙芯壳腥朦c】柳葉臘梅葉中富含黃酮類化合物，但其具體黃酮單體物質(zhì)及單體物質(zhì)所占含量還有待分析，清除自由基的主要活性成分也有待確定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文利用LC-MS 和HPLC 兩種方法鑒定出柳葉臘梅葉乙醇提取物中含有的主要成分及含量。對柳葉臘梅葉乙醇提取物的體外抗氧化活性進行測定，并且確定出清除自由基的主要活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：柳葉臘梅葉，購于浙江麗水經(jīng)銷商。

試劑：甲醇和乙腈（HPLC 級，美國TEDIA 公司），蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、木犀草素-5-O-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、山奈酚標準品（＞98%，HPLC 級，北京Solarbia 科技有限公司），阿福豆苷（＞98%，HPLC 級，上海源葉生物科技有限公司）,其他化學試劑（分析純，當?shù)鼗瘜W試劑供應(yīng)商）。

1.2 儀器與設(shè)備

FBL-100 型高速粉碎機（上海菲力博食品機械有限公司），HF-20B 型超聲循環(huán)提取機（北京宏祥隆生物科技公司），RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），Scientz-10N 冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司），M2 型酶標儀（美國Molecular Device 公司），Agilent 1260 Infinity液相色譜儀（安捷倫科技公司），AB SCIEX Triple TOF 5600+（美國SCIEX公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 柳葉臘梅葉乙醇粗提物制備 柳葉臘梅葉經(jīng)打粉機粉碎后過60目篩，稱取1 kg粉末，在體積分數(shù)為60%的乙醇中浸泡過夜。次日，參照陳慧[14]的研究稍作修改，以超聲時間60 min，超聲功率為1 500 W，料液比為1∶20（g/mL）及超聲溫度60 ℃的條件對柳葉臘梅粗黃酮進行提取，收集濾液，將濾渣按照上述條件再次提取，合并兩次濾液。將合并后的濾液抽濾后，減壓濃縮得到柳葉臘梅粗黃酮濃縮液，冷凍干燥后，干燥器中保存。

1.3.2 柳葉臘梅乙醇粗提物的分離純化 將聚酰胺樹脂按照陳慧[14]進行裝柱活化，將1.3.1 中收集到的粗黃酮粉末用蒸餾水復(fù)溶，從裝好聚酰胺樹脂的層析柱上端緩緩加入，待樣品吸附至飽和，先用水洗脫和30%乙醇洗脫，再用60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫的洗脫液（即為柳葉臘梅葉總黃酮），55 ℃減壓濃縮，冷凍干燥，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 柳葉臘梅葉總黃酮含量的測定（1）標準曲線的制作。根據(jù)參考文獻[14]稍作修改，用60%乙醇水溶液配制濃度為1 mg/mL 的蘆丁標準品溶液。精確吸取0.1，0.5，1，1.5，2，2.5，3 mL的標準溶液，分別置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min，最后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，取200 μL，用酶標儀在510 nm 測吸光度。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，可得回歸方程：Y=6.222 5X-0.035 4，R2=0.996 3，標準曲線的線性范圍為0.004～0.120 mg/mL。以蘆丁的標準溶液的濃度為橫坐標，以測得相應(yīng)的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

（2）柳葉臘梅葉總黃酮含量的測定。60%乙醇溶解樣品，按照蘆丁標準曲線的顯色方法顯色，測定吸光度，計算柳葉臘梅總黃酮的含量，公式如下：

式中，W為總黃酮的百分含量；c為總黃酮的濃度；m為樣品質(zhì)量。

1.3.4 LC-MS 分析 樣品處理：用水將樣品稀釋至適當濃度，13 000 r/min 高速離心10 min，取0.5 mL 上清液移至1.5 mL自動進樣瓶，備用。

HPLC 條件：C18 色譜柱（75 mm×2.1 mm×2 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：1 μL；流動相：0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）系統(tǒng)；梯度洗脫條件：0～15 min，5～40% A；15～30 min，40～95% A；30～32 min，95～95%A；32～35 min，95～5%A；檢測波長：DAD全波長掃描190～400 nm。

LC-MS條件：負離子模式；ESI源；CUR：400.000 psi；GS1：50.000 psi；GS2：50.000 psi；ISVF：4 500.000 V；TEM：500 ℃。

1.3.5 HPLC 分析 甲醇溶解樣品，經(jīng)0.22 μm 的有機濾膜過濾，備用。色譜條件：C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸超純水（B）系統(tǒng)；梯度洗脫條件：0～15 min，10～25%A；15～30 min，25～40%A；30～40 min，40～50%A；檢測波長：254 nm。

1.3.6 柳葉臘梅葉總黃酮體外抗氧化能力檢測

1.3.6.1 DPPH· 用無水乙醇配制0.3 mmol/L DPPH·溶液，柳葉臘梅總黃酮配制成不同濃度（20，40，60，80，100，120 μg/mL）。以96 孔板為反應(yīng)載體，517 nm 測定吸光度，具體實驗操作參照實驗體系表（表1）進行，各組實驗均重復(fù)測定3次，Vc做陽性對照，根據(jù)公式計算自由基清除率。

表1 體外DPPH·清除試驗體系表Tab.1 Test system of DPPH· scavenging activities in vitro μL

式中，A0為乙醇溶液為空白對照測定吸光度值；A1為樣品組或陽性對照組測定吸光度值；A2為樣品本身對照組測定吸光度值。

1.3.6.2 ABTS+分別配制7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液，等體積混合均勻，室溫避光過夜，根據(jù)吸光度用無水乙醇稀釋20～40倍至吸光度為0.7±0.02，即為ABTS+工作液。柳葉臘梅總黃酮配制成不同濃度（20，40，60，80，100，120 μg/mL）。以96 孔板為反應(yīng)載體，734 nm 測定吸光度，具體實驗操作參照實驗體系表（表2）進行，各組實驗均重復(fù)測定3次，Vc做陽性對照，根據(jù)公式計算自由基清除率。

表2 體外ABTS+清除試驗體系表Tab.2 Test system of ABTS+ scavenging activities in vitro μL

ABTS+清除率=［（A0-A1+A2）/A0］×100% （3）

式中，A0為乙醇溶液為空白對照測定吸光度值；A1為樣品組或陽性對照組測定吸光度值；A2為樣品本身對照組測定吸光度值。

1.3.6.3 還原力 需要分別配制0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液、1%鐵氰化鉀溶液、10%三氯乙酸溶液、0.1%三氯化鐵溶液及不同濃度（20，40，60，80，100，120Methods μg/mL）的柳葉臘梅總黃酮溶液。吸取100 μL樣品或Vc 或無水乙醇于離心管中，依次加入200 μL PBS 和200 μL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻，50 ℃水浴20 min，再加入200 μL 10%三氯乙酸溶液（如有沉淀，3 000 r/min 離心10 min，如無沉淀，無需離心），取上清100 μL 加入96 孔板，再加入80 μL 蒸餾水和20 μL 0.1%三氯化鐵溶液，混合均勻，反應(yīng)后700 nm測定吸光度。各組實驗均重復(fù)測定3次，Vc做陽性對照。

1.3.7 柳葉臘梅葉總黃酮中主要抗氧化成分 采用HPLC-DAD 分析主要成分，樣品處理及流動相條件均與柳葉臘梅總黃酮的條件一致，具體試劑濃度及劑量詳見表3。

表3 ABTS和DPPH自由基反應(yīng)體系Tab.3 Test system of scavenging ABTS and DPPH radicals

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 23 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，最終結(jié)果表示為均值±標準差（M±SD）。采用Origin 2017軟件繪制相關(guān)線型圖。PeakView 1.2分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳葉臘梅葉總黃酮百分含量

柳葉臘梅葉經(jīng)提取、分離、純化后，以蘆丁做標準品，根據(jù)蘆丁標準曲線計算柳葉臘梅總黃酮的百分含量為（75.33±0.073 7）%。

2.2 LC-MS分析

按照1.3.4 的質(zhì)譜條件，得到負離子模式下的總離子流圖見圖2（因所分析物質(zhì)均在20 min 之前，故總離子流圖只展示到20 min）。通過將各色譜峰的保留時間、分子離子峰及碎片離子峰與文獻中的研究結(jié)果進行比對，對各個峰進行了鑒定，初步鑒定出柳葉臘梅葉總黃酮中14 種化合物：蘆丁[15-19]、金絲桃苷[14]、異槲皮苷[15,17-18]、山奈酚-3-O-蕓香糖苷[19-20]、木犀草素-5-O-葡萄糖苷[14]、槲皮素-3-O-木糖苷或者槲皮素戊糖苷[20]、山奈酚-3-O-半乳糖苷[21]、紫云英苷[20-21]、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷[19]、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷[22]、山奈酚-3-O-乙酰半乳糖苷[14,22]、阿福豆苷[19]、槲皮素[15,17-18,23]、柚皮素[24]、山奈酚[17,23]（表4）。

表4 柳葉臘梅葉總黃酮部分主要成分的質(zhì)譜信息表Tab.4 Negative-ion ESI mass spectra of the main constituents of the total flavonoids of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

圖2 柳葉臘梅葉總黃酮LC-MS總離子流圖Fig.2 The total ions chromatogram of the total flavonoids of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

2.3 HPLC分析

柳葉臘梅葉總黃酮的色譜圖如圖3 所示，通過與標準品相應(yīng)的保留時間比較，發(fā)現(xiàn)9 種黃酮單體物質(zhì)與標準品保留時間一致。通過加標實驗，確定9種黃酮單體物質(zhì)與標準品一致。色譜峰代表物質(zhì)及物質(zhì)在柳葉臘梅總黃酮中含量詳見表5。

表5 柳葉臘梅葉總黃酮成分分析Tab.5 Analysis of flavonoids compounds of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

圖3 標準品與柳葉臘梅葉總黃酮HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatographic of standard samples and Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves

2.4 柳葉臘梅葉總黃酮體外抗氧化活性分析

柳葉臘梅葉總黃酮的體外清除自由基活性和還原能力如圖4 所示。圖4a 所示，柳葉臘梅葉總黃酮在20～120 μg/mL鐵還原能力呈劑量依賴性。在清除自由基實驗中，柳葉臘梅葉總黃酮對ABTS+和DPPH·均展示出良好的清除作用，IC50值分別為（54.588±4.117）μg/mL 和（28.053±1.778）μg/mL（圖4b，c）。雖然柳葉臘梅葉總黃酮抗氧化能力不如Vc，但仍具有較好的抗氧化活性。

圖4 柳葉臘梅葉總黃酮體外抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activities of Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu.leaves in vitro

2.5 柳葉臘梅葉總黃酮中主要抗氧化成分分析

如圖5 所示，通過HPLC 分析確定清除ABTS+和DPPH·的主要物質(zhì)是槲皮素和山奈酚。圖5a 中，ABTS+在此流動相條件下出現(xiàn)單一峰，表明物質(zhì)為單一物質(zhì)。加入柳葉臘梅葉總黃酮后，ABTS+峰面積有所減小，同時柳葉臘梅葉總黃酮中的槲皮素和山奈酚峰消失，表明清除ABTS+的主要成分為槲皮素和山奈酚，另外，金絲桃苷、異槲皮苷、木犀草素-5-O-葡萄糖苷、紫云英苷和阿福豆苷的峰面積均有所減少，說明這些成分也具有一定的清除ABTS+作用。圖5b中，DPPH·在此流動相條件下未有峰出現(xiàn)，故圖中未展示。但加入柳葉臘梅葉總黃酮后，槲皮素和山奈酚對應(yīng)峰面積減小顯著，此外，金絲桃苷、異槲皮苷和紫云英苷峰面積明顯減小，表明除槲皮素和山奈酚外，金絲桃苷、異槲皮苷和紫云英苷也具有一定的清除DPPH·能力。

圖5 清除ABTS和DPPH自由基的主要活性物質(zhì)Fig.5 The main active substances for scavenging ABTS and DPPH radicals

3 結(jié)論與討論

柳葉臘梅屬于臘梅屬植物中的一個種，半常綠灌木[1]，是我國特有的植物種屬，主要分布于我國的江西省、浙江省、湖南省、安徽省、福建省，在一些地區(qū)又被稱為黃金茶、食涼茶等[2-4]。柳葉臘梅含有多糖、黃酮、揮發(fā)油等多種活性成分，除此之外，柳葉臘梅中還存在香豆素類、脂肪酸、微量元素、氨基酸和維生素[25-28]。

黃酮類化合物是一類具有生物活性的物質(zhì)，大量文獻報道了黃酮類化合物具有抗氧化[11,29]、抑菌[11]、保肝[13,30]、抗癌[12]、抗炎[29,31]、降血糖[32]等多種功能作用。黃酮類化合物是柳葉臘梅葉中主要成分之一，含量較高，黃酮類單體種類豐富。黃酮類化合物易溶于有機溶劑，利用超聲輔助乙醇提取，可以很大程度提高取得率。經(jīng)過聚酰胺樹脂純化，可以有效的提高柳葉臘梅葉總黃酮的純度。純化后的柳葉臘梅葉總黃酮先利用LC-MS，根據(jù)文獻推測出其具體成分，再采用HPLC 對具體成分進行確定，兩種技術(shù)共鑒定出9種黃酮類單體物質(zhì)，9種物質(zhì)中，山奈酚-3-O-蕓香糖苷和阿福豆苷在柳葉臘梅葉總黃酮中首次發(fā)現(xiàn)，此外，還有一部分成分具體是何種物質(zhì)還有待后續(xù)實驗進行確認。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化劑與抗氧化劑之間失衡，更傾向于氧化劑，導致氧化還原信號中斷和/或失控引發(fā)分子損傷[33-34]。人體多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中均有氧化應(yīng)激參與，抗氧化劑對于維持機體的氧化/抗氧化平衡具有重要作用。黃酮類化合物作為天然抗氧化劑具有良好的清除自由基和還原能力。本文為探究柳葉臘梅葉總黃酮的抗氧化作用，進行了體外抗氧化實驗，包括對ABTS 自由基和DPPH 自由基清除能力的測定及鐵還原能力的檢測。結(jié)果表明，柳葉臘梅葉總黃酮是很好的天然抗氧化活性物質(zhì)。為探究柳葉臘梅葉總黃酮中起到主要ABTS 自由基和DPPH 自由基清除作用的物質(zhì)，利用HPLC 進行分析，確定了主要活性物質(zhì)是槲皮素與山奈酚。本文研究結(jié)果為柳葉臘梅具有抗氧化作用提供理論基礎(chǔ)，也為柳葉臘梅的開發(fā)提供理論依據(jù)。