體外誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞研究進(jìn)展

徐正燕 郭維維

中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部；國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心；聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

耳蝸毛細(xì)胞（hair cells，HCs）是聽覺系統(tǒng)的機(jī)械感受器，其損傷是人類聽力損失的常見原因，強(qiáng)噪音、耳毒性藥物、衰老和遺傳因素均可引起耳蝸HCs的損傷。鳥類等非哺乳類脊椎動(dòng)物的HCs和斑馬魚側(cè)線的HCs在損傷后可以自發(fā)進(jìn)行修復(fù)[1]，但是在成年哺乳動(dòng)物中，HCs不再具備再生能力，損傷后不能自發(fā)再生，會(huì)造成永久性的聽力損失。目前臨床上治療方法主要是助聽器和人工耳蝸，但是并不能從根本上解決問題。HCs再生的細(xì)胞療法成為最具前景的研究課題和治療方法，體外誘導(dǎo)獲取HCs可以為臨床研究和藥物篩選提供細(xì)胞模型，并且為外源性細(xì)胞移植提供細(xì)胞來源。

干細(xì)胞因其具有自我更新、多向分化的特點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)，經(jīng)過對(duì)干細(xì)胞及其治療潛力的深入研究，使HCs再生成為可能。為了獲得再生的HCs，研究者們嘗試將干細(xì)胞向HCs誘導(dǎo)分化，目前采用較多的是將胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs），經(jīng)過多年的研究，干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化獲得HCs方面取得了一定的進(jìn)展，同時(shí)也存在一些問題。

研究者們也在嘗試通過誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得目的細(xì)胞，Vierbuchen等[2]首先報(bào)道了在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Brn2、Mytl1，將成纖維細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞，此后，此方法也用于成纖維細(xì)胞向胰島β細(xì)胞[3]、造血細(xì)胞[4]和心肌細(xì)胞[5]等的誘導(dǎo)。近幾年，聽力學(xué)研究者也在嘗試誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞獲得HCs，為聽力損傷細(xì)胞治療尋求更加安全的細(xì)胞來源。

在這篇綜述中，我們介紹了ESCs、iPSCs、MSCs以及成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得耳蝸HCs的進(jìn)展和存在的問題，了解HCs再生的研究進(jìn)展及細(xì)胞治療聽力損失的未來前景，給耳科學(xué)醫(yī)生和研究人員提供參考。

1 干細(xì)胞體外誘導(dǎo)

1.1 胚胎干細(xì)胞（ESCs）

Heller等[6]通過誘導(dǎo)ESCs獲得祖細(xì)胞然后向HCs逐步分化的方法獲得毛細(xì)胞樣細(xì)胞（Hair celllike cells,HCLs），他們將小鼠ESCs來源的胚狀體放在含有表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、類胰島素1號(hào)生長(zhǎng)因子（IGF-1）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）組合的無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)生表達(dá)Nestin和Pax2等耳祖細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞，為了使得到的祖細(xì)胞進(jìn)一步分化，去除培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子繼續(xù)培養(yǎng)，Nestin、Pax2下調(diào)，分化的細(xì)胞表達(dá)HCs相關(guān)標(biāo)記物(Math1、myosin VIIa、Espin、Brn3.1和 AchR α9)，并且有靜纖毛形成，說明通過此方法可以誘導(dǎo)ESCs獲得HCLs，但是該方法耗時(shí)很長(zhǎng)且方法較為復(fù)雜。之后，heller實(shí)驗(yàn)組[7]又進(jìn)一步改良培養(yǎng)方案試圖誘導(dǎo)小鼠ESCs獲得HCs，他們通過添加IGF-1促進(jìn)前外胚層的形成，同時(shí)加入Dkk1（Wnt信號(hào)抑制劑）、SIS3（Smad3抑制劑）和 bFGF，刺激ESCs向耳祖細(xì)胞分化，最終獲得表達(dá)HCs標(biāo)記物myosin VIIa的細(xì)胞，然而，誘導(dǎo)細(xì)胞沒有呈現(xiàn)典型的HCs形態(tài)，也沒有檢測(cè)到纖毛束標(biāo)記物，之后研究者發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞放在滅活的有絲分裂雞囊基質(zhì)細(xì)胞層上培養(yǎng)時(shí)可以觀察到立體纖毛束，對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)方式與未成熟HCs相似，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ESCs可以誘導(dǎo)獲得具有功能性的HCLs，但是誘導(dǎo)效率很低，只有1%-2%，且培養(yǎng)方式局限，只能在有絲分裂的雞囊基質(zhì)細(xì)胞層上進(jìn)行。之后Heller的研究小組[8]又將他們的研究擴(kuò)展到人ESCs，他們將之前的誘導(dǎo)分化方案[7]進(jìn)行修改應(yīng)用到人ESCs的誘導(dǎo)中，獲得表達(dá)多種HCs標(biāo)記物組合的細(xì)胞，這些細(xì)胞類似于新生的HCs，但是數(shù)量很低，而且沒有通過增加培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步成熟，最后死亡了，說明對(duì)于人源ESCs的誘導(dǎo)仍需進(jìn)一步研究。

也有研究者通過模擬內(nèi)耳HCs的體內(nèi)發(fā)育過程運(yùn)用3D培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)獲得HCs。Koehler等[9]通過3D培養(yǎng)小鼠ESCs使其向內(nèi)耳感覺上皮分化，實(shí)驗(yàn)通過精確控制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）信號(hào)的時(shí)間來重現(xiàn)HCs的體內(nèi)發(fā)育，產(chǎn)生的細(xì)胞帶有立體纖毛束，具有HCs機(jī)械敏感的功能特性，并能與培養(yǎng)物中ESCs產(chǎn)生的感覺神經(jīng)元形成特殊的突觸。類似的，Jing Nie等[10]通過將小鼠ESCs 3D培養(yǎng)，先是獲得內(nèi)耳感覺上皮細(xì)胞，然后通過模擬體內(nèi)內(nèi)耳發(fā)育過程中關(guān)鍵信號(hào)通路的激活和抑制，依次用重組蛋白和小分子抑制劑處理ESCs，以激活或抑制 BMP、TGFβ、FGF 和 Wnt信號(hào)通路，使ESCs最終分化為含有感覺上皮的HCLs。

此外，Ouji等[11]結(jié)合他們以前報(bào)道的Math1轉(zhuǎn)染[12]和ST2基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基[13]的方法誘導(dǎo)小鼠ESCs向HCs分化，獲得了高達(dá)30%的表達(dá)HCs標(biāo)記物的細(xì)胞，并且具有明顯的立體纖毛樣結(jié)構(gòu)，大大提高了誘導(dǎo)效率。

1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）

iPSCs具有與ESCs相似的特性，避免了ESCs的倫理問題，成為多能干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。Oshima等[7]用表達(dá)Oct4、Sox2、Klf4和cMyc的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Math1/nGFP胚胎成纖維細(xì)胞獲得iPSCs，并用同樣的方法誘導(dǎo)ESCs和制備的iPSCs向HCs分化，實(shí)現(xiàn)了iPSCs向HCLs的誘導(dǎo)分化，并且他們發(fā)現(xiàn)ESCs和iPSCs沿耳系分化能力方面和獲得的HCLs功能方面沒有顯著差異，但是培養(yǎng)方式的局限同樣限制了其應(yīng)用。之后，Ohnishi H等[14]通過模擬內(nèi)耳發(fā)育的過程，將人源iPSCs依次轉(zhuǎn)化為胎盤前外胚層、耳基板和HCLs。他們分三步進(jìn)行誘導(dǎo)，首先將人源iPSCs接種在基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿上并加入N2/B27的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)8天進(jìn)行胎盤前外胚層的誘導(dǎo)，經(jīng)誘導(dǎo)后90%以上的細(xì)胞表達(dá)了胎盤前外胚層相關(guān)的基因；然后加入bFGF使經(jīng)胎盤前外胚層誘導(dǎo)后的細(xì)胞向耳基板樣細(xì)胞分化，獲得了數(shù)量有限的耳基板標(biāo)記陽性的細(xì)胞；最后將前兩步獲得的細(xì)胞在含基底膜的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48天，產(chǎn)生了HCLs，其表達(dá)HCs標(biāo)記物（myosin VIIa）并有靜纖毛束狀結(jié)構(gòu)，為體外誘導(dǎo)獲取HCs提供了一個(gè)較簡(jiǎn)便的方法，但是誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量有限，myosin VIIa陽性細(xì)胞的比率僅占0.01±0.008%。

同樣的，3D培養(yǎng)方案也應(yīng)用于iPSCs誘導(dǎo)中。Jeong M等[15]通過3D培養(yǎng)誘導(dǎo)人類iPSCs產(chǎn)生耳部類器官，其中前庭HCs和耳蝸HCs都帶有機(jī)械感覺離子通道的靜纖毛束狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，Nie J等[16]通過人源iPSCs放于低粘附的96孔板中進(jìn)行3D培養(yǎng)，開始用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白處理促進(jìn)其上皮化，然后模擬內(nèi)耳發(fā)育過程中信號(hào)通路的激活和抑制，用小分子和重組蛋白調(diào)節(jié)BMP、FGF和WNT等信號(hào)通路，逐步誘導(dǎo)耳基板的形成，隨后形成耳囊泡，最終獲得包含HCs和支持細(xì)胞的感覺上皮，以及與HCs形成突觸的神經(jīng)元。

1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）

MSCs來源于巨核細(xì)胞系，最早由Friedenstein等分離獲得[17]，來源廣泛，存在于骨髓、脂肪、臍帶等部位，且具有低免疫原性、低致瘤性和分裂增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被研究者廣泛采用。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1是一個(gè)強(qiáng)大的內(nèi)耳分裂源，可以促進(jìn)內(nèi)耳細(xì)胞的分裂[18]。He Qin等[19]首先通過向培養(yǎng)基中加入N2/B27、EGF和bFGF等誘導(dǎo)獲得神經(jīng)干細(xì)胞，然后加入EGF、IGF-1和N2/B27的無血清培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，最后獲得的細(xì)胞形態(tài)與耳蝸HCs相似，且可以表達(dá)HCs的標(biāo)記物myosin VIIa。江紅群等[20]運(yùn)用耳蝸Corti器與MSCs共培養(yǎng)的方法體外誘導(dǎo)獲得HCs，他們將分離出生1-3天的乳鼠耳蝸Corti器與分離培養(yǎng)的大鼠MSCs體外共培養(yǎng)14天，經(jīng)鑒定，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可表達(dá)HCs的標(biāo)志物myosin VIIa和math1。Mahmoudian-Sani MR 等[21]嘗試用人骨髓MSCs誘導(dǎo)分化，他們?cè)谂囵B(yǎng)液中加入維甲酸（RA）、bFGF和EGF，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞在mRNA水平上ATOH1、SOX2和POU4F3標(biāo)記物的表達(dá)增加，蛋白水平上ATOH1表達(dá)增加，但是形態(tài)并未發(fā)生改變。也有研究者運(yùn)用臍帶MSCs體外誘導(dǎo)獲取HCs，張婷等[22]通過體外誘導(dǎo)人臍帶MSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化再向HCs分化的方法，獲得表達(dá)HCs標(biāo)記物myosin VIIa、Brn3c、Aoth1的細(xì)胞。

2 成纖維細(xì)胞

近幾年研究者開始嘗試用成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)獲得HCs，為臨床治療及基礎(chǔ)研究提供更加安全的細(xì)胞來源。

有研究者嘗試將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得HCs。Yang Q等[23]通過間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化逐步誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分化為HCLs，他們首先通過TGF-β抑制劑SB431542誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化，然后通過過表達(dá)三個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（Sox2,Eya1和Six1）使其獲得耳部感覺上皮細(xì)胞特性。這些誘導(dǎo)的HCLs表達(dá)多種HCs特異性蛋白，有纖毛束結(jié)構(gòu)，對(duì)電壓刺激有反應(yīng)，形成功能機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，并顯示HCs特征的轉(zhuǎn)錄譜。他們提供了一種新的體外產(chǎn)生功能性HCs的方法，這可能對(duì)HCs的發(fā)育研究、藥物篩選和聽力損失的細(xì)胞替代治療研究具有重要的意義。Louise Menendez等[24]報(bào)道了用四種轉(zhuǎn)錄因子Six1,Atoh1,Pou4f3和Gfi1（SAPG）的結(jié)合，除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞外，還將成年小鼠尾尖成纖維細(xì)胞和出生后小鼠的支持細(xì)胞誘導(dǎo)為HCLs。在高含量表型篩選系統(tǒng)中，誘導(dǎo)細(xì)胞表現(xiàn)出HCs樣形態(tài)、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳特征、電生理特性、機(jī)械感覺通道表達(dá)和對(duì)耳毒素的易感性。Meng Zhao等[25]通過細(xì)胞激活和信號(hào)定向的方法，將轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程獲得一種大量表達(dá)HCs標(biāo)記物的細(xì)胞，在這一譜系轉(zhuǎn)換過程中經(jīng)歷了中間祖細(xì)胞階段。遺憾的是，這些重編程細(xì)胞仍然缺乏HCs的一些關(guān)鍵特征，如機(jī)械敏感離子通道，說明重編程細(xì)胞尚未獲得HCs的功能特性，但是為用人體大量存在的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)獲得HCs提供了一個(gè)新的研究思路。

同時(shí)也有研究者對(duì)人成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)以獲得HCLs。Duran等[26]通過對(duì)人類成纖維細(xì)胞過表達(dá)HCs發(fā)育中起關(guān)鍵作用的三個(gè)基因GFI1,POU4F3和ATOH1(GPA)獲得了表達(dá)HCs標(biāo)記物（MYOSIN VIIA和ESPIN）的細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)、qPCR和RNAseq分析表明誘導(dǎo)細(xì)胞中有典型HCs基因的表達(dá)。他們的方法經(jīng)過證明比ESCs和iPSC的方法快得多，并驗(yàn)證了GPA作為一組基因的組合，其激活可以使人類體細(xì)胞向HCs譜系直接轉(zhuǎn)化。遺憾的是未觀察到細(xì)胞極化和立體纖毛樣突起的形成。

3 體外誘導(dǎo)耳蝸HCs存在的問題

目前已經(jīng)證明通過將小鼠和人類來源的ESCs逐步分化誘導(dǎo)可以在體外生成耳蝸HCs，但是ESCs的倫理問題和致瘤性等問題，大大限制了其臨床應(yīng)用。iPSC雖然避免了ESCs的倫理問題，但是目前技術(shù)制備的iPSC的致瘤性和效率低等問題，限制了其臨床應(yīng)用。MSCs被認(rèn)為是最有潛力的細(xì)胞來源，但是目前體外誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞只是表達(dá)HCs相關(guān)標(biāo)記物，但誘導(dǎo)細(xì)胞電生理方面仍有不足，尚不能獲得成熟的HCs。人體內(nèi)存在大量的成纖維細(xì)胞，可以提供豐富的細(xì)胞來源，而且運(yùn)用自體成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的HCs避免了免疫原性的問題，進(jìn)行細(xì)胞治療更加安全，直接重編程成纖維細(xì)胞獲取HCs的方法為聽力損傷修復(fù)研究提供了一個(gè)新的思路，但是目前利用成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程獲得HCs的研究還很少，用人類成纖維細(xì)胞重編程獲得HCs的研究只搜到1篇，重編程的方法還是局限于轉(zhuǎn)錄因子方面，誘導(dǎo)效率低，誘導(dǎo)細(xì)胞不成熟，且不能避免潛在致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。

4 展望

為了獲得再生的耳蝸HCs，研究者致力于干細(xì)胞分化的研究，并且取得了很多成果，但由于ESCs的倫理問題和iPSCs的潛在致瘤性，大大限制了其臨床應(yīng)用，MSCs在誘導(dǎo)效率和細(xì)胞成熟度方面仍需改進(jìn)。近幾年研究者開始嘗試用成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)獲得HCs，取得了一些進(jìn)展，且成纖維細(xì)胞比較豐富，用自體成纖維細(xì)胞獲得HCs還可以避免免疫原性的問題，為HCs的再生提供的新的研究方向，有望成為修復(fù)受損HCs的新方法。但仍然存在一些問題，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄因子獲得毛細(xì)胞依然具有致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)，且目前制備的HCs功能仍不完善，編程效率低，研究者應(yīng)尋求更加完善的誘導(dǎo)方案，獲得更加成熟的HCs。已有研究者通過小分子化合物的方法誘導(dǎo)獲得心肌細(xì)胞[27]，研究者也可以嘗試用小分子化合物誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞獲得HCs，這將為耳損傷的研究提供更加安全的細(xì)胞來源。此外，藥物篩選細(xì)胞移植都需要大量的細(xì)胞，當(dāng)前體外誘導(dǎo)獲取HCs的效率還很低，而且目前沒有研究表明外源細(xì)胞可以成功取代受損的HCs恢復(fù)聽覺功能，這可能是由于外源細(xì)胞很難整合進(jìn)宿主細(xì)胞[28]。對(duì)于重編程的機(jī)制問題、細(xì)胞移植問題及移植后細(xì)胞存活時(shí)間問題等仍需進(jìn)一步研究。