抗結核藥物貝達喹啉的耐藥情況及其耐藥機制研究進展

姚蓉 陸宇

2020年，全球共報告耐藥結核病患者157 903 例，其中包括132 222例耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)/利福平耐藥結核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)患者，25 681例前廣泛耐藥結核病(pre-extensively drug-resistant tuberculosis，pre-XDR-TB)和廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)[1]。耐藥結核病治療周期長、治愈率低、病死率高、不良反應明顯，價格昂貴。Bdq是一種新型口服二芳基喹啉類藥物，通過影響腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)合成酶質子泵的活性，導致ATP合成受阻，從而阻止MTB中ATP的能量供應，發(fā)揮殺菌作用[2-4]。

2012年12月，Bdq成為首個獲批用于治療成人MDR-TB的新藥[5]， 在背景方案中納入Bdq已被證明可以顯著改善治療結局并降低MDR-TB患者的死亡率[6-7]。截至2020年底，已有109個國家使用Bdq作為耐藥結核病治療的一部分[8]。然而，Bdq作為一種具有全新作用機制的抗結核藥物，仍無法避免耐藥性的出現和發(fā)展[9]。因此，有必要采取恰當的表型藥物敏感性試驗(phenotypic drug sensitivity test，pDST)和耐藥性監(jiān)測，以便最大限度地降低產生耐藥性的風險，并最大程度地提高治療的有效性。本文主要對Bdq耐藥情況、可能機制、檢測手段以及與臨床的相關性進行綜述，以提高臨床對Bdq的認識，并為合理應用該藥提供理論依據。

Bdq耐藥現狀

一、 原發(fā)性耐藥情況

原發(fā)性耐藥是從未接受抗結核治療的患者對某種或某些抗結核藥物發(fā)生耐藥。一項基于人群的回顧性研究探索了中國臺灣地區(qū)2008—2019年中從未使用過Bdq的898例MDR/RR-TB患者中的初始MTB分離株對Bdq的耐藥情況。采用瓊脂稀釋法(agar dilution，AD)進行Bdq的藥物敏感性試驗(DST)，發(fā)現其耐藥性斷點≥0.25 μg/ml，故中國臺灣地區(qū)的Bdq耐藥率為3.1%(28/898)[10]。在這28例患者中，RR-TB、MDR-TB、pre-XDR-TB和XDR-TB患者含Bdq耐藥分別占2.5%(5/202)、3.3%(20/608)、4.1%(3/74)和0.0%(0/14)[10]。2015年中國11個省份的回顧性研究納入了1603 株既往未接觸過新型抗結核藥物的菌株[11]，1407株(87.8%)來自新發(fā)患者，196株(12.2%)來自復治患者。檢測到6 株(0.4%，6/1407)菌株對Bdq耐藥，提示對Bdq有耐藥性的菌株可能存在密集的社區(qū)傳播。與2007年中國第一次全國耐藥性監(jiān)測結果一致[12]，在102株MDR-TB菌株中，只有1株(1.0%)對Bdq耐藥，這也是唯一對氯法齊明(Cfz)耐藥的菌株[11]。中國的一項回顧性隊列研究顯示，277例接受Bdq治療的患者，2.2%(6/277)MDR-TB分離株發(fā)現初始Bdq耐藥，其中包括5株MDR-TB分離株和1株XDR-TB 分離株[13]，其基線Bdq耐藥率與南非報告的數據(2.3%)相似[14]，但高于法國(1.0%)[15]和俄羅斯(1.3%)[16]。因此，不同地理區(qū)域的初始Bdq耐藥性可能不同。

一項為期5年(2015—2019年)涵蓋11個國家的耐藥性監(jiān)測研究評估了5036株MDR-TB分離株的Bdq初治患者對Bdq和其他抗結核藥物的敏感性[17]。7H9微量肉湯稀釋法(broth microdilution，BMD)顯示Bdq的耐藥率為0.6%，而7H10/7H11瓊脂稀釋法(agar dilution，AD)提示Bdq的耐藥率為0.4%。在MDR-TB人群中，Bdq和Cfz之間的表型交叉耐藥率為0.4%，在pre-XDR-TB/XDR-TB人群中為1%。MDR-TB患者對Bdq和利奈唑胺(linezolid，Lzd)共同耐藥率為0.1%，pre-XDR-TB/XDR-TB患者為0.2%。在未接受過Bdq治療的人群中，Bdq的耐藥率較低。

二、獲得性耐藥情況

獲得性耐藥是指抗結核治療達到或超過1個月的患者發(fā)生的耐藥。Mallick等[18]檢索識別出866篇論文，最終納入13項研究。其中，11項為隊列研究(5項前瞻性研究，6項回顧性研究)，2項為隨機對照試驗。表型和基因型獲得性Bdq耐藥(acquired bedaquiline resistance，ABR)的中位頻率分別為2.2%和4.4%。這與Kunkel等[19]的模型估計結果一致。眾所周知，并不是所有的耐藥相關變異(resistance-associated variants，RAVs)都會產生耐藥性[20]，這在一定程度上可以解釋表型和基因型ABR頻率的差異。在巴基斯坦隊列中，僅包括接受Bdq治療后培養(yǎng)轉陰延遲的患者，而其他隊列包括所有最初培養(yǎng)陽性的患者，以及在Bdq治療期間早期培養(yǎng)轉陰的患者。這可能是 27.6%(表型)和 36.7%(基因型)的 ABR 頻率相對較高的原因之一[21]。此外，Mokrousov等[22]檢測到基因型ABR頻率顯著升高至50%。據估計，在既往接受過治療的患者中，獲得性耐藥約占MDR-TB新發(fā)患者的38.7%[23]，這些個體在復發(fā)時發(fā)生復雜耐藥模式的風險可能更高。由于Bdq的半衰期較長，失訪受試者發(fā)生ABR的風險特別高。因此，提高患者的依從性對預防獲得性耐藥至關重要。

三、Bdq與Cfz交叉耐藥

Bdq 和 Cfz之間的交叉耐藥性是一個新出現的問題[24]。一些研究報告了對Bdq或Cfz表型耐藥且已知耐藥基因中沒有可識別突變的分離株或體外進化菌株的比例[25]。有研究者鑒定出24株臨床MTB分離株中的2株，治療后Bdq的MIC增加了2倍，未鑒定出mmpR、atpE、pepQ或Rv1979c基因突變[26]。也有研究者鑒定了5株分離株中的1株，其對Bdq和Cfz的MIC增加2倍，而未檢測到atpE、mmpR或pepQ基因突變[27]。

Ismail等[14]發(fā)現Bdq和Cfz的MIC之間存在強相關性，當存在Rv0678 RAV時，相關性更強。這表明它們可能具有共同的生化途徑進而發(fā)生交叉耐藥。在Cfz耐藥分離株中，30%(9/30)對Bdq耐藥，而在Bdq耐藥分離株中，9株(100%)均對Cfz耐藥，大多數(8/9)攜帶Rv0678 RAV。因此，Bdq耐藥性可能對Cfz產生完全交叉耐藥性，而在Cfz耐藥性患者中，1/3將產生交叉耐藥性。RAVs的發(fā)生率可能會隨著時間的推移而增加，所以，持續(xù)耐藥性監(jiān)測十分重要。

Bdq耐藥基因突變類型

一、atpE基因突變

atpE基因編碼Bdq的靶點(ATP合成酶亞基C)的第81位氨基酸。Ghodousi等[28]報告了從肺結核患者中分離的pre-XDR-TB菌株在18個月含Bdq方案治療期間的微進化。治療3個月內，與高水平Bdq耐藥相關的atpE_Ala63Pro突變一過性出現，提示在相對較短的時間內出現耐藥性擴增的風險。然而，其在含Bdq方案治療9個月后完全消失，這可能與這種突變體的適應性成本增加有關。因此，在MDR-TB 高負擔國家，發(fā)展最低抑菌濃度(MIC)檢測、pDST和全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)至關重要。

Bdq耐藥相關位點的遺傳多樣性研究顯示[29]，在atpE基因中發(fā)現25個新突變，大部分(15/25)是非同義單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)，其中9個通過SUSPECT-Bdq預測軟件賦予其耐藥性。在這些突變中，只有I66V突變存在于參與Bdq-atpE相互作用的殘基中；E44D存在于北京分離株(譜系2.2.1)中，它可能是一種自然發(fā)生的多態(tài)性，導致該菌株對Bdq的固有MIC升高[29]。

大多數atpE基因突變發(fā)生于體外分離株。然而，atpE D28N、E61E、A63V和I66V各發(fā)生1株Bdq臨床耐藥分離株。atpE基因突變可引起MIC增加的范圍從8～133倍不等[25]。

二、mmpR(Rv0678)基因突變

mmpR編碼一個由165個氨基酸組成的非必需轉錄抑制因子，該抑制因子通過mmpS5-mmpL5泵影響B(tài)dq的外排。Omar等[30]提到mmpR基因的非靶向突變越來越多地與Bdq耐藥性相關。2015—2019年，共有7%的分離株被鑒定出對Bdq耐藥。對大多數分離株(130/199)進行WGS分析，發(fā)現所有分離株均攜帶Rv0678突變，未發(fā)現atpE基因突變。對其余的分離株(69/199)進行了Sanger測序以鑒定Rv0678基因突變，發(fā)現所有分離株均攜帶Rv0678突變；未進行atpE基因測序[30]。共鑒定出297個Rv0678突變，大多數突變?yōu)椴迦牖蛉笔蛔?。突變遍布整個基因；但是，5個密碼子(46至49和67)突變在297個突變中占了114個(38%)，在199株分離株中占了87株(44%)[30]。

在mmpR5中發(fā)現163個突變(116個非同義SNP、29個插入缺失和18個啟動子變異)，其中32個與MIC增加有關，14個與MIC無變化相關。3個SNP被翻譯成終止密碼子(E13*、W42*和R156*)，這可能會改變蛋白質功能。此外，3個移碼突變(192_193insG、193_193del、141_142insC)大量出現，均與較高的Bdq體外MIC相關[29]。

12項研究確定了66個獨特的mmpR突變，突變廣泛分布在密碼子1～145之間。與耐藥性相關最常見的突變是nt192-198處的6-鳥嘌呤均聚物的移碼(Bdq 11株)或nt138-144處的低序列復雜度區(qū)域(Bdq 7株)或nt212-216(Bdq 4株)。在nt138-142和212-216的移碼突變中，Bdq的MIC至少增加了8倍，但mmpR突變通常與Bdq的MIC適度增加2～4倍有關[25]。

三、pepQ基因突變

編碼Xaa-Pro氨肽酶的pepQ基因突變也與低水平的Bdq耐藥有關，推測可能通過外排發(fā)生。在pepQ基因中發(fā)現的120個新突變包括117個非同義SNP和3個插入缺失，其中2個導致單個分離株中的移碼，這些移碼可能參與pepQ基因的功能喪失[29]。

據報道，外排泵抑制劑可使pepQ突變體對Bdq的敏感性恢復到其野生型親本的敏感性。體外進化的3個功能缺失突變(L44P和密碼子14和271處的兩個移碼)導致Bdq和Cfz的MIC適度增加4倍[25]。

Bdq表型耐藥檢測

一、常規(guī)pDST檢測方法

基于固體的7H11瓊脂比例(agar proportion，AP)試驗被認為是檢測Bdq對MTB耐藥性的參考方法[31]。應用生長活躍的突變菌株制備MTB混懸液，將混懸液接種到含不同濃度Bdq的7H11瓊脂培養(yǎng)基(含10%OADC增菌液和0.5%甘油)上，作為實驗組，而混懸液接種于無藥物培養(yǎng)基則作為對照組。將平板置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，1周后檢查污染情況，然后在4～8周進行計數[32]。

與BACTEC MGIT 960相關的分枝桿菌生長指示管是目前DST使用最廣泛的液體肉湯自動化系統。該系統可顯著改善全球MTB DST的檢測時間、符合率和性能[31]。將MTB混懸液接種于含不同濃度Bdq培養(yǎng)基的BACTEC MGIT培養(yǎng)管中并在 BACTEC MGIT 960系統中培養(yǎng)，以等體積接種生長對照管。由于MGIT系統是自動化的，可連續(xù)讀取所有試管，使用熒光傳感器以60 min間隔測量生長單位(growth unit，GU)水平，最長持續(xù)28 d[32]。如果含Bdq管的GU值>100且生長對照管的GU值≥400，則結果判讀為耐藥[33]。

二、Bdq的MIC關鍵濃度

Bdq 表型耐藥的關鍵濃度目前尚未完全確定。2018年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)系統地審查了Bdq pDST的可用數據，暫定7H11 瓊脂比例法、分枝桿菌生長指示管法的Bdq臨界濃度(critical concentration，CCs)分別為0.25 μg/ml和1 μg/ml[34-35]。歐洲藥敏試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)在7H10和7H11瓊脂比例法中采用0.25 μg/ml作為臨床臨界濃度(clinical breakpoint，CB)[36]，高于抑制90%分離株或菌株的MIC(0.125 μg/ml)。然而，有證據表明，即使DST結果在關鍵濃度以下仍有可能導致治療失敗[17, 21, 32]，這可能由于關鍵濃度的選擇以及治療過程中菌株對藥物敏感性的變化引起。

Bdq耐藥與臨床的相關性

一、 Bdq表型耐藥與Rv0678、atpE、pepQ和Rv1979c基因突變的相關性

Ismail等[37]首次評估Bdq表型耐藥與Rv0678、atpE、pepQ和Rv1979c基因突變間的關系。按照檢索標準共檢索到1367項研究，最終40項(2.9%)研究符合納入要求。系統文獻綜述的結果證實了atpE基因突變可導致高水平的耐藥[38]，但證據主要來自體外和動物實驗，臨床病例很少。研究結果顯示，Rv0678基因中突變體數量眾多并分散在整個基因中，大多數SNPs、插入和缺失發(fā)生在表型敏感的臨床分離株中。雖有假設pepQ和Rv1979c在Bdq耐藥性發(fā)展中發(fā)揮了作用[39-40]，但通過對相關數據統計分析表明其在耐藥性中發(fā)揮重要作用的可能性很小[37]，這項研究采用標準方法證實兩個單突變體(atpE187G→C和Rv0678 138_139insG)與耐藥性相關。然而，這一認知對臨床不會做出實質性貢獻，因為在過去13年中，臨床分離株中僅報告1次atpE187G→C突變和3次Rv0678 138_139insG突變[37]?？傮w而言，Bdq耐藥尚缺乏明確的基因型與表型關聯。

二、Bdq耐藥與臨床結局的相關性

為監(jiān)測耐藥結核病患者使用Bdq期間該藥耐藥譜的變化，從13家研究中心的患者中收集陽性培養(yǎng)物，發(fā)現277例接受Bdq治療的患者中，MDR-TB患者的初始Bdq耐藥率為2.2%(6/277)，5例痰培養(yǎng)陰轉，138例在2周內痰培養(yǎng)陰轉。另外，初始低水平Bdq耐藥(0.25～0.5 μg/ml)的MDR-TB患者在接受含Bdq方案治療時可實現痰培養(yǎng)陰轉[13]，這可能是由于對這些患者給予Bdq可以克服低水平的Bdq耐藥性。

俄羅斯78例Bdq暴露患者的188株MDR-TB分離株，證實了Bdq治療可能導致Bdq MIC升高[16]。同樣，中國的一項研究顯示，94例產生系列分離株的患者中，11例表現出Bdq敏感性降低，而5例獲得性耐藥患者中的3例未觀察到痰培養(yǎng)陰轉[13]，這表明相對于Bdq原發(fā)性耐藥患者，獲得性耐藥的MDR-TB患者治療失敗的風險更高。序列分析發(fā)現，11株Bdq耐藥分離株中有6株攜帶Rv0678基因突變，其他3個Bdq耐藥相關基因未檢測到突變。痰培養(yǎng)陰轉時間未見明顯組間差異。

南非一項Bdq耐藥性監(jiān)測項目收集2015—2019年間所有開始接受Bdq治療的患者的3份痰液樣本：基線樣本、治療2個月和6個月的樣本，共8041例患者提交監(jiān)測樣本，其中2023例納入橫斷面分析，695例納入縱向分析[41]。結果顯示，基線Bdq耐藥率為3.8%(76/2023)，這一數據略高是因為pre-XDR 或 XDR-TB患者是在發(fā)病時接受基于Bdq方案的主要人群。在無Bdq或Cfz既往暴露史的人群(1987例)或未知暴露史人群(17例)中，Bdq耐藥率為3.6%(72/2023)，而在既往有Bdq或Cfz暴露史的人群中，耐藥率為21.1%(4/19)。這一發(fā)現表明，Bdq耐藥性與既往耐藥結核病治療之間無相關性。然而，如果患者既往暴露于Bdq或Cfz，則在基線時發(fā)生Bdq耐藥率更高[41]。2.3%(16/695)的患者在治療第90天時出現治療引起的Bdq耐藥情況，預計這些患者大多發(fā)生在 pre-XDR 或 XDR-TB患者的治療早期。所以與RR-TB患者相比，pre-XDR和XDR-TB患者Bdq耐藥率顯著更高。此外，服用Bdq的患者若在第2個月仍保持培養(yǎng)陽性或培養(yǎng)狀態(tài)逆轉，應重新檢測Bdq耐藥性[41]。因此，表型Bdq耐藥與較差的結局相關。

總結和展望

總體而言，Bdq耐藥率相對較低；然而，隨著時間的推移，這一數字可能會增加。Bdq耐藥的遺傳基礎尚未完全闡明，目前已知的耐藥機制包括atpE、Rv0678和pepQ基因突變?？焖贆z測和有效治療是控制Bdq耐藥的關鍵。診斷上，開發(fā)準確的分子檢測方法需要深入了解Bdq耐藥性相關的基因突變，但由于數據稀缺和研究異質性，目前尚不足以開發(fā)一種快速的分子檢測方法。因此，為提高對Bdq表型-基因型相關性的了解，需報告全面的基因型和表型數據及治療結局信息，特別是治療失敗的患者。治療上，科學合理應用新型抗結核藥物及設計有效的聯合治療方案將有助于減少耐藥性的出現。其次，在制定方案前，對MDR-TB患者進行藥物敏感性檢測，有利于指導臨床是否將Bdq作為其治療方案的一部分。另外，當存在Bdq與Cfz交叉耐藥的情況時，必須收集相關突變的基因組數據并重新考慮含有這兩種藥物的治療方案，以降低患者治療失敗的風險和此類菌株在社區(qū)中的傳播[21]。因此，充分了解Bdq的耐藥特征及相應的耐藥機制，以期開發(fā)Bdq耐藥精準診斷方法，對于臨床合理應用Bdq及減少耐藥性產生至關重要。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻姚蓉：數據的采集及整理、初稿撰寫和修改；陸宇：研究指導、批評性審閱、文章修改