新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法診斷尿路上皮癌的臨床研究

陳宇豪 徐鋒 劉娓 劉喆 王祖恒 黃杰 程文

尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法是臨床上應(yīng)用最廣泛的用于診斷尿路上皮癌的檢查方法，早期的直接涂片顯微鏡鏡檢法單次的敏感性約為13%～75%[1]，臨床上逐漸被新柏氏液基細(xì)胞學(xué)檢查(thinprep cytologic test, TCT)方法所替代。TCT法繼承了傳統(tǒng)脫落細(xì)胞學(xué)檢查特異性高、經(jīng)濟(jì)簡便、診斷高級別腫瘤及原位癌陽性率高的特點，并且在制片質(zhì)量上有較大提升[2]。但是，TCT法在實際操作中面臨尿液黏液、紅細(xì)胞和無機(jī)鹽結(jié)晶無法有效去除、細(xì)胞提取率不高、細(xì)胞難以全部轉(zhuǎn)移至玻片上等問題，尤其是難以處理細(xì)胞和組織團(tuán)塊粘連堆積的樣本。我們在前人研究的基礎(chǔ)上設(shè)計了一種新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法，并與TCT法進(jìn)行比較，驗證其在尿路上皮癌中的應(yīng)用價值。

對象與方法

一、臨床資料

收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)2018年6月至2019年10月期間收治的91例因影像學(xué)結(jié)果或無痛性肉眼血尿懷疑有尿路上皮癌患者的臨床資料，所有患者未留置導(dǎo)尿管，均在膀胱鏡檢查之前收集尿液樣本。其中男71例，女20例，年齡41～85歲，平均(65.3±11.3)歲，91例患者均采用新型尿脫落細(xì)胞學(xué)方法和TCT法檢查。

二、操作方法

新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法：提前囑患者晨起適當(dāng)多飲水，收集每位患者晨起第1次小便至送檢前至少兩次尿液置于550 ml礦泉水瓶中，尿液總量均不少于250 ml，確保標(biāo)本無污染。步驟如下：①在礦泉水瓶內(nèi)注入40 ml生理鹽水，并在液面高度瓶壁外側(cè)用注射器針頭扎一小孔并用一次性膠布封閉小孔，倒出生理鹽水。將尿液標(biāo)本置入該礦泉水瓶中靜置1 h后去除膠布，待上層液體流出后，搖勻沉淀物后均分至5 ml離心管，用10 ml生理鹽水洗凈附壁沉渣一并倒入離心管(離心管共10支)。②使用離心機(jī)以2 000轉(zhuǎn)/min的速率離心5 min，棄上清液。③加入適量5%醋酸溶液以裂解紅細(xì)胞、黏液和無機(jī)鹽結(jié)晶，充分震蕩，靜置3 min后，以2 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液。若血尿較重或黏液較多，可重復(fù)此步驟。④加入0.9%生理鹽水，充分震蕩后，以2 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液。最后加入10%甲醛溶液，并將全部沉淀物集中至試管中暫時封存。⑤制片前將標(biāo)本以1 000轉(zhuǎn)/min速率離心，用濾紙過濾后將全部沉淀物包好放入包埋盒中，用脫水機(jī)常規(guī)脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。對于細(xì)胞量較少或者底部細(xì)胞難以聚集的樣本，用滴管吸取下層沉淀物，滴到提前加熱至65 ℃熔化的瓊脂凝膠上，冷卻后將固體瓊脂凝膠置入包埋盒中，脫水、透明、浸蠟包埋。⑥蠟塊首次切片5張，脫蠟后行蘇木精-伊紅染色，并封片。閱片后若均為陰性結(jié)果，采用連續(xù)切片法，直至將蠟塊全部切片、染色、封片并閱片。

TCT法：收集患者第2次晨尿中段尿送檢(約50 ml)。步驟如下：①尿液標(biāo)本全部轉(zhuǎn)移至50 ml離心管，使用離心機(jī)以2 000轉(zhuǎn)/min的速率離心5 min，棄上清液。②加入清洗液30 ml，震蕩后使用離心機(jī)繼續(xù)以2 000轉(zhuǎn)/min的速率離心5 min，棄上清液。③倒入新柏氏保存液，靜置15 min后，使用新柏氏T5000全自動液基薄層細(xì)胞制片儀制片，所獲取的細(xì)胞標(biāo)本采用蘇木精-伊紅染色，封片。

三、結(jié)果判定

所有切片均由細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師閱片。明確癌細(xì)胞的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①對于標(biāo)本中小塊惡性組織的診斷，我們將以下結(jié)果歸為明確癌細(xì)胞：細(xì)胞層次明顯增多；細(xì)胞排列紊亂；細(xì)胞核增大、核漿比例失調(diào)；可見核仁增多、增大或巨大核仁；細(xì)胞突破基底膜；病理性核分裂。②對于沉渣中惡性細(xì)胞的診斷，我們將以下結(jié)果歸為明確癌細(xì)胞：細(xì)胞體增大、核漿比例高度失調(diào)；核染色質(zhì)高度分布不均；巨大裸核；核仁明顯增多、增大或巨大核仁；出現(xiàn)多核、巨核細(xì)胞；病理性核分裂。實際操作可能出現(xiàn)的情況主要有以下4種：①正常上皮細(xì)胞；②非典型上皮細(xì)胞(異型性上皮細(xì)胞缺乏明確惡性特征)；③可疑癌細(xì)胞(上皮細(xì)胞有惡性特征，數(shù)量或質(zhì)量不足以診斷為癌)；④明確癌細(xì)胞。我們將滿足①和②的樣本判定為陰性結(jié)果，分別記為1分和2分，將③和④判定為陽性結(jié)果，分別記為3分和4分。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣本總頻數(shù)>40且單個頻數(shù)>5時采用卡方檢驗；總頻數(shù)>40，但有單個頻數(shù)<5采用卡方矯正公式檢驗；總頻數(shù)<40且有單體頻數(shù)<5則采用Fisher’s確切概率法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)果匯總

在91例患者中，確診為膀胱腫瘤的患者52例，其中包括50例尿路上皮癌、1例腎源性腺瘤、1例黏液腺癌，確診為輸尿管癌或者腎盂癌的患者24例。另有1例尿路上皮不典型增生，3例腺性膀胱炎，1例膀胱結(jié)石，4例前列腺增生或前列腺癌，5例腎細(xì)胞癌和1例淋巴瘤。在診斷為尿路上皮癌的74例患者中，高級別尿路上皮癌54例，低級別尿路上皮癌20例；肌層浸潤性尿路上皮癌44例，非肌層浸潤性尿路上皮癌30例；男54例，女20例；首發(fā)患者63例，復(fù)發(fā)患者11例。

在91例疑似尿路上皮癌的尿液樣本中，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法檢測出48例陽性，其中1例陽性的病理結(jié)果為膀胱腎源性腺瘤，1例陽性的病理結(jié)果為上皮不典型增生。TCT法檢測出34例陽性，其中1例陽性的病理結(jié)果為腎細(xì)胞癌侵犯腎盂，1例陽性的病理結(jié)果為腺性膀胱炎。見表1。

表1 新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法與TCT法診斷結(jié)果匯總

二、兩種方法檢測全部尿路上皮癌樣本的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性對比

如表1所示，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法檢測尿路上皮癌的敏感性為64.9%(48/74)，明顯高于TCT法的45.9%(34/74)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.360，P=0.021)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法檢測尿路上皮癌的特異性為88.2%(15/17)，TCT法的特異性為82.4%(14/17)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.500)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法檢測尿路上皮癌的準(zhǔn)確性為69.2%(63/91)，比TCT法的準(zhǔn)確性52.7%(48/91)更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.196，P=0.023)。兩種方法的受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線對比見圖1。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法的ROC曲線下面面積(area under curve, AUC)為0.866(95%CI：0.809～0.923，約登指數(shù)=0.668)；TCT法AUC為0.704(95%CI：0.625～0.783，約登指數(shù)=0.380)。

圖1 新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法和TCT法ROC曲線對比圖

三、兩種方法檢測不同類型和級別、性別、腫瘤位置尿路上皮癌的敏感性對比

如表2所示，在高級別尿路上皮癌樣本中，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法的檢測敏感性高于TCT，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.293，P=0.038)。在肌層浸潤性尿路上皮癌樣本中，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法敏感性的檢測高于TCT法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.057，P=0.002)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在首發(fā)患者中的檢測敏感性較TCT法高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032)，在上尿路尿路上皮癌中的檢測敏感性也較TCT法高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.020)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在低級別尿路上皮癌和非肌層浸潤性尿路上皮癌的檢測中表現(xiàn)出的敏感性與TCT法相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，兩種方法在不同性別、復(fù)發(fā)患者和膀胱尿路上皮癌中檢測敏感性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法和TCT法對不同臨床特征尿路上皮癌檢測的比較[例(%)]

四、新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對不同類型尿路上皮癌檢測的比較

如表3所示，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對于高級別尿路上皮癌檢測的敏感性明顯高于低級別尿路上皮癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.618，P<0.001)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對于肌層浸潤性尿路上皮癌檢測的敏感性明顯高于非肌層浸潤性尿路上皮癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.186，P<0.001)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在女性和男性患者中的檢測敏感性分別為65.0%和64.8%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.988)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在首發(fā)患者中的檢測敏感性較復(fù)發(fā)患者低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.803)。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)的檢測方法在上尿路尿路上皮癌和膀胱尿路上皮癌中的敏感性分別是62.5%和60.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.206)。

表3 新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對不同類型尿路上皮癌檢測的比較

續(xù)表3 新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對不同類型尿路上皮癌檢測的比較

五、不同方法制作病理切片的質(zhì)量比較

其中有3例尿液樣本采用新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法和TCT法所制作切片圖像如圖2所示，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法制作的病理切片較TCT法染色鮮艷，細(xì)胞數(shù)量多且集中，無重疊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，且與術(shù)后病理差距小。此外，TCT法只留下尿液中的脫落細(xì)胞，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法切片中在保留尿液中脫落細(xì)胞的同時將脫落的組織部分做成病理切片，能進(jìn)一步提高檢出率。

A：新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法所制作切片(HE染色，×400)；B：TCT法制作切片(HE染色，×400)；C：術(shù)后病理切片(HE染色，×400)

六、兩種檢測方法的費用比較

TCT法的檢查費用為180元/人次，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法的檢查費用為200元/人次。TCT法為成熟的檢查方法，而新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法則在前期尿液預(yù)處理過程中仍有較大減少費用的空間。

討 論

尿路上皮癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，其中輸尿管癌和腎盂癌占比不到10%[3]，部分臨床病例的確診仍有難度。非肌層浸潤性膀胱癌約占全部膀胱癌的75%，5年生存率約88%～98%，而肌層浸潤性膀胱癌的5年生存率只有46%～63%[4]，并且70%以上的膀胱癌患者經(jīng)治療后仍會復(fù)發(fā)[5]。膀胱癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[6]。學(xué)者們致力于尋找簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的檢查方法，并對原有的方法進(jìn)行改進(jìn)。上世紀(jì)90年代液基細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)的出現(xiàn)將脫落細(xì)胞檢測帶向新的高度，該方法制片質(zhì)量高、檢測陽性率令人滿意，但實際操作也面臨一些問題。有學(xué)者為提高對沉淀物稀少的尿液標(biāo)本的檢出率，嘗試采用瓊脂先行包埋尿脫落細(xì)胞再行組織病理學(xué)連續(xù)切片的方法用于對膀胱癌的診斷，獲取的制片效果和檢測陽性率較涂片法有優(yōu)勢[7]。在前人研究的基礎(chǔ)上我們設(shè)計了一種尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的新方法。

本研究中通過收集91例可疑尿路上皮癌患者的尿液樣本，分別采用新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法和TCT法進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果匯總分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法的敏感性為64.9%，特異性為88.2%，準(zhǔn)確性為69.2%，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法的敏感性較TCT法優(yōu)勢明顯，特異性和準(zhǔn)確性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能為兩者均是病理學(xué)檢查方法，本身特異性高。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對于高級別尿路上皮癌的檢測敏感性(77.8%)明顯高于低級別尿路上皮癌(30.0%)，符合高級別尿路上皮癌分化程度低、易脫落的觀點[8]。與TCT法比較，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在高級別尿路上皮癌診斷中敏感性有優(yōu)勢，在低級別尿路上皮癌診斷中則未體現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是由于單獨一個級別尿路上皮癌的樣本量過低，難以得出有效結(jié)論。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對于肌層浸潤性尿路上皮癌的檢測敏感性(93.2%)明顯高于非肌層浸潤性尿路上皮癌(23.3%)，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法較TCT法在肌層浸潤性尿路上皮癌的診斷中表現(xiàn)出優(yōu)勢，在非肌層浸潤性尿路上皮癌中差異則無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于晚期尿路上皮癌細(xì)胞脫落較多，也更容易在尿液中被捕捉到。兩種方法在不同性別、是否復(fù)發(fā)患者中的檢測敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在膀胱尿路上皮癌的檢測中也未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異，可能是由于本研究樣本量過低的原因。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測方法制作的切片質(zhì)量高，制片的同時還可以行免疫組化檢查[9]，并且制作的切片能與患者術(shù)后的病理切片對照，進(jìn)一步提高準(zhǔn)確性。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在費用方面稍高于TCT法，但在前期尿液預(yù)處理過程中仍有減少費用的空間。

綜上，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法的優(yōu)勢主要有：①與傳統(tǒng)尿脫落細(xì)胞學(xué)方法一樣均為無創(chuàng)檢查，患者接受程度高；②采集尿液量(250 ml以上)較傳統(tǒng)方法多，且尿液采集量還可以增加，對于尿路上皮癌的檢測敏感性較TCT法更高，尤其是對于高級別和肌層浸潤性尿路上皮癌；③用晨起全部尿液代替第2次晨起中段尿，進(jìn)一步減少脫落標(biāo)本的丟失；④用醋酸溶液洗滌尿液去除紅細(xì)胞、黏液、無機(jī)鹽及雜質(zhì)的過程可以重復(fù)，對于血尿嚴(yán)重、黏液多的標(biāo)本較TCT法用濾網(wǎng)過濾的細(xì)胞或組織保存率高；⑤用瓊脂和石蠟包埋的組織或細(xì)胞標(biāo)本不易從玻片上脫落，較大限度地減少了標(biāo)本損失；⑥所制作的切片質(zhì)量高，細(xì)胞多且無重疊，視野清晰，與術(shù)后病理接近，保留脫落細(xì)胞的同時也能保留脫落的組織，后者在TCT法下被提前除去降低了其敏感性。

本研究中的問題與不足：①樣本中細(xì)胞量較少時，在單獨一種病理類型的尿路上皮癌檢測中比較兩種方法的差異無法得出說服力強(qiáng)的結(jié)論，如在非肌層浸潤性尿路上皮癌和低級別尿路上皮癌中得出的結(jié)論；②增加尿液標(biāo)本采集的量原理上能夠進(jìn)一步提高檢出率，但尿液的新鮮程度和保存方式限制了采集量；③在細(xì)胞富集的流程中，需要特別注重操作以防止有形成分的丟失；④醋酸酸洗控制時間不宜過長，以防細(xì)胞形態(tài)變異，需迅速使用生理鹽水沖洗以恢復(fù)細(xì)胞等滲狀態(tài)；⑤本研究中出現(xiàn)了病理結(jié)果為腎源性腺瘤和黏液腺癌的2例樣本，其中腎源性腺瘤在新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法和TCT檢測中均表現(xiàn)為陽性結(jié)果，而黏液腺癌則均表現(xiàn)為陰性，對于尿路上皮癌之外的其他類型的腫瘤，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法和TCT法是否能體現(xiàn)價值，目前還需要更多的研究來驗證；⑥我們在研究中將新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法與TCT法比較時只比較了單次診斷效果，按照目前臨床上均采用連續(xù)3次以上的TCT檢查以提高檢出率，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法如果采用連續(xù)檢測3次的方案，兩種方法對于尿路上皮癌的檢出率均會大大增加，如果以兩種方法各3次的最終結(jié)果作為統(tǒng)計依據(jù)，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法對于TCT法的敏感性優(yōu)勢可能并不能表現(xiàn)出明顯統(tǒng)計學(xué)差異，后續(xù)仍需要進(jìn)一步的研究來證實這一結(jié)論；⑦本研究中對于上尿路尿路上皮癌的樣本未排除有輸尿管腫瘤引起輸尿管梗阻風(fēng)險的患者，這使得兩種方法的假陰性數(shù)量增加，最終敏感性趨于保守。

綜上所述，在本研究中我們設(shè)計的新型方法保留了TCT法無創(chuàng)、高特異性、簡便經(jīng)濟(jì)的特點，突破了細(xì)胞學(xué)對樣本要求高的限制，對于帶組織、血尿嚴(yán)重、黏液多、雜質(zhì)多的樣本均可以做到最大程度的保留樣本，進(jìn)一步提高檢出率。新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在不同級別、不同類型尿路上皮癌中檢測的敏感性較TCT法表現(xiàn)出優(yōu)勢，在診斷高級別、肌層浸潤性尿路上皮癌中的敏感性更明顯，且與性別、復(fù)發(fā)與否、腫瘤位置無明顯相關(guān)性。在保證無創(chuàng)性、簡便經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢下，能進(jìn)一步行免疫組化和術(shù)后病理對照，因此，新型尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法在尿路上皮癌診斷中有一定應(yīng)用價值。