福建酸竹提取物通過調(diào)節(jié)硫氧還蛋白1減輕紫外線誘導的皮膚光損傷的研究

于玲

（福建省輕工業(yè)研究所有限公司，福建 福州 350005）

皮膚是人體最大的器官，作為人體抵御外界侵害的第一道防線，有著保護、調(diào)節(jié)、分泌、保濕、屏障等功能[1,2]。但皮膚長期暴露在具有各種危險因素，如紫外線（Ultraviolet，UV）、化學物等外界環(huán)境中，其功能可能會因這些外源性損傷導致受損，從而失去重要功能。長期UV暴露是誘發(fā)許多皮膚病的主要危險因素，可出現(xiàn)一系列病理生理學改變，包括炎癥、氧化應激、DNA損傷等[3-6]，最終導致皮膚細胞損傷，甚至產(chǎn)生皮膚癌[7-9]。

硫氧還蛋白（Thioredoxin，TXN）系統(tǒng)是具有氧化還原活性的小分子蛋白系統(tǒng)，由硫氧還蛋白（TXN）、硫氧還蛋白還原酶（TXNRD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）三部分組成，在氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用[10-12]。TXN系統(tǒng)中高活性的氧化還原位點（-Cys-X-X-Cys-)，可以有效地保護生物體免受氧化應激和損傷[13]。TXN系統(tǒng)參與了許多至關重要的細胞生物學過程，包括細胞代謝、分化、增殖和凋亡等[14]。作為維持機體氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，如果TXN系統(tǒng)被破壞有可能引起健康問題，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等[15]。

福建酸竹是中國東南部分布最廣的竹種之一，蛋白質(zhì)含量高，鈣、磷元素及纖維含量豐富。據(jù)報道，不同的竹來源制品可用于治療多種疾病，包括炎癥性疾病、消化系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、糖尿病等代謝紊亂性疾病[16-19]，最新研究表明，韓國傳統(tǒng)食品竹鹽具有一定的抗炎活性。在2,4-二硝基氟苯誘發(fā)的特應性皮炎模型中，竹鹽可顯著降低小鼠的血清中瘙癢相關因子的水平，同時減少了炎癥細胞的浸潤[20]，然而BEX在UV誘導的皮膚疾病中的作用還尚不明確，特別是在皮膚光損傷中的作用研究也較為有限。

本研究通過檢測BEX對UVB導致的細胞死亡、凋亡水平及氧化應激水平，并通過蛋白印跡實驗等一系列手段，在細胞水平上進一步探索并驗證BEX在保護UVB誘導皮膚光損傷中的潛在作用機制。

1 實驗部分

1.1 藥品和試劑

本研究中使用的化學物質(zhì)和試劑BEX購自福州百泰生物技術有限公司。

用天平稱量適量BEX干粉劑，溶于蒸餾水中，然后用無菌 0.22 μm 注射過濾器過濾后，制得相應濃度的BEX（10、30、100、300 μg/mL）溶液，-20 ℃保存待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和紫外線輻射

原代人皮膚角質(zhì)形成細胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）中培養(yǎng)，保存于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。UV輻射設備和步驟參照文獻[21]～[25]。

1.2.2 抗體和試劑

Cleaved caspase 3 （#9661，1∶1000）、β-肌動蛋白（#3700，1∶3000）、硫氧還蛋白1（#2429，1∶1000）、硫氧還蛋白2（#14,907，1∶1000）、硫氧還蛋白還原酶1（#15,140，1∶1000）、硫氧還蛋白還原酶2（#12,029，1∶1000）購自Cell Signaling T ec hn ol o g y；種屬特異性二抗購自L I-C O R Biosciences。

1.2.3 細胞活力測定

使用細胞計數(shù)試劑盒-8（Dojindo，日本）檢測細胞活力，將2×105個細胞/孔種于96孔板，培養(yǎng)基100 μL。

1.2.4 蛋白印跡法

樣品在變性的8%～12% SDS-PAGE凝膠（Bio-Rad）上電泳，然后通過電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。在室溫下用封閉緩沖液封閉1 h，一抗在4 ℃下孵育過夜，第二天將封閉好的膜與特定的二抗在室溫下孵育1 h，用ECL試劑檢測，β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 細胞凋亡試驗

通過TUNEL百分比（TUNEL/Hoechst 33,342×100%）測定細胞凋亡率，通過細胞凋亡ELISA檢測試劑盒（Roche，Palo Alto，CA）檢測細胞凋亡。

1.2.6 活性氧檢測

細胞經(jīng)DCFH-DA處理，每隔5 min混勻一次，使其充分作用，其與細胞內(nèi)的ROS反應并導致熒光變化。通過流式細胞儀分析定量處理后細胞中熒光的變化，從而檢測細胞ROS的含量。

1.2.7 細胞轉(zhuǎn)染

混合稀釋的shRNA和稀釋的Lipofectamine 2000，使其制成復合物，在室溫孵育20 min。直接將復合物加入到每孔細胞中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約4～6 h，將孔內(nèi)含有shRNA-Lipofectamine 2000復合物的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染完成后24～72 h內(nèi)可進行shRNA效果監(jiān)測。

1.2.8 TXN 和TXNRD活性測定法

按分組處理細胞后培養(yǎng)24 h。用胰蛋白酶消化細胞，用PBS洗2次，然后在TE緩沖液中進行超聲處理，隨后測量蛋白濃度。按TXN活性熒光檢測試劑盒（瑞士IMCO）和TXNRD檢測試劑盒（美國Sigma公司）公司的方法說明，對總蛋白（20μg）進行TXN和TXNRD活性評估。

1.2.9 統(tǒng)計分析

各獨立實驗至少重復3次，分析數(shù)據(jù)采用平均值±SEM表示，所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05時認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸竹提取物對UVB誘導的皮膚光損傷具有保護作用

為了明確BEX在UVB對原代人角質(zhì)形成細胞活性損傷的保護作用，我們使用BEX（100μg/mL）預處理原代人角質(zhì)形成細胞30 min后，首先用不同劑量強度的UVB（5、10、15、20、25 mJ/cm2）照射原代人角質(zhì)形成細胞后，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。CCK8實驗結(jié)果（圖1A）表明，UVB照射可誘導原代人角質(zhì)形成細胞的死亡，而上述現(xiàn)象可被BEX（100 μg/mL）預處理抑制。進一步的實驗表明，BEX在原代人角質(zhì)形成細胞中表現(xiàn)出劑量依賴的抗UVB活性（圖1B），同時，發(fā)現(xiàn)用100 μg/mL的BEX預處理細胞表現(xiàn)出良好的抗UVB活性，接下來我們選擇該濃度用于后續(xù)研究。

接下來應用western blot檢測cleaved caspase-3水平分析原代人角質(zhì)形成細胞中的細胞凋亡水平。結(jié)果表明，UVB（20 mJ/cm2）照射后cleaved caspase-3蛋白表達水平增高，而用BEX（100 μg/mL）預處理后蛋白表達水平可顯著降低（圖1C和D）。TUNEL測定檢測結(jié)果表明，UVB（20 mJ/cm2）照射后凋亡細胞數(shù)顯著增加，而經(jīng)BEX（100 μg/mL）預處理后可顯著降低細胞凋亡數(shù)（圖1E）。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)在原代人角質(zhì)形成細胞中，UVB（20 mJ/cm2）照射引起了顯著的ROS產(chǎn)生，而BEX（100 μg/mL）預處理極大減少了這種效應（圖1F）。

圖1 BEX保護人皮膚角質(zhì)形成細胞免受紫外線照射

2.2 BEX 調(diào)節(jié)原代人角質(zhì)形成細胞中TXN1水平

TXN 系統(tǒng)是許多生理過程的基礎，包括細胞增殖和凋亡[26]，首先檢測BEX在TXN系統(tǒng)中對UVB照射的原代人角質(zhì)形成細胞的影響。TXN活性檢測和TXNRD活性檢測結(jié)果表明，經(jīng)UVB（20 mJ/cm2）照射后，原代人角質(zhì)形成細胞的TXN和TXNRD活性顯著降低（圖2A和圖2B）。此外，BEX（100 μ g/mL）預處理則極大減弱了這種效應，表明BEX可以有效抑制UVB照射誘導的原代人角質(zhì)形成細胞的TXN和TXNRD活性水平下降現(xiàn)象。

接著應用western blot檢測蛋白TXN1、TXN2、TXNRD1和TXNRD2的表達水平（圖2C和圖2D）。Western blot檢測結(jié)果表明，TXN1蛋白表達水平通過BEX（100 μg/mL）處理顯著升高，而TXN2、TXNRD1和TXNRD2的蛋白表達水平與對照組相比無明顯變化，表明TXN1在BEX的細胞保護功能中起關鍵作用。

圖2 BEX通過調(diào)節(jié)TXN1介導UVB照射誘導原代人角質(zhì)形成細胞損傷的保護作用

2.3 TXN1 敲低減弱BEX介導的UVB誘導的原代人角質(zhì)形成細胞的保護功能

為了研究TXN1在BEX介導的原代人角質(zhì)形成細胞保護的作用，我們使用NTC或TXN1 shRNA轉(zhuǎn)染的原代人角質(zhì)形成細胞進行實驗。如圖3A所示，TXN1敲低顯著降低了BEX（100 μg/mL）預處理組的細胞活力，但它不能完全阻斷BEX的保護功能，表明BEX可能有其他機制來調(diào)節(jié)UVB誘導的皮膚細胞死亡。組蛋白-DNA ELISA測定的數(shù)據(jù)表明，當TXN1被敲低時，BEX（100 μg/mL）預處理，不能減少UVB（20 mJ/cm2）照射誘導的細胞凋亡（圖3B）。以上這些結(jié)果表明TXN1對BEX介導的原代人角質(zhì)形成細胞對UVB的細胞保護至關重要。

圖 3 TXN1對BEX介導的原代人角質(zhì)形成細胞的光損傷作用

3 結(jié)論

TXN 系統(tǒng)參與了BEX介導的原代人角質(zhì)形成細胞的保護作用，BEX通過調(diào)節(jié)TXN1介導UVB照射誘導原代人角質(zhì)形成細胞損傷的保護作用。這些實驗結(jié)果表明BEX在對抗皮膚光損傷中的具有良好的應用前景，為預防或緩解光老化和其他UV引起的皮膚病提供一種潛在治療試劑，并為研發(fā)新型皮膚抗光老化產(chǎn)品提供研究基礎及理論依據(jù)。