放射性唾液腺功能損傷的再生醫(yī)學研究
——從干細胞到無細胞治療

黃桂林

（遵義醫(yī)科大學第五附屬（珠海）醫(yī)院口腔科，廣東 珠海 519180）

放射治療是頭頸部惡性腫瘤治療的主要手段之一，該區(qū)域唾液腺的放射性損傷常常導致口干癥（xerostomia）及唾液分泌減少（hyposalivation）等后遺癥。 近年來，調強放療技術（intensity-modulated radiation therapy，IMRT） 和劑量調節(jié)手段在頭頸部腫瘤放射治療中逐步應用，其部分減少了造成唾液腺損害的放射劑量[1]。 但是，位于頜面部的唾液腺還是不能完全避免輻射的傷害。 目前，臨床上常用的治療方法包括應用催唾劑，如匹羅卡品（pilocarpine）、西維美林（cevimeline）及人工唾液等[2]。 輻射性損害的保護劑Amifostine 近年也在美國上市， 但其毒性可能對腫瘤組織具有保護作用，從而限制了這種藥物在臨床上的應用[3-4]。 我國學者王松靈教授最近發(fā)現，補充膳食中的硝酸鹽能預防放射性損害引起的口干[5]。 以上這些治療及預防措施多數只能部分減緩臨床癥狀，并未能從根本上修復損傷后的唾液腺組織及恢復功能。 從再生醫(yī)學的角度出發(fā)，本文將對輻射引起唾液腺分泌功能障礙的原因， 以及近年來干細胞及無細胞治療的進展進行綜述。

1 放射性唾液腺功能損傷的表現和機制

頭頸部鱗狀細胞癌 （head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）患者在接受放射治療后的1 周內即出現急性唾液腺分泌減少癥狀， 減少量可達正常唾液流量的50%~60%[6]。 而慢性的唾液分泌減少通常是在頭頸部惡性腫瘤放射治療后的6 個月后發(fā)生[7]。 慢性口干可以導致語言障礙，吞咽、進食困難及消化不良，還可以導致猛性齲、牙周炎、口腔黏膜潰瘍、感染等臨床癥狀，對患者全身健康造成嚴重威脅。

放射性唾液腺功能損傷相關機制的研究主要是在動物模型（主要是鼠）上進行的。 在動物接受輻射后的3 d 內， 其唾液腺功能就會出現急性損傷并表現出相應的癥狀， 主要表現為腺泡細胞明顯喪失、唾液流量減少較多、唾液成分明顯改變[8]。 輻射的主要損傷機制包括急性DNA 損害、 腺泡細胞凋亡、鈣通道調節(jié)異常即細胞內鈣水平升高、活性氧（reactive oxygen species）對分泌細胞的損害。 同時，在鼠腮腺細胞中還發(fā)現ATP 酶釋放后激活P2X7受體（purinergic receptor P2X7, P2RX7/P2X7）,導致P2RX7/P2X7 依賴性前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的釋放[9]。在30~300 d 后的慢性期，唾液腺組織中纖維化的發(fā)生和唾液流量明顯減少[10]。 慢性期唾液腺損害的主要機制包括Yes 相關蛋白（Yes-associated protein, YAP） 增加、 代償性增生（compensatory proliferation）、細胞衰老、細胞骨架重排等，這些均導致了慢性病變期間唾液腺組織的損害。 另外，在急性、慢性期均能觀察到血管神經損傷對唾液腺分泌功能有明顯影響。

輻射引起唾液腺功能損傷的機制復雜，各種預防措施及恢復功能的治療，如恢復血管、神經支配，利用藥物保護腺體組織以減輕輻射損害，抗氧化治療等都顯示出了一定的效果。 然而，唾液腺分泌功能的恢復最終還是需要受損腺體中自身干/祖細胞的增殖、分化來補充已經耗竭的、負責分泌功能的腺泡細胞的數量[11]。近年來，隨著干細胞及無細胞治療研究的發(fā)展，放射性唾液腺損傷治療的研究有了較大進展。

2 放射性唾液腺損傷的干細胞治療及無細胞治療的現狀及前景

2.1 放射性唾液腺損傷的干細胞治療

研究者最初設想的是在體外植入干細胞，待干細胞在損傷組織內存活、分化成具有功能結構的組織，從而恢復機體功能。 在早年的研究中包括了多種間充質干細胞（MSCs）的移植治療，如利用骨髓MSCs、造血干細胞、人羊膜MSCs、牙髓干細胞、唾液腺干細胞、 皮膚MSCs 等修復不同組織的損傷[12]。我們將人羊膜MSCs 經腺體局部注射到放射性損傷SD 大鼠唾液腺組織中， 發(fā)現干細胞在體內存活并部分恢復了分泌功能[13]。Lim 等[14]將人脂肪MSCs連續(xù)3 周（每周1 次）經C3H 鼠的尾靜脈注射，12 周后，檢測結果發(fā)現放射性損傷唾液腺的唾液流率明顯增加,唾液分泌延遲時間（salivation lag times）明顯縮短，在第4 周時，在損傷腺體內還能找到移植的脂肪MSCs， 這些干細胞部分已經分化成了具有分泌功能的頜下腺上皮細胞 （salivary gland epithelial cells, SGCs）。 Pringle 等[15]將人頜下腺組織中分離培養(yǎng)得到的、在體外培養(yǎng)具有自我更新能力的c-kit+成體干細胞直接注射到輻射后損傷的鼠唾液腺腺體組織中，結果顯示，這些c-kit+干細胞在鼠的體內能自我更新、分化，最后具有修復唾液腺的分泌功能。Lombaert 等[16]將唾液腺干細胞移植到放射性損傷的唾液腺組織中后，干細胞能定植在唾液腺的主要導管處分化成腺泡細胞， 并形成腺泡樣及導管樣結構，進而改善腺體的分泌功能。 隨后的一系列研究發(fā)現，c-kit+的唾液腺成體干細胞在修復放射性損傷唾液腺功能方面相比其他的干細胞， 具有明顯的優(yōu)勢[15]。盡管c-kit+干細胞在修復放射性損傷唾液腺方面具有明顯優(yōu)勢，但是在作為干細胞供體來源的腺體中，這類細胞的數量卻很少，而且隨著年齡的增加，數量減少得更加明顯，導致治療性來源的干細胞獲取困難[17]。

放射性唾液腺損傷的干細胞治療除了干細胞來源不足、數量不足等問題外，還面臨著許多其他挑戰(zhàn)。 如移植到組織內的單個干細胞很難在受體細胞、神經及血管再生，以及炎癥調節(jié)過程中會產生協(xié)同效應[18]。另外，用于自體移植的唾液腺干細胞還存在免疫反應，植入體內瘤變，細胞在體內能否長期存活、分化及增殖，進而發(fā)揮功能等問題。 而且MSCs 在體內長期存活并分化為腺泡細胞的證據并不確切。 有報道稱，干細胞移植后的1 周，只有<1%的細胞能夠存活下來[19]。 Su 等[20]把這些挑戰(zhàn)總結歸納為：①獲得唾液腺干細胞進行侵入性手術存在困難；②獲取的唾液腺組織有限，難以進行干細胞擴增；③將干細胞輸送到損傷組織存在困難，如通過血管輸送干細胞很可能導致血栓栓塞的并發(fā)癥；④如是異體移植干細胞則可能產生排斥反應；⑤唾液腺干細胞在運輸配送方面存在問題。

有學者在對唾液腺主導管進行結扎制作的腺體損傷模型中發(fā)現，結扎導致腺體內的腺泡上皮細胞損傷，而這種損傷可以被腺體內位于導管內皮的唾 液 腺 干/祖 細 胞 （salivary gland stem/progenitor cells）通過增殖和分化而修復[21]。 另外，人們觀察到少數接受IMRT 的頭頸腫瘤患者， 其分泌功能可以部分自行恢復[22]。以上研究表明，無論是導管結扎的機械性損傷還是放射性損傷的腺體組織，其自身的內源性干細胞均能在一定條件下增殖、分化，從而對損傷的腺體組織進行自我修復，進而恢復腺體的分泌功能。 人們以往觀察到的干細胞移植修復放射性損傷唾液腺功能的原因可能并非是植入腺體組織內干細胞分化成腺泡細胞的結果，而是移植的干細胞通過旁分泌作用于腺體自身內源性干細胞的結果。 也就是說，放射性損傷后，唾液腺組織的內源性干細胞可以在一定條件的刺激下增殖、 分化，進行受損腺體的功能修復。Mimeault 等[23]認為，組織內存活并駐留的干細胞能夠繼續(xù)釋放生長因子對損傷的組織進行修復， 并能分化為組織特異性細胞（tissue-specific cells）。Pringle 等[15]研究發(fā)現，通過激活唾液腺組織中受到放射性損傷而處于休眠狀態(tài)的內源性干細胞，可以自我修復損傷唾液腺的部分分泌功能。 Nguyen 等[24]也證實了放射性損傷后，鼠的腮腺組織內仍能夠分離培養(yǎng)出能形成腺體細胞微球（salisphere）的單個細胞，他們進而認為放射性損傷唾液腺功能的修復可以通過這些干細胞的分化、增殖來實現。 以上研究均說明，只要能激活放射性損傷唾液腺組織內本身尚存的、處于休眠狀態(tài)的干細胞，促使它們增殖、分化為功能性腺泡細胞，進而恢復分泌功能，就能達到修復損傷腺體功能的目的。 這些研究成果為無細胞治療的研究提供了理論依據。

2.2 放射性唾液腺損傷的無細胞治療

近年來，干細胞治療的模式開始逐步轉變。 最初人們設想的干細胞在病灶區(qū)增殖、分化，重新構建組織結構的愿望并未完全實現。 有研究發(fā)現，被標記的MSCs 注入體內后， 雖然有部分細胞能夠到達受植靶器官，但這些干細胞很快就消失了。 動物實驗研究證實， 經靜脈注入的MSCs 雖然有少部分能夠到達受損組織，但大部分都被肺部的毛細血管攔截并清除了[25]。 盡管干細胞能否在體內存活的問題受到質疑， 但MSCs 植入體內的短期治療效果是肯定的。 多年來的研究發(fā)現，MSCs 能產生大量的生長因子并能調節(jié)免疫系統(tǒng)。 有研究也證實了SD 大鼠唾液腺細胞與人羊膜上皮細胞（amniotic epithelial cell）之間存在細胞旁分泌的交互作用，細胞因子在細胞之間的相互影響[26]?；谶@些發(fā)現，學者們逐漸意識到移植到損傷組織內的干細胞起到的修復治療作用實際是旁分泌因子的結果，而非移植入體內存活的干細胞進行再生修復的結果[27]。Bruno 等[28]及Lai 等[29]的研究分別證實了MSCs 來源的細胞微囊泡（microvesicles，MVs）、外泌體能防止腎臟損傷，減少心肌梗死的面積。隨后，包括MSCs 的細胞裂解液（extract）、分泌物（secretome）、外囊泡（EVs）及外泌體對放射性損傷組織再生修復的研究均證實了它們的治療效果。 Tran 等[30]在前期應用骨髓來源細胞移植重建輻射損傷的唾液腺功能成功的基礎上，將該細胞裂解后的胞內可溶性物質用于治療放射性損傷小鼠的腺體功能，結果發(fā)現，無論是局部腺體內注射還是靜脈注射，裂解液均能修復唾液腺的功能，保護唾液腺的腺泡細胞、導管及肌上皮細胞和干細胞， 還能促進損傷組織中細胞和血管增殖，上調與組織再生和修復相關的基因， 如MMP2、CyclinD1、BMP7、EGF、NGF 基因。 他們將這種細胞提取物命名為“骨髓細胞湯（bone marrow soup）”。 An等[31]在研究低氧預處理脂肪干細胞修復放射性損傷唾液腺功能的機制時發(fā)現，放射損傷后，唾液腺組織內上皮細胞、內皮細胞、肌上皮細胞和涎腺干細胞均受到MSCs 分泌的蛋白質組 （secreted proteome）的保護，其富含GM-CSF、VEGF、IL-6、IGF-1等促進組織修復的相關因子，他們認為放射損傷唾液腺組織修復的部分原因應該是MSCs 分泌的營養(yǎng)因子作用的結果。 Lombaert 等[16]總結了MSCs 中含有 的EGF、FGF2/7、G-CSF、SHH、VEGF、WNT 等 各種細胞因子的作用：它們通過各種信號途徑阻止放射性損傷細胞的凋亡，促進腺體內處于休眠狀態(tài)的內源性干細胞增殖，減少氧化應激反應和脂質的過氧化反應；用這些分泌物修復損傷組織的效果明顯優(yōu)于全細胞、單個或多個因子的聯合應用。 Su 等[20]切取人的小唾液腺（頰腺）后進行唾液腺干細胞分離、擴增，然后對干細胞進行3 個循環(huán)的凍融，高速離心后獲得頰部唾液腺干細胞提取液 （labial stem cells extract，LSCE），將這些提取液經血管注射到放射性唾液腺損傷的小鼠體內，損傷的唾液腺功能得到部分恢復。 他們還檢測到這些提取液中主要含有與血管形成相關的生物因子（FGF-1、FGF-2、KGF、angiopoietin、uPA、VEGF）和有神經營養(yǎng)作用的血管形成因子（PEDF、PTX3、VEGF）。 這些生物因子對放射性損傷的唾液腺均有保護和功能修復作用。 如在LSCE 中表達最高的FGF-2，是一種眾所周知的有絲分裂素，在血管生成和傷口愈合中起重要作用。 另外，轉染內皮細胞的FGF-2 是放射性損傷唾液腺治療的關鍵因子。 該因子對放射誘導的唾液腺細胞凋亡也具有明顯的保護作用[32-33]。 這些研究說明，利用干細胞分泌的生物活性因子就有可能修復放射性損傷的唾液腺組織，進而恢復其分泌功能。

隨著研究的進展， 人們逐步認識到應用MSCs來源的EVs 正成為可能代替干細胞治療的有效手段。 EVs 是細胞釋放的一類膜性小囊，主要包括外泌體和MVs。 EVs 中含有多種生物活性物質，如mRNA、 miRNA、非編碼RNA（non-coding RNA）、蛋白、脂質體及DNA。這些物質具有減輕炎癥、促血管生成和促進損傷組織內干/祖細胞存活及增殖的組織修復作用[34]。

雖然迄今為止我們還未查閱到有關EVs 修復放射性損傷唾液腺功能的相關信息。 EVs 在修復造血系統(tǒng)、肝臟、肺、消化道系統(tǒng)及皮膚的放射性損傷中有相關報道[35]。有研究證實，MSCs 可通過分泌EVs發(fā)揮其復雜的旁分泌抗炎、 抗纖維化和促再生作用，進而修復放射性損傷的組織[36]。EVs 主要是通過提高組織或器官中干/祖細胞的增生及存活來促進血管增生，抗炎、抗氧化作用，以及減少纖維化發(fā)生來達到修復組織放射性損傷的目的[37]。在神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病的治療研究中，MSCs外泌體也表現出了理想的組織修復效果[38]。 外泌體對組織損傷修復的主要機制包括減輕炎癥反應、促血管生成及促進損傷組織內干/祖細胞存活及增殖的組織修復作用[34]。 還有研究發(fā)現，受到輻射的細胞膜上高表達能促進外泌體被受損細胞攝取整合素和四磷酸復合物CD29/CD81[39]。外泌體可通過miRNA 保護輻射對組織造成的急性或慢性損傷，這表明輻射照射后，細胞可能利用外泌體來增加其對電離輻射的抵抗力[40]。 miRNA-210 可通過控制缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的轉錄從而對輻射損傷的細胞DNA 進行有效修復[41]。到目前為止，外泌體修復放射性損傷組織的具體作用機制并不清楚。Pu 等[35]在造血系統(tǒng)放射性損傷的研究中認為， 其機制包括3 個方面： ①外泌體中的miRNA 對放射損傷的血細胞具有促進再生和抗凋亡作用， 比如骨髓基質干細胞外泌體中，miRNA-221、miRNA-451、miRNA-654-3p 能促進放射損傷骨髓細胞再生， 而miRNA-210-5p、miRNA-106b-3p 和miRNA-155-5p 能防止血細胞的凋亡；②外泌體可以通過刺激造血相關細胞因子的分泌來恢復造血功能，研究表明，外泌體能夠在體外誘導巨噬細胞產生高水平的造血相關細胞因子，如G-CSF、IL-6、IL-8及VEGF； ③骨髓MSCs 外泌體能直接恢復輻射后的骨髓MSCs[35]。

2.3 放射性唾液腺損傷再生醫(yī)學研究的前景

非細胞治療在放射性損傷組織修復再生的研究中表現出良好的效果，也給以后可能的標準化治療提供了希望。 但是，包括其他組織在內的唾液腺放射性損傷的非細胞修復治療尚存在許多問題，如放射性組織損傷修復的具體機制， 特別是miRNA及non-coding RNA 等的再生修復機制仍不清楚，有待深入研究。 另外，MSCs 分泌的細胞因子和（或）外泌體攜帶物的穩(wěn)定性問題， 如MSCs 在體外低氧預處理后，其分泌的細胞因子與常氧處理后的細胞因子有一定變化；而體外培養(yǎng)條件也會影響干細胞外泌體中miRNA 的攜帶量[42]。 此外，無細胞治療的細胞因子或是外泌體在純化、所含成分的定性及定量上都存在許多困難。 這些因素都影響了研究結果的一致性，也是下一步需要研究的問題。 不過，多年的研究也證實，無論是MSCs 的裂解液、分泌物蛋白還是EVs，在放射性唾液腺或其他組織/器官損傷中的修復治療效果都是肯定的。 我們認為，放射性唾液腺功能損害的修復應該包括再生醫(yī)學在內的多種手段的綜合治療，這樣才可能達到更好的治療效果。