血清HBV RNA在抗病毒治療中的應(yīng)用進(jìn)展*

張 琪 綜述，秦 波 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科 400016)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個(gè)全球性健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬人死于HBV感染相關(guān)疾病和并發(fā)癥，尤其是肝硬化和原發(fā)性肝癌[1]。目前用于治療乙型肝炎的抗病毒藥物主要包括兩大類：核苷類似物(nucleoside analogues,NAs)和干擾素(interferon,IFN)。隨著它們的廣泛應(yīng)用，HBV的復(fù)制得到了有效抑制，肝硬化和肝癌的發(fā)生也得到了改善。

肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的持續(xù)存在是導(dǎo)致HBV感染慢性化的主要原因。肝內(nèi)cccDNA的清除意味著慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)完全治愈[2]。NAs或IFN均無法直接作用于肝內(nèi)cccDNA，因而完全治愈幾乎無法實(shí)現(xiàn)。目前多以臨床治愈作為CHB治療的理想終點(diǎn)，即治療后乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA，HBV DNA)持續(xù)消失、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)轉(zhuǎn)陰、伴或不伴HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，而無論肝內(nèi)cccDNA是否被清除[1-3]。肝內(nèi)cccDNA的存在使得達(dá)到臨床治愈的患者仍面臨停藥后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，因而大多數(shù)CHB患者需長期甚至終生服藥。

理論上，監(jiān)測肝內(nèi)cccDNA水平對評估CHB患者病情及評估抗病毒治療療效均有幫助。臨床工作中由于肝穿刺難以推廣，肝內(nèi)cccDNA的監(jiān)測困難重重，亟待尋找可以反映肝內(nèi)cccDNA存在及活性的新指標(biāo)。血清HBV RNA就是近年的研究熱點(diǎn)之一。其作為一種新型血清學(xué)標(biāo)志物[4]，已被證明是包含前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)及其剪切變異體的病毒樣顆?；蛞職た贵w復(fù)合物。而pgRNA由肝內(nèi)cccDNA直接轉(zhuǎn)錄形成，因此，血清HBV RNA在一定程度上也可以反映肝內(nèi)cccDNA存在與活性，且在反映抗病毒治療應(yīng)答及預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)等方面也具有重要意義。本文將對血清HBV RNA的來源及性質(zhì)，血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA的關(guān)系，以及血清HBV RNA在抗病毒治療中可能的作用進(jìn)行綜述。

1 血清HBV RNA的來源及性質(zhì)

HBV是有包膜的DNA病毒，其基因組為部分雙鏈環(huán)狀DNA(relaxed-cirular DNA,rcDNA)。HBV通過與肝細(xì)胞膜上的鈉離子-牛磺膽酸-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合進(jìn)入肝細(xì)胞。進(jìn)入肝細(xì)胞后，rcDNA在細(xì)胞核內(nèi)以負(fù)鏈DNA為模板形成cccDNA，接著以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄形成3.5×103、2.4×103、2.1×103、0.7×103這4種不同長度的mRNA。其中長3.5×103的pgRNA作為模板，在聚合酶作用下逆轉(zhuǎn)錄形成rcDNA，同時(shí)募集乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)形成核衣殼。這些含有病毒基因組的核衣殼一方面可以獲得病毒包膜后形成完整的病毒顆粒，另一方面也可以直接進(jìn)入肝細(xì)胞核作為肝內(nèi)cccDNA儲(chǔ)備。

自1996年在慢性HBV感染者血清內(nèi)發(fā)現(xiàn)HBV RNA以來，血清HBV RNA的來源一直受到廣泛關(guān)注。最近WANG等[5]證實(shí)血清HBV RNA實(shí)際上是由未經(jīng)轉(zhuǎn)錄或部分轉(zhuǎn)錄的pgRNA經(jīng)衣殼化、被HBsAg包裹所形成的病毒樣顆粒。JANSEN等[6]通過使用去污劑破壞HBsAg包膜，并利用HBcAg特異性抗體行免疫沉淀，進(jìn)一步證明了血清HBV RNA與病毒樣顆粒的關(guān)聯(lián)：即血清HBV RNA存在于含有衣殼和包膜的病毒樣顆粒中。隨后，PRAKASH等[7]也通過梯度分離和核糖核酸酶實(shí)驗(yàn)表明，血清中的HBV RNA存在于病毒樣顆粒中，其結(jié)構(gòu)類似于含有包膜、攜帶HBV DNA的傳染性單顆粒。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA是多聚腺苷酸化的，具有基因組長度。BAI等[8]實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA主要由pgRNA或被聚合酶水解形成的pgRNA剪切變異體組成，在長度上具有異質(zhì)性，從3.5×103到數(shù)百個(gè)核苷酸不等；主要以衣殼-抗體復(fù)合物形式循環(huán)，少部分以病毒樣顆粒形式循環(huán)。而針對這些病毒樣顆粒的研究顯示，NAs治療下血清中的HBV RNA病毒樣顆粒缺乏傳染性，其中3′-末端截短體的形成可能是造成這些病毒樣顆粒復(fù)制缺陷的主要原因[9]。

因此，血清HBV RNA實(shí)際上是包含pgRNA及其剪切變異體的病毒樣顆粒或衣殼抗體復(fù)合物，目前的研究顯示在NAs治療時(shí)這些病毒樣顆粒不具有傳染性，而在未接受NAs治療的患者中，HBV RNA病毒樣顆粒是否具有感染能力仍需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

2 血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA的關(guān)系

前述已提及pgRNA由肝內(nèi)cccDNA直接轉(zhuǎn)錄而來，因而血清HBV RNA在一定程度上可以反映肝內(nèi)cccDNA存在與活性。GIERSCH等[10]研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的HBeAg陽性的HBV感染小鼠的血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA水平相關(guān)(r=0.89,P<0.001)。WANG等[5]使用恩替卡韋/拉米夫定阻斷體外細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠HBV DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性后，發(fā)現(xiàn)pgRNA病毒樣顆粒水平上升，提示NAs僅阻斷rcDNA生成而不影響pgRNA合成,因而提出NAs治療下血清HBV RNA水平仍可反映肝內(nèi)cccDNA存在及轉(zhuǎn)錄活性。

GAO等[11]關(guān)于HBeAg陽性CHB患者的一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示基線肝內(nèi)cccDNA水平和血清HBV RNA水平相關(guān)(r=0.25，P=0.02)，但較HBsAg與肝內(nèi)cccDNA相關(guān)性低(r=0.36，P<0.01)。NAs治療后，肝內(nèi)cccDNA下降水平與血清HBV RNA下降水平相關(guān)(r=0.28，P<0.05)，但低于與HBsAg(r=0.38,P<0.01)和HBV DNA(r=0.35,P<0.01)下降的相關(guān)性。CHEN等[12]研究認(rèn)為與HBV RNA和HBsAg相比，乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原(hepatitis B virus core antigen associated antigen,HBcrAg)與cccDNA有更好的相關(guān)性。研究共納入未接受過抗病毒治療的85例HBeAg陽性者和25例HBeAg陰性者，經(jīng)多變量線性回歸分析發(fā)現(xiàn)在HBeAg陽性者，血清HBcrAg、HBsAg和HBV RNA均與肝內(nèi)cccDNA相關(guān)，其中血清HBcrAg(β=0.563，P<0.001)與cccDNA的相關(guān)性優(yōu)于血清HBsAg(β=0.328，P<0.001)和HBV RNA(β=0.180，P=0.003)。在HBeAg陰性者，只有血清HBcrAg與肝內(nèi)cccDNA水平相關(guān)(β=0.774，P<0.001)。上述研究均表明血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA相關(guān)性較好，但其并不是用于反映肝內(nèi)cccDNA的單一優(yōu)勢指標(biāo)。

血清HBV DNA聯(lián)合HBV RNA在反映肝內(nèi)cccDNA活性方面顯示出優(yōu)越性。HUANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)CHB患者的血清HBV DNA聯(lián)合HBV RNA對于反映肝內(nèi)cccDNA水平(r=0.412，P<0.001)優(yōu)于單用HBV RNA(r=0.363，P<0.001)或HBV DNA(r=0.367，P<0.001)。進(jìn)一步分層分析顯示，這一現(xiàn)象僅在HBeAg陽性者中存在，提示血清HBV RNA聯(lián)合HBV DNA在反映HBeAg陽性者肝內(nèi)cccDNA活性方面具有優(yōu)勢。

因此，血清HBV RNA在一定程度上可反映肝內(nèi)cccDNA存在及活性，但或許不是反映肝內(nèi)cccDNA的最優(yōu)指標(biāo)。如果能將血清HBV RNA和HBV DNA或HBcrAg、HBsAg等指標(biāo)結(jié)合在一起，肝內(nèi)cccDNA水平或許能更可靠、更準(zhǔn)確地被反映出來，但血清HBV RNA具體該如何與其他指標(biāo)聯(lián)用仍需要進(jìn)一步研究。

3 血清HBV RNA在抗病毒治療中的應(yīng)用

3.1 血清HBV RNA可反映抗病毒治療應(yīng)答

多種研究表明基線血清HBV RNA可預(yù)測抗病毒治療應(yīng)答。LUO等[14]經(jīng)過回歸分析發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA是預(yù)測HBeAg血清轉(zhuǎn)化和病毒學(xué)應(yīng)答的獨(dú)立指標(biāo)?；€血清HBV RNA<4.12 log10拷貝/毫升的患者更易實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(靈敏度和特異度均為80%)。JANSEN等[6]一項(xiàng)研究包括86例接受聚乙二醇干擾素(pegylated interferon,Peg-IFN)和NAs聯(lián)合治療的患者，該研究顯示低基線血清HBV RNA水平可以預(yù)測HBeAg陰性患者聯(lián)合治療應(yīng)答效果(OR=0.44，P=0.19)。

除基線血清HBV RNA水平外，抗病毒治療過程中血清HBV RNA水平及其變化也能預(yù)測抗病毒治療應(yīng)答情況。VAN CAMPENHOUT等[15]對76例接受Peg-IFN單獨(dú)治療、55例接受Peg-IFN聯(lián)合拉米夫定治療的患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)治療第12、24周的血清HBV RNA水平顯示出預(yù)測HBeAg血清轉(zhuǎn)化的良好能力(受試者工作特征曲線下面積>0.75，P<0.001)。治療第12周血清HBV RNA>5.5 log10拷貝/毫升可協(xié)助早期辨別30%的治療無應(yīng)答者(陰性預(yù)測值>90%)。GAO等[11]則發(fā)現(xiàn)NAs治療96周后，實(shí)現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者血清HBV RNA水平明顯更低(P<0.01)，而在基線、治療后第48、72周時(shí)兩組血清HBV RNA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。筆者研究后認(rèn)為兩個(gè)研究在時(shí)間上顯示出的差異性或許與NAs及IFN抗病毒機(jī)制不同有關(guān)：NAs主要通過抑制逆轉(zhuǎn)錄過程實(shí)現(xiàn)抗病毒作用，而IFN則同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)及抗病毒作用，因而IFN較NAs更能有效地抑制HBV復(fù)制、耗竭肝內(nèi)cccDNA儲(chǔ)備，從而使血清HBV RNA水平更早下降，幫助更早預(yù)測HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

血清HBV RNA聯(lián)合其他血清學(xué)指標(biāo)較其單一使用時(shí)能更好地預(yù)測抗病毒治療應(yīng)答。LIAO等[16]對16例長期接受NAs治療、血清HBV DNA持續(xù)低于檢測下限的HBeAg陽性CHB患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)9例發(fā)生了HBeAg轉(zhuǎn)陰的患者其血清HBV RNA及HBcrAg水平下降更為明顯(P<0.05)。表明對于接受NAs治療且實(shí)現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答的患者，血清HBV RNA和HBcrAg有助于監(jiān)測抗病毒治療效果。WANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性者經(jīng)恩替卡韋治療后，第24周時(shí)的血清HBV RNA水平是HBeAg血清轉(zhuǎn)化的有力預(yù)測因子，但血清HBV RNA聯(lián)合HBeAg預(yù)測HBeAg血清轉(zhuǎn)化優(yōu)于單用血清HBV RNA。

因此，基線及抗病毒治療后血清HBV RNA及其變化在反映抗病毒治療應(yīng)答方面顯示出一定優(yōu)勢。但血清HBV RNA聯(lián)合HBcrAg或HBeAg等指標(biāo)可能將進(jìn)一步優(yōu)化抗病毒治療效果評價(jià)體系。未來以血清HBV RNA為基礎(chǔ)的抗病毒治療應(yīng)答評價(jià)體系的具體應(yīng)用需要更多的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

3.2 血清HBV RNA可預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)

血清HBV RNA能反映停藥時(shí)肝內(nèi)cccDNA狀態(tài)，因而在預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)方面具有重要作用。WANG等[5]對33例接受NAs治療后達(dá)停藥標(biāo)準(zhǔn)的CHB患者進(jìn)行停藥后隨訪，發(fā)現(xiàn)停藥時(shí)血清HBV RNA陽性的21例患者全部出現(xiàn)復(fù)發(fā)，停藥時(shí)血清HBV RNA陰性的12例患者僅3例發(fā)生復(fù)發(fā)(100%vs.25%,P=0.001)，提示停藥時(shí)血清HBV RNA水平是監(jiān)測NAs治療安全停藥的潛在指標(biāo)。另一項(xiàng)研究對32例接受Peg-IFN單獨(dú)治療或與NAs聯(lián)合治療后，實(shí)現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)、HBV DNA低于檢測下限的CHB患者進(jìn)行研究[18]。停藥后隨訪發(fā)現(xiàn)，治療結(jié)束時(shí)血清HBV RNA陽性的所有7例患者在停藥后均出現(xiàn)HBsAg逆轉(zhuǎn)、HBV DNA復(fù)陽，而HBV RNA陰性的25例患者中僅5例出現(xiàn)HBsAg逆轉(zhuǎn)、HBV DNA復(fù)陽。該研究表明這些看起來實(shí)現(xiàn)了“功能治愈”的CHB患者，其HBV復(fù)制模板(尤其是停藥時(shí)血清HBV RNA呈陽性的患者)——cccDNA，可能仍然具有轉(zhuǎn)錄活性，停藥后仍面臨較大的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。SETO等[19]的研究發(fā)現(xiàn)停藥時(shí)血清HBV RNA≥44.6 U/mL的患者停藥后發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)更高(48周累積發(fā)生率為93.2%)，提示停藥時(shí)血清HBV RNA≥44.6 U/mL的患者不應(yīng)輕易中斷NAs治療。

血清HBV RNA聯(lián)合其他血清學(xué)指標(biāo)可預(yù)測停藥后持續(xù)應(yīng)答，用于指導(dǎo)安全停藥。FAN等[20]納入130例治療前HBeAg陽性、接受替比夫定或阿德福韋治療并達(dá)到停藥標(biāo)準(zhǔn)的CHB患者，發(fā)現(xiàn)停藥時(shí)實(shí)現(xiàn)血清HBV RNA和HBV DNA雙陰性的患者臨床復(fù)發(fā)比例(8.0%)明顯低于停藥時(shí)未達(dá)雙陰性的患者(31.4%，P=0.018)，該結(jié)論在40例接受恩替卡韋或替諾福韋治療的HBeAg陽性患者中同樣適用。提示治療結(jié)束時(shí)血清HBV RNA和HBV DNA雙陰性與HBeAg陽性患者停止治療后的持續(xù)應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。FAN等[21]另一項(xiàng)研究對127例基于替比夫定治療的HBeAg陽性患者進(jìn)行停藥后隨訪，發(fā)現(xiàn)在治療結(jié)束時(shí)血清HBV RNA和HBcrAg均為陰性者未出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)，而治療結(jié)束時(shí)血清HBV RNA和HBcrAg均為陽性者有46.8%在隨訪期間出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)(P<0.001)，該結(jié)論在59例使用恩替卡韋或替諾福韋治療的患者同樣適用，提示血清HBV RNA聯(lián)合HBcrAg可用于指導(dǎo)NAs治療后安全停藥。CAREY等[22]研究則表明對于在NAs治療下、HBV DNA持續(xù)檢測不到的患者，血清HBV RNA和HBcrAg仍然是反映HBeAg陰性者肝內(nèi)cccDNA持續(xù)轉(zhuǎn)錄的靈敏血清學(xué)指標(biāo)，兩者同時(shí)也是預(yù)測停藥后谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高及病毒學(xué)復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。

因此，停藥時(shí)血清HBV RNA水平可預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)，協(xié)助指導(dǎo)安全停藥。相比而言，停藥時(shí)血清HBV RNA陽性者在停藥后面臨更大的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因而不應(yīng)輕易停止抗病毒治療。此外，停藥時(shí)血清HBV RNA聯(lián)合HBV DNA或HBcrAg預(yù)測雙陰性患者停藥將更為安全，其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用需要進(jìn)一步研究。

3.3 血清HBV RNA相關(guān)的新型抗病毒藥物

由于血清HBV RNA在CHB患者抗病毒治療過程中的重要作用，近年來針對阻斷血清HBV RNA生成的衣殼裝配調(diào)節(jié)劑(capsid assembly regulators,CAMs)也受到了一定關(guān)注。CAMs大致可分為兩大類[23]，一類是以NVR 3-1983為代表的苯丙烯酰胺和氨磺酰苯甲酰胺化學(xué)物，另一類是以BAY 4109為代表的雜芳基二氫嘧啶類化合物。前者可促進(jìn)衣殼類似物的形成，后者則誘導(dǎo)和聚集異常衣殼結(jié)構(gòu)。CAMs可以引導(dǎo)衣殼進(jìn)行錯(cuò)誤組裝，導(dǎo)致pgRNA的包裹受到抑制，進(jìn)而阻止了pgRNA病毒樣顆粒(即血清HBV RNA)的產(chǎn)生；另外CAMs還可以抑制HBV DNA復(fù)制，導(dǎo)致丹顆粒的形成受到抑制。由于肝內(nèi)cccDNA來源于pgRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)，因而通過CAMs抑制pgRNA的生成或許會(huì)幫助耗竭肝內(nèi)cccDNA儲(chǔ)備，向完全治愈更近一步。雖然目前暫無相關(guān)上市藥物，但CAMs藥物的研究將為眾多的CHB患者帶來更多的希望。

4 總結(jié)與展望

血清HBV RNA不僅可反映抗病毒治療應(yīng)答，還能預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)，其與HBV DNA、HBcrAg、HBsAg等指標(biāo)聯(lián)合使用時(shí)更具優(yōu)勢。目前已有學(xué)者提出基于血清HBV RNA的一些新概念，如將病毒學(xué)應(yīng)答重新定義為血清HBV DNA和HBV RNA的持續(xù)丟失[24]；提出“準(zhǔn)臨床治愈”概念，即血清HBV DNA、HBV RNA持續(xù)丟失伴血清HBsAg低水平[24]；將隱匿性肝炎(occult hepatitis,OBI)重新定義為在HBsAg檢測不到的個(gè)體血清或肝臟中,HBV DNA和(或)HBV RNA持續(xù)陽性[18]。而筆者認(rèn)為，未來血清HBV RNA在臨床中具體該如何應(yīng)用仍需進(jìn)一步大規(guī)模、前瞻性、系統(tǒng)性研究。此外，血清HBV RNA水平與慢性HBV感染的時(shí)期[25-26]、HBeAg狀態(tài)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平、基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子突變和HBV基因型均相關(guān)[15]。因此，血清HBV RNA作為臨床標(biāo)記物的使用，還必須考慮這些因素，相信未來阻斷血清HBV RNA合成的多靶點(diǎn)藥物將會(huì)為乙肝治愈提供新的可能。