菌群干預(yù)與免疫治療的研究進(jìn)展

張 慧，胡廣越，殷 紅

（1.馬鞍山市人民醫(yī)院血液科，安徽 馬鞍山 243000；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇 蘇州 215006）

隨著全球人口的快速增長和老齡化，癌癥作為人類主要死因的地位日益突出。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，癌癥是172 個(gè)國家中91 個(gè)國家70 歲以前死亡的第1 或第2 大原因，預(yù)計(jì)癌癥即將成為21世紀(jì)世界各國提高預(yù)期壽命的主要原因和唯一最重要的障礙[1]。目前傳統(tǒng)癌癥治療方式存在治愈率不高的問題，探索新型、有效治療方法成為亟待解決的問題，故免疫治療的興起備受矚目，研究進(jìn)展最多的為免疫檢查點(diǎn)抑制劑（CTLA-4、PD-1/PD-L1 單抗）。人體腸道內(nèi)有著種類繁多的微生物菌落，起到連接外界環(huán)境和人體環(huán)境的作用。隨著人們對腸道菌群的認(rèn)識越來越深入，發(fā)現(xiàn)其可以通過直接及間接促癌、影響局部免疫及全身免疫的方式調(diào)節(jié)人類免疫系統(tǒng)，從而在增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)、改善免疫不良反應(yīng)起到關(guān)鍵作用[2-4]，故通過菌群調(diào)節(jié)方式輔助免疫治療成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)，如糞便微生物移植、益生菌等。本文主要總結(jié)近年來國內(nèi)外菌群調(diào)節(jié)方式的研究進(jìn)展。

1 腸道微生物與腫瘤、免疫治療現(xiàn)狀

1.1 腸道微生物與腫瘤 人體腸道是一個(gè)大型微生物群落的生態(tài)系統(tǒng)，具有復(fù)雜性、多樣性、差異性、動態(tài)性，在人類健康與疾病中發(fā)揮的關(guān)鍵作用越來越受到關(guān)注和認(rèn)知，包括無害的共生菌及致病菌群[5-7]。大量的研究表明，微生物群可通過多種機(jī)制促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展，如釋放基因毒素誘導(dǎo)DNA 損傷、利用LPS 配體（TLRs）和MAMPs 結(jié)合激活釋放促炎因子[8-10]以及有害細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生成。然而研究也證實(shí)菌群發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸（SCFA）可以誘導(dǎo)髓系免疫細(xì)胞和結(jié)腸的Treg 細(xì)胞生成發(fā)揮抗炎抑癌作用；部分益生菌，如乳酸桿菌具有抑制癌癥作用?？傊c道菌群可以直接或者間接的發(fā)揮局部或者全身免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)腫瘤發(fā)生；同時(shí)，腸道菌群也能增強(qiáng)免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的潛力。

1.2 腸道微生物與免疫治療 免疫治療通過激活人體自身免疫機(jī)制殺死腫瘤細(xì)胞，其中免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）即阻斷特異性免疫檢查點(diǎn)CTLA-4 和PD-1/PD-L1 的單克隆抗體（mAbs），其通過活化T細(xì)胞（輔助T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞）及TCR 共刺激信號增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)發(fā)揮療效[10]，其在惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等效果持久[11,12]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑同時(shí)也阻斷了免疫自身耐受導(dǎo)致免疫相關(guān)不良反應(yīng)，尤其是免疫性結(jié)腸炎[13]。此外，有報(bào)道證實(shí)免疫檢查點(diǎn)抑制劑可加速腫瘤進(jìn)展[14，15]。有研究比較了接受PD-1 抑制劑治療的非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌患者的腸道菌群，應(yīng)答者糞便中阿克曼菌水平顯著高于無應(yīng)答者，分別移植應(yīng)答者、無應(yīng)答者糞便至無菌或者抗生素處理過的小鼠，接受應(yīng)答者糞便移植的小鼠產(chǎn)生PD-1 抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)，通過口服阿克曼菌，可增強(qiáng)PD-1 抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)[16]。Maston V 等[17]收集、檢測42 例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的糞便標(biāo)本，比較應(yīng)答者與非應(yīng)答者腸道菌群組成，發(fā)現(xiàn)菌群組成存在差異性，應(yīng)答者長雙歧桿菌、產(chǎn)氣柯林斯菌、糞腸球菌豐度更高。Gopalakrishnan V 等[18]也在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。Chaput N 等[13]、Dubin K 等[19]在經(jīng)伊匹木單抗治療的研究中均發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者糞便樣本中糞桿菌豐度高。上述研究表明，免疫治療除本身影響腸道微生物多樣性外，腸道菌群組成、豐度也影響免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效，且不同免疫治療優(yōu)勢菌存在差異，這為干預(yù)腸道菌群進(jìn)而輔助免疫治療效果提供了新的視角。

2 腫瘤免疫相關(guān)的菌群干預(yù)方式

2.1 抗生素 抗生素指所有人工制造或自然產(chǎn)生的抑制細(xì)菌生長的低分子量化合物。通常用于去除或者預(yù)防人體內(nèi)細(xì)菌定植，但存在非特異性，不能針對特定菌株，對腸道菌群有雙重影響。在免疫治療前預(yù)防性抗感染處理，清除有害菌、降低感染風(fēng)險(xiǎn)，可提高CTLA-4 抑制劑效應(yīng)[20]。但是，抗生素可打破宿主菌群平衡，改變腸道微生物組成、降低多樣性，引發(fā)菌群失調(diào)，從而降低ICI 療效?？股氐膽?yīng)用已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)顯著影響腸道微生物群落中AMR 基因的豐度和多樣性[21-23]，大量研究顯示抗生素誘導(dǎo)的菌群失調(diào)在小鼠模型上有負(fù)面作用。Derosa L 等[24]研究接受PD-1/PD-L1 抑制劑治療的晚期腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌患者，非小細(xì)胞肺癌（20%）和腎癌（13%）患者在開始PD-1/PD-L1 治療后30 d 內(nèi)使用ATB 的頻率相似，然而使用抗生素的患者中位生存時(shí)間和無進(jìn)展生存時(shí)間明顯短于未使用抗生素者，這可能與抗生素暫時(shí)改變微生物群落的組成相關(guān)[25]。聯(lián)合使用廣譜抗生素（氨芐西林+粘菌素+鏈霉素）和亞胺培南（但不包括粘菌素）破壞了CTLA-4特異性抗體的抗腫瘤作用，注射CTLA-4 抗體后微生物群落顯著改變，導(dǎo)致類桿菌相對豐度降低，梭狀芽孢桿菌相對富集[20]。Wang F 等[26]研究中表明，萬古霉素處理組小鼠體重較對照組小鼠減輕，菌群豐度降低，發(fā)生嚴(yán)重的結(jié)腸炎。Pierrard J 等[27]研究指出，抗生素的使用可對ICIs 抗癌效果和患者預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響，在ICIs 治療前或者期間必須避免使用抗生素。Pinato DJ 等[28]分析了196 例接受ICI 治療的癌癥患者，發(fā)現(xiàn)免疫治療前應(yīng)用抗生素對患者的總生存率無影響。故進(jìn)行免疫治療的患者是否應(yīng)該使用抗生素、何時(shí)使用抗生素及使用何種抗生素仍存在爭議，需要謹(jǐn)慎的綜合評估。

2.2 糞便微生物菌移植（FMT）糞便微生物群移植是指通過上下消化道途徑，將健康供體的腸道微生物群移植到病患體內(nèi)，以恢復(fù)腸道微生物多樣性的方法[29-32]。FMT 于1958 年治療假膜性小腸結(jié)腸炎被首次報(bào)道[33]，近年來因其被成功應(yīng)用于治療難治性或者復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染廣為人知，并逐漸推廣應(yīng)用于腫瘤免疫、炎癥性腸病、代謝系統(tǒng)等疾病[34-37]。研究顯示[20]，接受PD-1 抑制劑治療應(yīng)答患者糞便移植的無菌小鼠與接受無應(yīng)答患者糞便微生物群移植的小鼠相比，PD-1 治療的反應(yīng)有所改善，小鼠體內(nèi)免疫毒性T 細(xì)胞增加。多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)MT 調(diào)節(jié)胃腸道菌群可明顯改善難治性ICI 相關(guān)性結(jié)腸炎。有研究對ICI 性結(jié)腸炎患者行FMT 治療前后的腸道微生物組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)阿克曼菌為有益菌株，缺乏梭狀芽胞桿菌對結(jié)腸炎有保護(hù)作用。當(dāng)供體的移植微生物開始定植后，后期出現(xiàn)雙歧桿菌增殖現(xiàn)象，最近的小鼠模型研究中雙歧桿菌被證明可以減輕腸道炎癥。研究中觀察到受試者的CD8+T 細(xì)胞密度顯著降低，同時(shí)黏膜CD4+Foxp3+增加，這可能是FMT發(fā)揮作用的一種潛在機(jī)制[38,39]。移植應(yīng)答者糞菌至無病原體條件下培養(yǎng)或抗生素處理過的小鼠，小鼠腫瘤體積明顯縮小[16]。除此以外，不同菌株的FMT可能抗腫瘤效果不同，如Vétizou M 等[20]發(fā)現(xiàn)類桿菌FMT 組抗腫瘤效應(yīng)更強(qiáng)。FMT 短期內(nèi)不良反應(yīng)事件較少，癥狀輕微，但是缺乏長期安全數(shù)據(jù)評估FMT 的總體風(fēng)險(xiǎn)。FMT 存在通過糞便從供體傳染給受體的固有風(fēng)險(xiǎn)。最近報(bào)道的含多藥耐藥菌的FMT導(dǎo)致患者死亡，移植后發(fā)生吸入性肺炎、中毒性巨結(jié)腸致死的報(bào)告，說明FMT 雖然發(fā)生致死性事件的風(fēng)險(xiǎn)較低，但在某些人群中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高，如高齡、抗生素治療后等[40,41]。當(dāng)前研究未證實(shí)FMT 對免疫功能低下的患者有額外的風(fēng)險(xiǎn)，故多數(shù)學(xué)者認(rèn)為FMT 安全性尚可，然而對免疫治療后患者行FMT 仍需謹(jǐn)慎。

2.3 益生菌、益生元及合生元 益生菌是給宿主帶來健康益處的活的微生物，包括乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬，乳酸桿菌、雙歧桿菌最為常見。攝入益生菌可有效減少結(jié)直腸癌患者致病菌（梭桿菌、消化鏈球菌）的數(shù)量，其主要通過調(diào)節(jié)微生物組成結(jié)構(gòu)、豐富度和多樣性而不是直接與腸上皮細(xì)胞相互作用發(fā)揮有益的作用[42,43]。補(bǔ)充益生菌鼠李糖酵母菌GG可以減少微生物過度生長，恢復(fù)黏膜完整性，減少微生物移位[44]。研究表明，口服單一菌株的小鼠的抗腫瘤免疫效應(yīng)顯著提高[16,45]，說明益生菌有改善免疫治療效果的作用。Sivan A 等[46]通過16S rRNA 測序技術(shù)從兩種腸道菌群不同的小鼠糞便中篩出雙歧桿菌，通過給TAC 小鼠灌胃短雙歧桿菌或者長雙歧桿菌，發(fā)現(xiàn)小鼠皮下黑色素瘤生長受抑，并且與PD-1抑制劑聯(lián)合幾乎完全抑制了腫瘤生長，發(fā)現(xiàn)這與CD8+T 細(xì)胞激活導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞功能增強(qiáng)相關(guān)。類似的，Vétizou M 等[20]給接受抗生素或者無菌小鼠灌胃脆弱擬桿菌，誘導(dǎo)T 細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的成熟，恢復(fù)了對CTLA-4 的應(yīng)答。Frankel AE 等[47]發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑應(yīng)答者富含的擬桿菌可能通過類似免疫機(jī)制起作用。Wang F 等[26]利用雙歧桿菌改善了檢查點(diǎn)抑制抗體的毒性。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)益生菌可能會阻礙抗生素使用后微生物群的恢復(fù)[48-50]。益生菌制劑易于培養(yǎng)、方便獲得及使用，但是普遍存在標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量控制方向的問題。目前可用的益生菌缺乏多樣性，不同制造商的益生菌配方和劑量差異大，口服的菌株數(shù)量級比本土微生物低3～4 個(gè)數(shù)量級，進(jìn)入腸道后進(jìn)一步減少，無法與本土微生物群競爭，不能達(dá)到預(yù)期的效果。口服益生菌持久性差，一旦停止食用，它們很少持續(xù)超過14 d[51]。學(xué)者們對于益生菌影響免疫治療的機(jī)制尚不清楚，其功效未在臨床實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，故并不推薦免疫治療中應(yīng)用益生菌。

益生元是一種包括菊粉、低聚果糖（FOS）、低聚半乳糖（GOS）及乳果糖等短鏈碳水化合物，在上消化道中消化，可由腸道微生物群發(fā)酵，選擇性地刺激有益細(xì)菌的生長和多樣性，并對宿主健康有積極影響[52-55]。食用菊粉型果聚糖后雙歧桿菌、乳酸桿菌屬相對豐度增加，嗜雙歧桿菌數(shù)量減少（嗜雙歧桿菌是已知致病菌屬）[56-58]。益生元的選擇特異性促進(jìn)了腸道中已經(jīng)存在的有益菌的生長，從而改變了微生物群組成。然而益生元能否影響其他菌群，是否會被所有個(gè)體利用尚不清楚，但它們表現(xiàn)出改變腸道微生物群的潛力。

合生元是益生菌和益生元的混合物，通過益生元刺激腸道中益生菌生長從而提高其效用發(fā)揮作用，目前相關(guān)研究甚少。

2.4 飲食調(diào)節(jié) 人體營養(yǎng)的消化、吸收需要腸道微生物協(xié)助，飲食為調(diào)節(jié)腸道微生物群的重要方式之一。有關(guān)雙胞胎的研究表明[59-61]，遺傳只占觀察到的變異的2%～8%，除了年齡、種群外，不同的微生物群落在很大程度上受環(huán)境因素的影響。微生物組是飲食病理學(xué)的關(guān)鍵機(jī)制，這些認(rèn)知現(xiàn)在已被廣泛接受[62,63]。富含纖維的植物性食物（蔬菜、水果、全谷物），低加工食物（精制谷物、添加糖、反式脂肪），蛋白質(zhì)（魚類和豆類）組成的飲食能降低心血管疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)、降低總死亡率[64,65]。以植物為基礎(chǔ)飲食和以雜食動物為基礎(chǔ)飲食人群間的腸道微生物群落有顯著差異[64-66]。宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，高豐度類桿菌，低豐度普雷沃特菌與飲食中動物蛋白、營養(yǎng)性膽堿和飽和脂肪含量相關(guān)，而富含纖維、單糖和植物源性化合物的植物性飲食與之相反[67,68]?？偺妓衔飻z入量的增加與微生物群落多樣性的降低密切相關(guān)，雙歧桿菌數(shù)量增加，而乳酸桿菌、鏈球菌等減少[69]。干預(yù)特定細(xì)菌類群會影響下游代謝物，如膳食纖維、菊粉、短鏈脂肪酸等[70-72]。從長遠(yuǎn)看，納入上述健康飲食成分有助于減輕全球腫瘤負(fù)擔(dān)。除了以上特定飲食成分，更需要關(guān)注的是飲食模式與微生物相互作用的有害代謝產(chǎn)物才是促進(jìn)炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)而影響免疫治療療效的原因[73]。有益的飲食模式需要長久維持，否則腸道菌群的會被迅速逆轉(zhuǎn)。

3 總結(jié)

免疫檢查點(diǎn)抑制劑在晚期或者轉(zhuǎn)移腫瘤治療上具有重要作用。提高免疫效應(yīng)、減輕免疫不良反應(yīng)、尋找生物標(biāo)志物是目前研究的方向。隨著人們對腸道菌群在免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效、毒性反應(yīng)方面發(fā)揮作用的認(rèn)識不斷加深，通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善免疫治療效果的研究逐漸增多。然而，腸道菌群組成復(fù)雜，目前研究證實(shí)的有利、有害菌株只是其中的小部分，仍有很多未知菌株有待探究。闡明所有菌群組成成分，成分間的相互作用及作用機(jī)制，進(jìn)而篩選、確定、培育出有意義的效應(yīng)菌/微生物群是未來研究的關(guān)鍵。另外，微生物組學(xué)因方法的精度局限、評判標(biāo)準(zhǔn)不一導(dǎo)致各個(gè)研究結(jié)果產(chǎn)生差異性的問題也亟需解決。隨著未來生物技術(shù)的發(fā)展，收集、測序和分析的標(biāo)準(zhǔn)化流程至關(guān)重要。當(dāng)前眾多研究以動物模型居多，未來需要更多臨床前模型及人類隊(duì)列研究證據(jù)的支持，將其與已知的、新的生物標(biāo)志物結(jié)合起來的探究更是日后研究的熱點(diǎn)。

值得注意的是，當(dāng)前僅有抗生素干預(yù)及糞便微生物抑制經(jīng)FDA 批準(zhǔn)用于腸道微生物調(diào)節(jié)，F(xiàn)MT 的應(yīng)用效果較抗生素更受到肯定及關(guān)注。但是目前國內(nèi)外對FMT 的實(shí)施尚未建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，導(dǎo)致各類研究中FMT 療效結(jié)果差異性大。未來FMT 標(biāo)準(zhǔn)化亟待解決，包括供體的篩選與管理流程，菌液制備標(biāo)準(zhǔn)化流程，腸道準(zhǔn)備與FMT 方式，移植劑量、時(shí)機(jī)以及腫瘤患者的FMT-MDT 管理。另外自體FMT理論上安全性更高，不存在移植排斥問題，但也可能存在促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生或微生物群傳播相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，其可行性需慎重評估。

上述幾種菌群干預(yù)方式均處于探索階段，但都表現(xiàn)出通過調(diào)節(jié)胃腸道菌群影響免疫治療的巨大潛力，國內(nèi)外學(xué)者對此持積極且謹(jǐn)慎的態(tài)度。相信未來更多的研究及醫(yī)療機(jī)構(gòu)會加快、加深對腸道菌群的研究，進(jìn)而推進(jìn)精準(zhǔn)腫瘤免疫治療，為惡性腫瘤的治療提供新的思路。