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    地中海貧血的診療現(xiàn)狀及分子生物學研究

    2022-11-23 17:57:57呂麗娜楊燦華
    醫(yī)學信息 2022年11期
    關(guān)鍵詞:珠蛋白探針貧血

    呂麗娜,楊燦華

    (廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院血液內(nèi)科,廣西 南寧 530199)

    地中海貧血(thalassemia)又稱珠蛋白生成障礙性貧血,是臨床常見的遺傳性血紅蛋白病,其發(fā)病機制與調(diào)控珠蛋白合成的基因缺失或突變有關(guān),可引起血紅蛋白α 鏈及β 鏈珠蛋白合成比例的失衡,導致紅細胞壽命縮短,促使溶血性貧血的形成[1]。近年來,該疾病的診斷及臨床治療方面取得了不小進展,但仍是全球分布最為廣泛的遺傳學疾病之一,多伴有脾臟腫大、骨骼畸形、生長發(fā)育遲緩、鐵過載以及心臟疾病等問題,對其身體健康造成了嚴重影響[2]?;诖耍摬〉脑\治方案及研究進展獲得了臨床的廣泛關(guān)注,現(xiàn)本文對地中海貧血診療現(xiàn)狀及分子生物學研究綜述如下,以期為該病的臨床研究提供相應(yīng)的參考信息。

    1 地中海貧血的診療現(xiàn)狀

    1.1 診斷 現(xiàn)階段,基因診斷是地中海貧血最為準確的診斷方式,對于該病的早期檢查具有較高的可靠性,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于孕婦產(chǎn)前檢查中[3]。目前,國內(nèi)醫(yī)院多以實驗室血細胞檢查作為地中海貧血的首選篩查方式,首先對小細胞低色素性貧血進行初步診斷。診斷標準:血紅蛋白、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)以及平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)降低;隨后進行血紅蛋白分析,HbF、HbA2 增多,或血紅蛋白電泳出現(xiàn)其他異常血紅蛋白;最后,在發(fā)現(xiàn)明確珠蛋白變異情況下再行基因診斷[4]。

    1.2 治療 目前,地中海貧血的常用治療方式包括輸血治療、去鐵治療、造血干細胞移植、脾切除術(shù)、基因治療等。國際地中海貧血聯(lián)盟(TIF)指南指出,適當?shù)囊?guī)范性輸血計劃是治療地中海貧血的常規(guī)方式,但需明確其輸血時間、血紅蛋白最佳標準、對去鐵治療的影響,以及輸血反應(yīng)等問題[5]。我國則主要參考中華醫(yī)學會兒科學分會血液學組的地中海貧血診斷與治療指南,以長期規(guī)范性輸血治療為主,在人類白細胞抗原(HLA)相合的情況下,首選造血干細胞移植治療;當輸血次數(shù)超過10~20 次、血清鐵蛋白>1000 μg/L 時考慮開展去鐵治療;對于12 歲以下患兒盡量不采用脾切除術(shù)治療[6]。此外,基因活化治療是當前的重要研究方向,應(yīng)用化學藥物可改善β 地中海貧血的臨床癥狀,但目前仍然在研究中。總之,輸血聯(lián)合鐵螯合劑去鐵仍是地貧患者最主要的治療方法。

    2 地中海貧血的分子生物學研究

    2.1 疾病分子生物學研究 地中海貧血是由于調(diào)控珠蛋白合成的基因缺失或突變引起的溶血性貧血,根據(jù)基因分型,可分為α、β、δβ、δ 地中海貧血等,以前兩者最為高發(fā)。α-地中海貧血主要是由于α-珠蛋白基因的大片段缺失所導致,其缺失型包括--SEA、-α3.7、-α4.2,少數(shù)是由小片段堿基插入、缺失或點突變所致,屬于包括非缺失型,包括αWS、αCS、αQS[7]。β-地中海貧血則主要是由于11(p15.5)染色體上β 珠蛋白基因點突變所致,少數(shù)是由β-珠蛋白基因缺失引起,按照珠蛋白鏈的缺失程度可分為β+(輕型突變)與β0(重型突變),其癥狀表現(xiàn)也有所差異[8]。

    2.2 分子生物學診斷及應(yīng)用

    2.2.1 Southern 印記雜交 Southern 印記雜交是DNA圖譜的重要分析方式,該技術(shù)可通過瓊脂糖凝膠電泳法分離限制性內(nèi)切酶,隨后完整轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜或尼龍膜上相應(yīng)位置,與放射性同位素標記的DNA 進行探針雜交,隨后通過放射性自顯影確定雜交片斷的大小與位置,是當前檢測α-珠蛋白基因缺陷的金標準[9]。但Southern 印記雜交操作繁瑣,費時費力,對所用基因組DNA 質(zhì)量具有較大依賴性,且需用到放射性同位素,不適用于臨床的常規(guī)診斷。

    2.2.2 缺口聚合酶鏈式反應(yīng)(gap-PCR)缺口PCR 常用于缺失型突變的檢測,該技術(shù)可針對缺失區(qū)域上下游序列設(shè)計互補引物,正常情況下,引物距離較遠無法擴增出特異片段,當上下游序列發(fā)生缺失突變時,引物之間的距離因斷端連接而靠近,由此可擴增出特定長度的片段,后續(xù)可通過瓊脂糖凝膠電泳所得片段,檢測其樣品的基因型?;诖?,運用單管多重PCR 技術(shù)在同一體系中加入多對互補引物,可檢測出多種序列缺失型突變,包括-SEA、-THAI、-α4.2等。鄧宇運等[10]對缺口PCR 在地中海貧血中的診斷價值進行了探究,其結(jié)果顯示,缺口PCR 對α-地中海貧血具有較高的診斷準確率、靈敏度及特異度,且操作簡單、快速,適用于缺失型α-地中海貧血的分子篩查及基因診斷中。

    2.2.3 等位基因特異性寡核苷酸探針點雜交(ASO)ASO 僅適用于已知基因突變的檢測,其探針為20 bp左右長度的核苷酸,共包括2 種,一種與正?;蛐蛄幸恢?,僅可與正常基因序列雜交;另一種則與突變基因序列一致,僅可與突變基因序列雜交,由此區(qū)分堿基突變的基因。該技術(shù)可與PCR 結(jié)合,在突變點基因片段的體外擴增基礎(chǔ)上,應(yīng)用ASO 探針作點雜交,具有較高的靈敏度與精確度,但單次雜交僅可檢測一種突變,且對DNA 數(shù)量及純度具有較高要求[11]。

    2.2.4 反向點雜交(RDB)RDB 的檢測機制與ASO的原理基本相同,不同之處在于固定靶DNA 被膜上固定探針所替代,利用多種特異性探針中膜條與擴增靶序列的雜交,增加單次雜交可檢測的突變類型,改變了傳統(tǒng)雜交法僅可檢測一種突變的操作模式。該技術(shù)檢測時間短、檢測成本低,在基層實驗室的基因篩查及診斷中也具有較高的適用性。肖奇志等[12]對不同原理PCR 法在地中海貧血產(chǎn)前診斷中的可行性進行了驗證,其結(jié)果顯示,單管多重PCR 法聯(lián)合RDB 的檢測靈敏度較高,可準確檢出常見非缺失α-地中海貧血突變類型;同時還可對單管多重PCR法的檢測結(jié)果進行驗證,在地貧產(chǎn)前診斷中具有較高的可行性,且可作為質(zhì)量控制的替代方式,用以保證產(chǎn)前診斷的準確性,值得臨床遺傳診斷實驗室的應(yīng)用。

    2.2.5 多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)MLPA 技術(shù)是在多重擴增探針雜交(MAPH)基礎(chǔ)上改進而來,該方式可通過與樣本DNA 雜交,被連接酶連接的探針進行擴增,隨后依據(jù)其靶序列擴增產(chǎn)物量進行定量分析,是針對待測核酸中靶序列進行定性、定量檢測的新技術(shù),可檢出目的序列內(nèi)的全部基因缺陷[13]。但MLPA 操作相對繁瑣,且檢驗條件要求高,不適用于大規(guī)模檢測,可作為當前地貧基因缺失檢測的補充方式。

    2.2.6 基因芯片法 基因芯片法是20 世紀90 年代中期以來影響最為深遠的科研進展之一,該技術(shù)是利用2 種不同熒光染料標記的靶序列與同一基因芯片進行雜交,通過不同顏色的熒光信號強度反映出基因表達的變化[14]。此外,基因芯片法可將大量探針同時固定于支持物上,因此可一次性檢測大量生物分子,有效彌補了傳統(tǒng)檢測方式檢測項目單一、低通量、費用昂貴等弊端,具有敏感、高效、平行化及自動化等應(yīng)用優(yōu)勢。

    2.2.7 DNA 測序技術(shù) DNA 測序是基因分析的最精確方式,現(xiàn)已成為分析點突變的金標準。第一代DNA 測序技術(shù)由最初的化學降解法發(fā)展至熒光自動測序,開啟了DNA 測序的自動化時代。而第二代測序技術(shù)在以上基礎(chǔ)上實現(xiàn)了高通量測序,可一次性對幾十萬甚至幾百萬條DNA 進行序列測序,不僅高效、精確,還可檢測出新型突變類型[15]。目前,第三代測序技術(shù)也應(yīng)運而生,其測序平臺主要包括Helicos Biosciences 公司的tSMSTM(truesinglemolecular sequencing)平臺及美國Pacific Bioscies 公司的SMRT(single molecule real time)平臺等?,F(xiàn)隨著國內(nèi)科研實力及經(jīng)濟實力的快速提升,DNA 測序也由科研向醫(yī)療檢測應(yīng)用進行轉(zhuǎn)變,對α 及β 地中海貧血基因突變的診斷具有重要意義。

    2.2.8 其他 熒光實時定量PCR(RQ-PCR)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析(PCR-RFLP)、擴增不應(yīng)突變系統(tǒng)(ARMS)、單鏈構(gòu)向多態(tài)性PCR(PCR-SSCP)以及變性梯度凝膠電泳(DGGE)等均是地中海貧血突變基因的常用檢測方式,其應(yīng)用價值各異,臨床需基于其可行性選擇應(yīng)用。

    2.3 分子生物學治療及應(yīng)用

    2.3.1 減少無效紅細胞生成 無效紅細胞生成是地中海貧血的重要病理生理機制,多與珠蛋白基因片段缺失或珠蛋白合成肽鏈失衡等原因有關(guān)。珠蛋白基因表達受限可引起珠蛋白肽鏈過剩,進而無法形成穩(wěn)定的血紅蛋白四聚體,易導致氧化沉淀形成的包涵體沉積于紅細胞膜上,致使紅細胞變形能力下降,紅細胞壽命縮短,引起大量無效紅細胞生成,最終導致溶血性貧血的發(fā)生。因此,減少無效紅細胞生成是地中海貧血的重要治療方式。①重組人促紅細胞生成素(rHuEPO):促紅細胞生成素(EPO)是腎臟缺氧時釋放的糖蛋白激素,可刺激骨髓中紅系祖細胞的生長與分化,同時防止其凋亡。研究證實[16,17],rHuEPO 可刺激血紅蛋白F(HbF)的合成,以此增強紅細胞生成,現(xiàn)已被視為地中海貧血病例輸血治療的安全替代方式,在脾切除以及初始HbF>40%或低EPO 患者中可發(fā)揮重要作用,但對于嚴重的地中海貧血患者,尚需大規(guī)模的臨床試驗進行評估與驗證;②JAK2 抑制劑:抑制JAK2/STAT5 途徑對EPO 過度刺激的負面影響一直是治療地中海貧血的重要研究方向,其中JAK2 是EPO 的唯一信號轉(zhuǎn)導物,可引起信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄激活因子以及平行信號通路的激活,促使紅系祖細胞的增殖與分化?;诖?,JAK2抑制藥物的應(yīng)用將有利于地中海貧血患者的治療。據(jù)相關(guān)研究顯示[18],JAK2 抑制劑可有效改善無效紅細胞的生成,同時逆轉(zhuǎn)脾腫大。目前,魯索利替尼是美國FDA 批準的首批JAK2 抑制劑藥之一,該藥物的應(yīng)用有助于減輕重型地中海貧血患者的輸血負擔,緩解其脾腫大及無效紅細胞生成等狀況,但其安全性及耐受性尚在研究中[19];③激活素抑制劑:激活素抑制劑可影響紅細胞生成晚期,對于無效紅細胞生成引起的貧血疾病中具有一定治療作用。目前,臨床針對激活素受體-Ⅱ(ActRIIB 或ActRIIA)開發(fā)了2 種藥物,即Luspatercept(羅特西普)與Sotatercept(索特西普),此2 種藥物均是結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族配體的重組化合物,可作為激活素ⅡA型與ⅡB型的修飾受體,與人免疫球蛋白IgG1-Fc 片段融合,進而減輕下游信號傳導的抑制作用,用于無效紅細胞相關(guān)病癥的治療。相關(guān)研究指出[20],該藥對貧血的改善效果好,且耐受性良好,可減少患者的輸血負荷,但針對患者可接受的活性劑量還需在后續(xù)研究的進一步觀察;④Foxo3 誘導劑:Foxo3 可于紅細胞生成的早期階段上調(diào)抗氧化酶,以此保護細胞免受氧化應(yīng)激損害,在減少無效紅細胞生成的過程中具有重要作用。同時,F(xiàn)oxo3 的激活可促進紅細胞成熟,誘導HbF 的紅細胞表達,進而緩解貧血狀況,因此,F(xiàn)oxo3 誘導劑的應(yīng)用可有效改善地中海貧血的病情進展。二甲雙胍作為二型糖尿病的常用治療藥物,同時可作為Foxo3 誘導劑,激活Foxo3 促進HbF 的紅細胞表達,有利于貧血癥狀的減輕[21]。Camaschella C 等[22]對二甲雙胍在鐮狀細胞性貧血及非依賴性輸血地中海貧血中的治療作用進行了研究試驗,結(jié)果證實,二甲雙胍可增加紅細胞祖細胞中Foxo3 的活性,對HbF 的紅細胞表達具有積極的改善作用。但以上試驗尚處于臨床前研究階段,其應(yīng)用有效性及安全性待進一步評估觀察。

    2.3.2 鐵螯合劑 自發(fā)性溶血及頻繁的輸血均可導致鐵元素在體內(nèi)的過量沉積,進而引起心臟、肝臟以及內(nèi)分泌系統(tǒng)的損害。因此,針對鐵過載進行適當?shù)恼{(diào)節(jié)治療,是減輕其疾病損害的重要方式[23,24],現(xiàn)多以鐵轉(zhuǎn)運蛋白及相關(guān)分子的調(diào)控為主要研究方向。①鐵調(diào)素:鐵調(diào)素是體內(nèi)鐵代謝調(diào)節(jié)的重要激素,其生物活性形式是由25 個小分子氨基酸多肽組成,可通過血液循環(huán)發(fā)揮作用,但無效紅細胞生成及組織缺氧可抑制鐵調(diào)素的合成與分泌,導致其體內(nèi)循環(huán)降低,引起鐵儲存過多造成鐵過載。因此,調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵調(diào)素水平是減少地中海貧血鐵超負荷的重要方向[25]。Casu C 等[26]研究指出,Mini-hepcidins等微量鐵調(diào)素的使用可顯著改善小鼠無效紅細胞生成、鐵超負荷及貧血狀態(tài),具有確切的治療效果。Aghajan M 等[27]的研究顯示,抑制TMPRSS6 基因可減輕其對內(nèi)源性鐵調(diào)素合成的干擾,改善貧血并減少鐵負荷,逆轉(zhuǎn)脾腫大,對非輸血依賴性地中海貧血具有積極的治療作用;②腸道缺氧誘導因子-2α(HIF2alpha):鐵轉(zhuǎn)運蛋白可將鐵從腸細胞轉(zhuǎn)入血液循環(huán),而HIF2alpha 則是調(diào)節(jié)該過程的關(guān)鍵因子,對血液中鐵含量的調(diào)節(jié)具有重要作用。Anderson ER等[28]研究指出,在地中海貧血小鼠模型中,HIF2alpha 可于發(fā)病早期被激活,由此可引起鐵積累,因此,破壞HIF2alpha 信號是糾正地中海貧血鐵超負荷的重要研究方向,現(xiàn)已成為該病治療的研究熱點之一。

    2.3.3 基因治療 依據(jù)其分子機制,地中海貧血的基因治療可通過珠蛋白基因的修復或重新激活,誘導HbF 增加,以此促進珠蛋白肽鏈比例的平衡,改善紅細胞生成,達到治療目的[29]。其中應(yīng)用自體干細胞的基因治療可作為造血干細胞移植的改良形式,將造血干細胞與祖細胞分離后,利用慢病毒載體將外源性珠蛋白基因整合至宿主細胞基因組中,隨后將修飾細胞重新填充造血,以此糾正蛋白肽鏈比例,調(diào)節(jié)紅細胞生成。此外,還有依賴于靶向基因編輯的替代方式,通過人造血干細胞相關(guān)珠蛋白基因的編輯,促使其分化為成熟紅細胞,以此調(diào)節(jié)肽鏈中的珠蛋白平衡,改善病理狀況[30]。但造血干細胞存在核酸酶,其靶向基因傳遞方式在臨床的適用性較為有限,同時,在應(yīng)用基因編輯治療時,需充分明確靶核酸酶的遺傳毒性,以此不斷改進并完善,用于地中海貧血的治療[31]。

    3 總結(jié)

    近年來,地中海貧血的診治研究取得了巨大進步,其疾病診斷多以實驗室血細胞檢查及基因診斷為主,而治療方案則主要為輸血治療、去鐵治療、造血干細胞移植以及脾切除等方式。在此基礎(chǔ)上,分子生物學技術(shù)的發(fā)展為該病的診斷與治療帶來了新的研究方向,隨著多種分子生物學診治方式的相繼出現(xiàn),部分藥理學或遺傳學的新治療靶點也逐漸被證實,但其應(yīng)用大多處于研究狀態(tài),發(fā)展?jié)摿ι杏写鞔_,臨床需在此基礎(chǔ)上不斷完善,以促進該病診療技術(shù)的不斷提升。

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