大皰性表皮松解癥及其分子治療研究進展

李杏杏，孔姝敏，曹育春，孫小燕

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院皮膚科，湖北 武漢 430030）

大皰性表皮松解癥（Epidermolysis bullosa，EB）一般指遺傳性大皰性表皮松解癥，是一種以常染色體顯性或隱性方式遺傳的皮膚病。EB的臨床特點是輕微創(chuàng)傷或摩擦后皮膚黏膜即可出現(xiàn)水皰、糜爛或潰瘍［1，2］。大多數(shù)EB患者可伴發(fā)瘙癢，不同亞型之間瘙癢發(fā)生率存在顯著差異［3］。EB的臨床表現(xiàn)并不局限于皮膚和黏膜，常伴有全身并發(fā)癥，包括營養(yǎng)不良、微量元素缺乏、貧血、慢性炎癥、感染、繼發(fā)皮膚鱗癌等［4］。本文大致概述了EB的分子病理學(xué)機制、臨床分型和基因突變特點，主要闡述了基因治療、細胞療法、蛋白質(zhì)療法和小分子藥物治療等EB最新的分子治療進展。

1 EB的分子病理學(xué)機制

皮膚是人體最大的器官，由皮下組織、真皮及覆蓋在上的表皮層組成。表皮基底層和真皮乳頭層之間由細胞外基質(zhì)大分子物質(zhì)將表皮與真皮緊密連接，稱基底膜帶（basement membrane zone，BMZ）。BMZ不僅提供了細胞黏附的支架，還為細胞遷移提供了條件，為細胞和分子提供了選擇性通透屏障，可調(diào)節(jié)被覆上皮細胞的分化、發(fā)育和死亡。電鏡下BMZ由淺至深為胞膜層、透明層、致密層及致密下層，這個區(qū)域是EB病理生理中心位置。在胞膜層，半橋粒借助附著斑與胞質(zhì)內(nèi)張力細絲相連，同時通過多種跨膜蛋白如BPAG2、整合素α6β4等與下方透明層黏附，起“鉚釘”樣作用。在下方，錨絲、Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原即錨原纖維相互交聯(lián)，具有連接和固定作用，是BMZ重要支撐結(jié)構(gòu)［5］。EB的臨床表現(xiàn)取決于特定基因的分子畸變及影響皮膚黏膜脆性超微結(jié)構(gòu)的異常平面位置。目前已發(fā)現(xiàn)19個基因的致病變異與EB相關(guān)，包 括COL17A、KRT5、KRT14、LAMA3、LAMB3、LAMC2、ITGB4、ITGA3等［6，7］。這些基因編碼突變影響上述結(jié)構(gòu)的相應(yīng)功能及穩(wěn)定表達，導(dǎo)致皮膚脆性增加，引起EB的典型臨床表現(xiàn)。上述受影響基因和蛋白種類及其致病遺傳變異的具體性質(zhì)一定程度上決定了EB的表型。具體來說，受影響蛋白殘余量或殘余功能多少，決定了疾病嚴重程度是輕度、中度還是重度［8，9］。

2 EB的主要臨床亞型

根據(jù)超微結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)脆性和水皰形成的平面位置不同，EB可分為如下四種類型，而各類型又可分為不同的亞型，有不同的遺傳方式和致病分子。

2.1 單純型大皰性表皮松解癥（Epidermolysis Bullosa simplex，EBS） EBS是EB中最常見的類型，多為常染色體顯性遺傳，也有一些罕見的常染色體隱性遺傳。該型臨床表現(xiàn)較輕，偶有重度泛發(fā)性EBS的病例報道［10］。大多數(shù)EBS是由編碼角蛋白5和角蛋白14的KRT5或KRT14基因顯性突變引起的。該突變導(dǎo)致基底層角質(zhì)形成細胞的中間角蛋白絲網(wǎng)絡(luò)缺陷，引起表皮內(nèi)的分裂［11，12］。EBS患者的發(fā)病年齡不定，其皮損如糜爛和水皰等愈合后基本不遺留疤痕，皮膚癥狀大多隨著年齡的增長而改善。而重度泛發(fā)性EBS經(jīng)常伴隨出現(xiàn)疼痛性掌跖角化病和甲營養(yǎng)不良［4］。

2.2 營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥（Dystrophic Epidermolysis Bullosa，DEB） DEB是EB中第二常見的類型，為常染色體顯性或隱性遺傳。DEB是由于COL7A1基因突變，無法正常編碼VII型膠原（C7），在基底膜致密下層發(fā)生相應(yīng)病變［15］。DEB臨床表現(xiàn)具有廣泛變異性，無論是自發(fā)或輕微創(chuàng)傷均可引起表皮脫落、水皰和粟丘疹形成。所有粘膜包括口腔，食管，眼部，生殖器，肛門等，均可受到影響，并伴有全身并發(fā)癥。瘙癢是DEB的一個主要并發(fā)癥，在即將愈合的皮損處尤甚，由此引起的搔抓是一個重要的加重病情的行為因素。其中，隱性遺傳型DEB（RDEB）能夠?qū)е聡乐氐木植炕蛉聿l(fā)癥。局部并發(fā)癥包括慢性復(fù)發(fā)性皮損處傷口、假性并指、食管狹窄、結(jié)膜潰瘍、疼痛性角膜糜爛和瞼球粘連等。全身性并發(fā)癥包括營養(yǎng)不良、貧血、全身性感染、腎淀粉樣變性和骨質(zhì)疏松等。其他DEB亞型包括中間型、反相型、局限性、癢疹型等，癥狀相比而言較輕［1］。慢性創(chuàng)面進展為侵襲性皮膚癌如皮膚鱗狀細胞癌是DEB患者死亡的主要原因，有數(shù)據(jù)認為超過50%的DEB患者在40歲之前死于轉(zhuǎn)移性鱗狀細胞癌［16］。

2.3 交界型大皰性表皮松解癥（Junctional Epidermolysis Bullosa，JEB） JEB據(jù)報道是EB中最少見的類型［10］，主要為常染色體隱性遺傳，顯性遺傳較為罕見。突變涉及半橋粒組成成分的編碼基因，如層粘連蛋白332、XVII型膠原、整合素α6β4和整合素α3β1［13］。JEB包含兩個主要亞型，即重度型和中度型，兩者的疾病嚴重程度有相當(dāng)大的差異。重度型JEB臨床特征表現(xiàn)為皮膚和粘膜多發(fā)廣泛性大皰性脫落，常累及呼吸道，嬰幼兒患者早期死亡率較高。中度JEB皮膚黏膜受累程度較輕，對預(yù)期壽命影響不大，常伴隨甲營養(yǎng)不良或甲缺失伴甲周水皰［4，14］。

2.4 Kindler大皰性表皮松解癥（Kindler Epidermolysis Bullosa，KEB） KEB以前被稱為Kindler綜合征，最近被歸類為EB的新亞型。kindlin是一類參與構(gòu)成基底層角質(zhì)形成細胞接觸中心的蛋白，KEB與編碼該蛋白的FERMT1基因隱性突變有關(guān)。該型分裂水平多重，可以發(fā)生在角質(zhì)形成細胞內(nèi)，也可以在致密層或致密層以下，且與基底層角質(zhì)形成細胞的復(fù)制異常有關(guān)。患者臨床表現(xiàn)包括皮膚脆性增加、大皰、光敏、進行性皮膚異色癥、明顯皮膚萎縮和牙周病等［17］。

3 EB的分子治療

EB分子治療在過去幾十年里不斷發(fā)展，已經(jīng)開展了大量的臨床前研究［18，19］。目前大多數(shù)治療方法都旨在通過基因、細胞治療或蛋白質(zhì)替代療法來恢復(fù)缺陷結(jié)構(gòu)蛋白的功能。但EB并不局限于皮膚損害，恢復(fù)皮膚蛋白功能的治療可能無法解決EB相關(guān)的所有局部和全身并發(fā)癥。因此，如皮膚炎癥、纖維化、瘙癢、疼痛或癌癥的治療方法也正在研究當(dāng)中。

3.1 細胞療法 間充質(zhì)干細胞是一種多能性間充質(zhì)細胞，可分化為多種細胞類型，包括成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞。其具有抗炎、血管生成、抗纖維化和組織修復(fù)等特性，有助于改善EB的傷口愈合。Palison［20］團隊在智利開展了一項臨床研究，即對兩名重型泛發(fā)性RDEB成年患者皮損內(nèi)注射健康同種異體骨髓基質(zhì)干細胞，治療慢性皮膚潰瘍。與一般藥物相比，實驗組皮損的臨床改善持續(xù)時間長達4個月，局部炎癥減少，傷口愈合更快。

成纖維細胞由于能夠產(chǎn)生C7并具有免疫調(diào)節(jié)特性，易于培養(yǎng)，已成為RDEB細胞治療研究新方向［21，22］。早期臨床前研究表明，皮內(nèi)注射正常的人類成纖維細胞或基因修正后的RDEB成纖維細胞到免疫缺陷小鼠皮膚，有助于C7的重新表達及錨原纖維的再形成，并促進注射部位的傷口愈合［23-25］。McGrath及其同事［26］在5例RDEB患者皮膚內(nèi)注射同種異體健康人成纖維細胞，其臨床試驗結(jié)果顯示，注射后2周和3個月時測得真皮表皮連接處C7表達增加，傷口愈合改善。

3.2 基因替代療法 1998年，Dellambra等［27］人證明了可以使用攜帶LAMB3 cDNA的經(jīng)典逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對JEB角質(zhì)形成細胞進行體內(nèi)校正。同樣，Goto［22］和Siprashvili［28］等人使用經(jīng)典逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將轉(zhuǎn)基因?qū)塍w外培養(yǎng)的JEB角質(zhì)形成細胞，隨后將矯正后的細胞移植到免疫缺陷小鼠上，結(jié)果顯示有錨原纖維形成。之后，不少研究證明將基因矯正后的患者上皮移植回缺陷皮膚后，其皮損處有錨原纖維的重新形成，實現(xiàn)了一定程度的功能矯正［29，30］。這些臨床前研究已初步證明了體外基因治療的潛力。在這些試點研究之后，Holostem發(fā)起了兩項I/II期臨床試驗，即對12名攜帶COL17A1突變的JEB患者（NCT03490331）和12名RDEB患者（NCT02984085）移植基因矯正上皮，評估療效。

另一種方式是將cDNA通過嗜表皮性HSV或非病毒載體直接傳遞到皮膚中。例如，Krystal在4例RDEB患者中進行了一項II期試驗（NCT03536143），將含有HSV-1載體和強CMV啟動子表達的COL7A1 cDNA直接轉(zhuǎn)染到皮膚細胞。這種體內(nèi)基因治療耐受良好，重復(fù)給藥不會引起局部炎癥，且最終數(shù)據(jù)顯示，在第8至12周期間，患者傷口面積顯著減少，愈合能力增強。

3.3 基因編輯療法 除了基因替代療法，一些研究還試圖進行基因修復(fù)，如通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)校正突變［31-35］。CRISPR/Cas9以特定的方式誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，通過同源定向修復(fù)、非同源末端連接或DNA修復(fù)，糾正疾病相關(guān)基因突變［36］。既往研究中，來自RDEB患者的角質(zhì)形成細胞或成纖維細胞通過該技術(shù)獲得了高產(chǎn)量的基因修正，隨后對免疫缺陷小鼠進行皮膚移植，證明了其具有合成功能性C7的能力。CRISPR/ Cas9基因編輯可以精準、永久性地糾正致病突變，恢復(fù)基因的生理表達和功能。但它的潛在限制是需要大量培養(yǎng)細胞來生產(chǎn)移植物，效率較為低下，需要更深入、更成熟的技術(shù)研究進行完善和改進［37，38］。

3.4 逆轉(zhuǎn)突變細胞療法 回復(fù)鑲嵌現(xiàn)象（Revertant mosaicism，RM）是由于自發(fā)性或繼發(fā)性體細胞突變，通過恢復(fù)缺陷蛋白的表達來補償遺傳突變和恢復(fù)表型的現(xiàn)象，十分罕見。RM為EB細胞基礎(chǔ)治療提供了一種“自然基因治療”的可能性。在這種情況下，一些皮膚細胞會自發(fā)地將突變逆轉(zhuǎn)為野生基因型，從而形成正常皮膚區(qū)域［39，40］。EB中首次發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象是在JEB患者中，其角質(zhì)形成細胞干細胞發(fā)生體細胞逆轉(zhuǎn)突變后出現(xiàn)健康皮膚補丁［39］。后來在EBS、RDEB和KEB患者的角質(zhì)形成細胞中進一步證實了RM的存在［40，41］。Matsumura等［42］人進行了一項臨床試驗，使用從完整皮膚補丁中提取的退化角質(zhì)形成細胞自體移植治療3例嚴重DEB和不愈合潰瘍患者（UMIN：000020734），從非病變皮膚中分離并在體外擴增逆轉(zhuǎn)角質(zhì)形成細胞，培養(yǎng)自體上皮，然后移植到慢性潰瘍上。盡管該現(xiàn)象較為罕見，但該治療方法能夠長期糾正基因缺陷，可能是一種更安全的基因治療。

3.5 外顯子跳躍療法 外顯子跳躍是利用反義寡核苷酸（ASOs）來修飾前信使RNA的剪接，使其不能被正常識別，導(dǎo)致目標突變外顯子的切除，從而消除導(dǎo)致疾病的突變。一些臨床前研究表明，COL7A1中外顯子13、70、73、80或105的跳躍剪接能夠?qū)е虏糠止δ艿鞍自谡嫫?表皮連接區(qū)重新沉積［43-46］。ASO介導(dǎo)的外顯子跳躍療法可以恢復(fù)RDEB皮膚異種移植中C7表達和錨原纖維的形成，其密度與正常皮膚相似［43］。目前，一項將一種包含ASO靶向外顯子73的水凝膠QR-313，直接局部應(yīng)用于DEB創(chuàng)面，用于COL7A1矯正的臨床試驗（NCT03605069）正在進行中。體內(nèi)ASO介導(dǎo)外顯子跳躍治療的優(yōu)點在于它們是非免疫原性的，可以局部或系統(tǒng)給藥，并保留基因的生理調(diào)節(jié)。但其治療需持續(xù)終身，只適用于一部分患者。

3.6 蛋白質(zhì)療法 臨床前研究表明，局部或靜脈注射的重組C7可以沉積在真皮-表皮連接區(qū)，并促進傷口愈合［47，48］。系統(tǒng)給藥重組C7蛋白除了可以靶向到皮膚中，還可以到達受RDEB影響的皮膚外組織，如胃腸道黏膜和眼角膜并進行修復(fù)。重組C7已獲得美國FDA的快速藥物認證，且正在進行一項I/II期臨床試驗，評估其安全性和耐受性以及在成人RDEB患者中的臨床應(yīng)用（NCT03752905）。中期數(shù)據(jù)表明，重組C7在所有患者中均有良好的耐受性，未出現(xiàn)任何嚴重不良反應(yīng)，且在28天時三次輸注后C7的皮膚沉積呈劑量依賴性增加。

3.7 通讀療法 通讀療法是指使用小分子化合物將其氨基酸取代終止密碼子，抑制無義突變，使蛋白質(zhì)正常合成。慶大霉素等氨基糖苷類藥物具有抑制無義突變導(dǎo)致的基因翻譯終止的能力，能夠恢復(fù)全長蛋白質(zhì)的合成，已成為能夠治療人類遺傳疾病的藥物制劑。Woodley［49］和Chen［50］的實驗使用了來自數(shù)個出現(xiàn)無義突變的RDEB患者角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞培養(yǎng)物，實驗結(jié)果顯示氨基糖苷類藥物可抑制提前終止密碼子，恢復(fù)具有功能的全長C7的表達。用慶大霉素治療3例攜帶無義突變的JEB患者角質(zhì)形成細胞后，層粘連蛋白332全鏈恢復(fù)，并在真皮-表皮交界區(qū)沉積。目前正在對RDEB（NCT03392909）和JEB（NCT03526159）進行臨床研究，測試靜脈注射慶大霉素的效果。

3.8 用于緩解癥狀的小分子療法 纖維化是RDEB的主要病理表現(xiàn)，其中TGF-β信號是纖維化和疾病嚴重程度的主要驅(qū)動因素［51，52］。氯沙坦是一種血管緊張素II型受體拮抗劑，用于治療高血壓，已被證明可以減少TGF-β的產(chǎn)生。在動物模型中，氯沙坦治療可顯著減少畸形RDEB小鼠爪子的纖維化［53］。此外，Wally等［54，55］及臨床試驗，表明了對重癥EBS患者局部注射白介素-1抑制劑雙醋瑞因［56］能促進其傷口愈合，減少水皰形成。一項研究表明3例嚴重EBS患者接受了磷酸二酯酶-4抑制劑阿普斯特的治療后，皮損較前明顯好轉(zhuǎn)，該抑制劑能夠調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)（TNF-α、IL-23、IL-17、IL-10等）。雖然上述治療并不能糾正EB的遺傳缺陷，但它能針對治療該疾病的臨床癥狀，改善患者的生活質(zhì)量。

4 結(jié)語

總的來說，EB中基因突變引起了相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白的破壞，影響組織的完整性和黏附性，產(chǎn)生相應(yīng)臨床癥狀?，F(xiàn)階段對EB分子病理學(xué)和潛在機制更深入的了解及研究為其分子治療的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。目前有關(guān)EB的體內(nèi)外基因治療、蛋白質(zhì)替換和細胞治療等正進行各個階段的臨床試驗，相信隨著這些研究的進一步深入，能為未來EB患者的治療提供更多更有效、更安全的選擇。