解痙多肽表達化生動物模型的研究進展*

陳萬群，張金衛(wèi)，羅 楊 綜述，楊小軍△ 審校

(重慶市中醫(yī)院：1.消化科；2.皮膚美容科 400021)

胃腺癌作為世界范圍內(nèi)高致死率的腫瘤之一，其中幽門螺桿菌(helicobacter pylori,Hp)感染被認為是其發(fā)生、發(fā)展最重要的危險因素[1]。持續(xù)的感染及慢性炎癥導致胃癌前病變患者出現(xiàn)泌酸腺體缺失，即形成慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)[2]。CAG表現(xiàn)為胃單位的重組，即以峽部胃單位(胃小凹和深部胃竇細胞之間)胃祖細胞的增殖，以及胃腺體基底部有絲分裂后的主細胞重組成為增殖的化生細胞[3]。胃單位重組形成慢性萎縮被稱為解痙多肽表達化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia,SPEM)[4]，這種化生形式具有進化保守性，可導致近端胃單位(如胃竇)的短暫性改變，進而使得其在應對深部腺體損傷條件下，具有修復及重組為正常胃黏膜結(jié)構的功能[5]。但是在某些條件下，重組被中斷后持續(xù)的SPEM可以進展到異型增生[6]。

既往動物研究證實腸化生(intestinal metaplasia,IM)起源于SPEM，其中某些研究發(fā)現(xiàn)造模方式不同也會導致SPEM的進展不同，如Hp感染所致的SPEM僅進展到異型增生，而不會進展至IM，但這些研究均證實SPEM為癌前級聯(lián)反應的初始步驟[3,6-8]。目前國內(nèi)胃癌前病變動物模型研究鮮有涉及SPEM，本文就SPEM動物模型做一綜述。

1 DMP-777誘導的缺乏炎癥的SPEM模型

為了構建泌酸腺體萎縮模型，在2000年，GOLDENRING等[9]開展了DMP-777 誘導的可逆性泌酸腺體萎縮的研究，即單獨以該試劑處理小鼠特定時間后胃黏膜可自行恢復。DMP-777是一種具有選擇性的人白細胞彈性蛋白酶抑制劑，通常以濃度2%懸浮在0.5%的甲基纖維素的溶液中。研究證實DMP-777可導致特定壁細胞缺失，胃小凹增生而致使正常腺體細胞系缺乏。

有研究發(fā)現(xiàn)DMP-777處理小鼠在2 d內(nèi)即可導致壁細胞的快速缺失，予野生型小鼠連續(xù)灌胃7 d，在腺體基底部即可出現(xiàn)表達解痙多肽(Trefoil factor 2，TFF2)的黏膜細胞系化生——SPEM；而在敲除胃泌素小鼠中，灌胃1 d即可形成在蛋白及核酸水平均陽性表達TFF2的SPEM；經(jīng)DMP-777處理14 d后，敲除胃泌素小鼠繼續(xù)予以戒斷DMP-777為期14 d的觀察，SPEM仍持續(xù)存在，故可得出SPEM形成依賴于胃泌素[10]。該團隊后續(xù)又對上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是否調(diào)節(jié)泌酸腺體萎縮的化生應答進行了相關研究，分別予敲除雙調(diào)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子α及其野生型小鼠DMP-777灌胃，灌胃時間及藥物恢復期均為14 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除雙調(diào)蛋白可促進泌酸腺體萎縮，SPEM及IM的形成[8,11-12]。因DMP-777誘導SPEM具有自身特點，仍在近期研究中與其他幾種造模方式形成模型對照，以研究主細胞化生機制[13]。

2 Hp或貓螺桿菌(H.felis)感染小鼠形成慢性炎癥的動物模型

Hp感染引起慢性淺表性胃炎并可進展至慢性萎縮性胃炎、腸化、異型增生甚至胃癌，現(xiàn)有研究主要通過Hp或H.felis注射、灌胃或者與黏膜共培養(yǎng)形成相關模型。研究證實H.felis可加速C57BL/6小鼠胃黏膜萎縮、細胞凋亡及改變細胞系分化[14-15]。抑酸及Hp感染均可導致高胃泌素血癥，有研究發(fā)現(xiàn)胰島素-胃泌素轉(zhuǎn)基因小鼠在20月齡時表現(xiàn)為胃黏膜化生、異型增生、原位癌及具有血管浸潤的胃癌，而H.felis感染的胰島素-胃泌素轉(zhuǎn)基因小鼠可進一步加速黏膜內(nèi)腫瘤的發(fā)生(85%)，黏膜下腫瘤浸潤(54%)及血管內(nèi)浸潤(46%)，說明H.felis感染對化生、異型增生及腫瘤形成具有重要作用[16]。

此后，又有研究縮膽囊素/胃泌素受體及組胺H2受體信號通路在胃黏膜萎縮和胃癌中的作用，證實縮膽囊素/胃泌素及組胺H2受體拮抗劑具有協(xié)同抑制H.felis感染的胰島素-胃泌素轉(zhuǎn)基因小鼠模型胃黏膜萎縮和胃癌形成的作用[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)Hp感染早期即形成SPEM，腺體改變起源于持續(xù)感染Hp的SPEM腺體中，即由SPEM繼發(fā)IM[7]。同樣，使用H.felis感染C57BL/6小鼠6個月可形成SPEM模型，證實SPEM為癌前初始步驟，SPEM為進展至異型增生乃至胃癌的關鍵階段[18]。因Hp或H.felis感染所致的SPEM模型基本可模擬人體的SPEM形成過程，故與人體臨床標本對照可用于研究SPEM腺體細胞的遺傳不穩(wěn)定性[19]。

3 L-635形成快速誘導的具有炎癥應答的SPEM小鼠模型

由于DMP-777可抑制中性粒細胞彈性蛋白酶，在早期固有免疫應答階段阻止炎癥應答，因此DMP-777形成的壁細胞缺失的SPEM模型缺乏炎癥應答。而人體內(nèi)化生的形成均在一系列炎性反應的條件下產(chǎn)生，為了形成具有炎癥的新型的壁細胞缺失的SPEM模型，有研究者用德國默克公司合成的結(jié)構性相關的β內(nèi)酰胺復合物，該復合物可以保持壁細胞質(zhì)子載體潛在的活性，但卻不會攻擊中性粒細胞彈性蛋白酶。予C57BL/6小鼠連續(xù)灌胃3 d后，TFF2、內(nèi)因子均陽性表達的SPEM模型快速形成，這一模型再次證實炎癥和壁細胞缺失共同構成SPEM。

在前期研究基礎上，研究者比較了DMP-777、L-635及H.felis誘導的SPEM模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種不同的造模方式均可形成SPEM，至少是主細胞的部分轉(zhuǎn)化，L-635造模的特點為快速形成具有炎癥應答的主細胞轉(zhuǎn)化的SPEM模型[3]，缺點是合成L-635價格昂貴，不易獲得，在一般實驗室難以得到推廣。使用前面所述的3種造模方式，研究發(fā)現(xiàn)凝集素(clusterin)在3種不同方式造模小鼠中均異常升高，而囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)僅在具有炎癥表達的模型中表達升高，在人胃黏膜中，CFTR在腸化組織而非SPEM中表達[20]。由于L-635與DMP-777形成的SPEM存在炎癥有無的差別，故研究炎癥細胞通路在SPEM生成的作用可利用此兩種不同的造模方式，作為良好的對比模型，IL-33/13細胞因子信號通路在化生中的作用得到證實[21]。此后，基于該信號通路，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)外源性給予IL-33可使正常小鼠誘導SPEM形成[22]。由此看出，隨著SPEM形成機制的深入研究，未來SPEM構建模型將出現(xiàn)多樣化趨勢。

4 Tamoxifen誘導的急性SPEM小鼠模型

由于DMP-777所致SPEM模型缺乏炎癥應答，L-635價格昂貴而不易獲得，H.felis誘導的SPEM造模時間長且可能伴有異型增生乃至胃癌，故探索新型的造模劑極為迫切。Tamoxifen是一種廣泛使用于臨床與研究的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，研究發(fā)現(xiàn)予Tamoxifen≥3 mg/20 g正常小鼠體重3 d，即可導致超過90%胃壁細胞凋亡及酶原主細胞化生，且胃組織可在3周后恢復正常[23]。這一造模方式成為目前研究SPEM最常用的造模方式，并形成了相關方法學文獻指導，使得這一造模方式具有均一、可重復驗證而得以推廣[24]。

鑒于Tamoxifen造模的穩(wěn)定性，借助此模型開展了對SPEM相關炎性因子如白細胞介素-10(IL-10)的研究[25]，急性藥物及慢性炎癥所致胃黏膜損害所致SPEM的單細胞轉(zhuǎn)錄分析[26]。構建此項模型后，同樣也為研究Hp與化生改變之間的關系創(chuàng)造了良好條件，將Tamoxifen誘導的急性SPEM小鼠胃黏膜形成自由浮動的組織塊，與Hp共培養(yǎng)后證實，不管在人還是小鼠SPEM腺體中，均可通過路易斯抗原(sialyl-Lewis X，sLex)連接[27]。同時，為了研究頸黏液細胞、主細胞及SPEM細胞在小鼠中增殖和分化模式，最新研究在使用Tamoxifen及Hp誘導形成胃黏膜損害的同時，予以溴尿苷作為誘變劑進行干預，進一步對穩(wěn)態(tài)或化生誘導的胃黏膜損害的細胞增殖和分化進行了研究報道[28]。以SPEM為代表的各類化生究竟如何增加致癌的風險，為了研究這一問題，有研究者將C57BL/6小鼠共同飼以高劑量Tamoxifen及雷帕霉素，在誘導SPEM同時可阻滯哺乳動物雷帕霉素靶蛋白敏感型復合體(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)活性，并讓小鼠自由飲用含亞硝基脲的水誘導胃癌形成[29]。

隨著對SPEM機制研究的深入，近期研究傾向于將多種模型對比使用或聯(lián)合使用，或聯(lián)合使用關鍵基因、蛋白敲除小鼠等復合形成動物模型，或加用其他化學藥物，以達到驗證既定研究假設的作用[29-31]。如使用DMP-777、L-635、H.felis之間形成不同對照模型，研究主細胞轉(zhuǎn)化的機制[32]?；蛘邽榱搜芯刻囟ǖ鞍讓PEM的影響，使用敲除該蛋白如人附睪蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)基礎上，分別使用DMP-777、L-635、高劑量Tamoxifen誘導的SPEM模型，以研究HE4蛋白在胃癌形成中的作用[33]。

5 脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)刺激巨噬細胞源外泌體促進SPEM形成

DCA作為一種對人類有害的次級膽汁酸，有研究證實其可促進腸化生標記物的表達?；诖?，有研究者將6周齡大的C57BL/6雄性小鼠隨機分成正常對照組(無菌水灌胃)、DCA組(100 μmol/L DCA溶于無菌水中)，兩組中每只小鼠每天用200 μL無菌水灌胃(含或不含DCA)，4周后收獲胃黏膜標本，熒光免疫檢測SPEM標記物TFF2、GSⅡ外源凝集素，結(jié)果顯示此種造模方式同樣可形成SPEM[34]。但此種造模方式目前僅有一個研究采用，其穩(wěn)定性尚待更多研究予以證實。

6 總 結(jié)

綜上所述，不管藥物誘導還是Hp或H.felis感染均可形成SPEM模型，但因不同藥物及Hp或H.feli感染的不同特性，使得誘導模型具有自身特點，均可為目前研究SPEM生成及進展機制使用。研究者可根據(jù)研究目的選擇相應造模方式，同時由于各個模型的自身局限性，開展不同模型進行對照研究可以較好揭示SPEM在胃癌前病變中的作用機制。