血清IgG糖基化修飾特征與自身免疫性疾病關(guān)系及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

陳妍雯 袁舒穎 張春玲 鄒琳 蘆鑫榮 劉瑞杰 張紹興 陳力 孫桂芹

318000浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）（張春玲）

200032上海 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（鄒琳 蘆鑫榮 陳力）

自身免疫性疾?。ˋID）指機(jī)體免疫系統(tǒng)在環(huán)境或遺傳等因素影響下，對(duì)自身成分發(fā)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答而引起自身組織器官損害的疾病，其主要病因是自身抗體產(chǎn)生和免疫調(diào)節(jié)異常［1］。目前常見(jiàn)的AID有系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、干燥綜合征（SS）等。自身抗體是由自體細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)組織器官的抗體，正常人體內(nèi)存在自身抗體的含量較低，當(dāng)體內(nèi)的自身抗體含量超過(guò)閾值時(shí)，會(huì)對(duì)組織器官造成損傷［2］。多數(shù)自身抗體是免疫球蛋白G（IgG），IgG是血清中重要的糖蛋白。糖基化是蛋白質(zhì)非常重要的翻譯后修飾，可影響蛋白功能，如促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫耐受及產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)等，在生命體的多種生物過(guò)程中有重要意義［3-4］。研究表明，自身免疫性疾病SLE、SS、RA等患者血清抗體IgG表現(xiàn)為異常糖基化［5-7］。本文闡述IgG的糖基化類(lèi)型、糖基化對(duì)IgG功能的影響、常見(jiàn)自身免疫性疾病IgG的糖基化改變、參與糖基化修飾相關(guān)的基因及目前IgG糖基化檢測(cè)的主要方法，為IgG糖基化與自身免疫性疾病的研究提供思路。

1 IgG糖基化修飾

蛋白質(zhì)糖基化是一種寡糖與蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基以共價(jià)鍵方式連接的修飾方法，由一系列糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶控制［8］。蛋白質(zhì)糖基化類(lèi)型，主要包括N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化是寡糖與多肽鏈上的天冬酰胺（Asn）連接，N-糖基化位點(diǎn)的氨基酸特征序列為Asn-X-Ser/Thr（X代表除脯氨酸外的任一氨基酸；Ser：絲氨酸，Thr：蘇氨酸），真核生物中最為常見(jiàn)。O-糖基化中寡糖的連接位點(diǎn)為Ser或Thr，糖基化位點(diǎn)無(wú)特征性氨基酸序列［9-10］。

IgG是具有抗體活性的糖蛋白，主要存在血清中。IgG-Fc段的CH2含有保守的N-糖基化修飾位點(diǎn)Asn-297；而Fab段糖基化修飾發(fā)生在IgG可變區(qū)，糖基化多變性強(qiáng)，研究較難。根據(jù)IgG上Asn-297位點(diǎn)連接的寡糖類(lèi)型，糖鏈分為G0型糖鏈、G1型糖鏈、G2型糖鏈。G1型較G0型在糖鏈末端多一個(gè)半乳糖；根據(jù)半乳糖連接的N-乙酰葡萄糖胺的不同，G1型又分為G1a型、G1b型；G2型糖鏈末端有兩個(gè)半乳糖。

2 IgG糖基化修飾及其功能

IgG-Fc段的N-糖基化可影響其理化性質(zhì)。AOYAGI等［11］報(bào)道IgG-Fc段的寡糖鏈可維持抗體四級(jí)結(jié)構(gòu)以及Fc段的熱穩(wěn)定性，在一定程度上調(diào)節(jié)抗體效能。末端糖基與IgG-Fc段的溶解性相關(guān)，糖鏈末端半乳糖能使氨基酸殘基的水溶性減弱，糖鏈末端唾液酸能使氨基酸殘基的水溶性增強(qiáng)［12］。

IgG-Fc段的N-糖基化參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。AOYAMA等［13］發(fā)現(xiàn)IgG-Fc段N-寡糖Man α-1-6分支鏈上的半乳糖，能增強(qiáng)IgG和FcγR受體的親和力，導(dǎo)致抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）。IgG-Fc段N-寡糖的末端半乳糖化，還可促進(jìn)抗體與血清補(bǔ)體C1q結(jié)合，激發(fā)補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用（CDC）。末端唾液酸化、核心巖藻糖基化水平下降，甘露糖基化和平分型N-乙酰氨基葡萄糖水平上升，均可增強(qiáng)ADCC效應(yīng)［5］。另外，IgG-Fc段的N-糖基化可能與個(gè)體衰老有關(guān)。HAAN等［14］和YU等［15］報(bào)道自新生兒期開(kāi)始，IgG的唾液酸化水平，隨年齡增加而降低。

3 臨床常見(jiàn)自身免疫性疾病患者血清IgG的糖基化

研究表明，多種自身免疫性疾病患者血清總IgG或特異性自身抗體，IgG-Fc段N-寡糖結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化［5］。IgG的糖基化水平與自身免疫性疾病的相關(guān)機(jī)制尚未明確，但與炎癥發(fā)生的相關(guān)機(jī)制已有報(bào)道。IgG-Fc段N-寡糖結(jié)構(gòu)改變，影響IgG與FcγR受體或C1q補(bǔ)體親和力，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，對(duì)常見(jiàn)自身免疫性疾病的血清IgG糖基化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對(duì)常見(jiàn)自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的糖基化異常進(jìn)行比較分析。綜合結(jié)果顯示，IgG含有半乳糖的糖鏈含量下降，可能是自身免疫性疾病的共有特征。HT患者IgG糖鏈中，末端半乳糖化糖型降低但唾液酸化糖型增高，提示該疾病可能與唾液酸糖苷酶相關(guān)。

3.1 半乳糖基化 MATSUMOTO等［16］報(bào)道RA自身特異性抗體類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）的半乳糖基化水平下降，會(huì)增強(qiáng)RF活性，可能加重關(guān)節(jié)炎癥。GEIJN等［17］報(bào)道認(rèn)為，提高RA患者的雌激素水平，使血清總IgG的半乳糖基化水平上升，關(guān)節(jié)炎癥減輕，疼痛感減弱。FRANO等［18］發(fā)現(xiàn)SLE患者半乳糖基化水平下降的IgG與甘露糖結(jié)合凝集素的親和力增加，激活凝集素補(bǔ)體途徑；與C1q的親和力減弱，抑制經(jīng)典補(bǔ)體途徑，從而減弱自身抗原清除能力，提示其具有一定促炎活性。BOND等［6］發(fā)現(xiàn)與健康人相比，SS患者與RA患者血清IgG的GlcNAc水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而GlcNAc在RA患者中高于健康人水平，半乳糖與GlcNAc的相關(guān)性可能與疾病種類(lèi)有關(guān)。SHINZAKI等［19］分析炎癥性腸病患者血清IgG，發(fā)現(xiàn)G2型糖鏈減少，而G0型糖鏈增多，G0/G2的比值越大病情越嚴(yán)重，G0/G2值可用于該疾病的臨床診斷。然而，有研究稱(chēng)血清總IgG半乳糖基化水平下降，其與FcγRIIIa、FcγRIIIb受體的親和力減弱，導(dǎo)致ADCC效應(yīng)降低，與C1q補(bǔ)體的親和力減弱，導(dǎo)致CDC效應(yīng)降低，有一定抗炎活性［20］。

3.2 唾液酸化 研究表明，IgG-Fc段N-寡糖末端唾液酸化，與其抗炎和促炎活性有關(guān)［21］。Z?BCZY?SKA等［22］分析HT患者血清IgG的N-寡糖，與唾液酸特異性結(jié)合凝集素的反應(yīng)增強(qiáng)，表明唾液酸化水平升高，與FcγR受體親和力降低，ADCC效應(yīng)減弱，可能有一定的抗炎作用，但唾液酸化與HT的關(guān)系還未明確［23］。PAGAN等［24］對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠輸注唾液酸轉(zhuǎn)移酶，提高血清總IgG唾液酸水平，小鼠關(guān)節(jié)的炎癥滲入減少、組織破壞程度減輕。ENGDAHL等［25］發(fā)現(xiàn)雌激素治療RA患者能使其唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性增加，血清IgG唾液酸化水平上升，關(guān)節(jié)炎癥減輕。上述研究提示，IgG末端唾液酸化，與其抗炎活性有關(guān)。WUHRER等［26］檢測(cè)GPA患者血清的總IgG唾液酸化水平下降，與FcγRIa、FcγRIIIb的親和力增強(qiáng)，加強(qiáng)ADCC效應(yīng)；自身特異性抗體抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）唾液酸水平下降，激活細(xì)胞因子γ-干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子，從而引起炎癥。CHENG等［27］報(bào)道JIA患者血清IgG的唾液酸水平降低，與B細(xì)胞表面IgG-Fc受體樣蛋白5（FcRL5）親和力高，激活B細(xì)胞相關(guān)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。

3.3 核心巖藻糖基化 已有報(bào)道［28-29］，RA患者ACPA中的核心巖藻糖基化水平隨著關(guān)節(jié)炎的發(fā)展而上升，但對(duì)IgG介導(dǎo)的Fc受體、補(bǔ)體相關(guān)炎癥作用機(jī)制尚未明確。SHIELDS等［23］通過(guò)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞獲得Fc段Asn297無(wú)核心巖藻糖的IgG，發(fā)現(xiàn)其與FcγRIIIa的親和力增加，ADCC效應(yīng)增強(qiáng)。另外，GUO等［30］發(fā)現(xiàn)隨著用卵清蛋白誘導(dǎo)小鼠免疫次數(shù)增加，IgG含量升高，且IgG Fc段核心巖藻糖基化水平越高，IgG巖藻糖基化水平的上升，可能由于多次免疫誘導(dǎo)抗原特異性B細(xì)胞的增殖和分化。

3.4 甘露糖基化 YUAN等［31］報(bào)道HT患者的TgAb-IgG的甘露糖基化水平升高，根據(jù)患者血清TgAb水平分為高組和中等組，并純化得到兩組等量TgAb-IgG，分析發(fā)現(xiàn)高組的TgAb-IgG的甘露糖基化水平高于中等組。SLE患者血清總IgG的甘露糖基化水平與健康人差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［32］。然而，GREEN等［33］建立α-甘露糖苷酶II基因突變小鼠模型，使小鼠血清IgG甘露糖基化水平上升，并出現(xiàn)人SLE樣腎小球腎炎，提示IgG甘露糖基化可能與SLE有一定關(guān)聯(lián)。ZHOU等［34］為研發(fā)抗體建立小鼠模型，發(fā)現(xiàn)IgG末端高甘露糖基化水平上升，使IgG與FcγRIIIa受體親和力增加，從而增強(qiáng)ADCC效應(yīng)。BOUNE等［35］提出IgG甘露糖分子數(shù)增多常伴有末端半乳糖缺失，甘露糖基化IgG的促炎活性需結(jié)合半乳糖基化水平分析。另外，繆金升等［32］報(bào)道，RA患者血清RF的高甘露糖型糖鏈降低，且與健康人相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述研究表明，IgG的甘露糖基化修飾水平與自身免疫性疾病的關(guān)系有待更深入的研究。

4 自身免疫性疾病與糖基化相關(guān)基因的研究

人類(lèi)基因組中約有2%的基因編碼糖基化相關(guān)蛋白，且其中60%編碼糖基化相關(guān)蛋白的基因與N-糖基化相關(guān)［36］。IgG糖基化受糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶基因的調(diào)控，并影響IgG的結(jié)構(gòu)和功能。GALLO等［37］發(fā)現(xiàn)SS患者半乳糖轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因B4GALT1、B4GALT2、B4GALT3、B4GALT16表達(dá)水平降低，可能導(dǎo)致寡糖鏈末端半乳糖水平下降；唾液酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因ST8SIA4表達(dá)增加，可能導(dǎo)致寡糖鏈末端唾液酸水平上升。

此外，LAUC等［38］分析各種自身免疫性疾病中，與IgG糖基化水平相關(guān)基因的表達(dá)情況，其中與編碼糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的基因有：B4GALT1（編碼β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1）、ST6GAL1（編碼ST6 β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1）、FUT8（編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8）和MGAT3（編碼β-1，4-甘露糖基糖蛋白4-β-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶）；另外報(bào)道與糖基化有關(guān)聯(lián)的基因，在自身免疫性疾病中表達(dá)發(fā)生變化，RA相關(guān)基因IL6ST-ANKRD55（編碼IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子-錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域55，與半乳糖基化相關(guān)）表達(dá)下降；SLE相關(guān)基因IKZF1（編碼IKAROS家族鋅指1蛋白，與核心巖藻糖基化有關(guān)）表達(dá)下降；CD相關(guān)基因IKZF1表達(dá)上升；UC相關(guān)基因LAMB1（編碼層粘連蛋白亞基Beta1，與核心巖藻糖基化有關(guān)）表達(dá)下降。

5 IgG糖基化的檢測(cè)方法

標(biāo)準(zhǔn)化的糖基化檢測(cè)方法，是糖組學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，可為自身免疫性疾病與糖基化的研究提供技術(shù)。目前通用的糖蛋白寡糖分析，是先經(jīng)N-糖苷酶水解制備糖鏈，再經(jīng)質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳、色譜等技術(shù)分析制備樣品中的糖鏈結(jié)構(gòu)。

5.1 蛋白糖鏈制備 糖蛋白糖鏈制備的方法為酶切法和化學(xué)水解法。其中酶法特異性較好，過(guò)程中糖鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，較為常用。根據(jù)酶切體系中反應(yīng)流程的不同設(shè)計(jì)，酶切法可分為N-糖苷酶單酶切法和糖苷酶/N-糖苷酶序貫酶切法。（1）N-糖苷酶單酶切法（PNGase Assay）：1984年，PLUMMER等［39］發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌中第一個(gè)N-糖苷酶F（PNGase F）。PNGase F具有廣泛的底物特異性，能水解并釋放糖蛋白上完整的N-糖鏈，是經(jīng)典的糖蛋白糖鏈制備方法。但PNGase F不能作用于植物和昆蟲(chóng)來(lái)源的含有α-1，3核心巖藻糖的N-糖蛋白。2015年，SUN等［40］發(fā)現(xiàn)第二種細(xì)菌來(lái)源的N-糖苷酶PNGase F-Ⅱ。PNGase F-Ⅱ?yàn)閺V譜N-糖苷酶，在具有PNGase F功能的同時(shí)，還可水解釋放含有α-1，3核心巖藻糖的N-糖蛋白的完整糖鏈，為糖鏈的制備，提供了一種新的途徑和方法。（2）糖苷酶序貫酶切法（Cut-Heat-Cut Assay）：PNGase單酶切分析法操作簡(jiǎn)便，但對(duì)解析糖鏈上各個(gè)糖的連接排列方式存在一定局限性。在此方法的基礎(chǔ)上，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院陳力課題組建立了多酶切制備分析法，即樣本先經(jīng)特定糖苷酶酶切并加熱去酶活后，再行PNGase酶切。利用這一流程，通過(guò)對(duì)比分析糖圖譜，可以解碼糖鏈結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，該方法于2019 年被正式命名為 Cut-Heat-Cut Assay［41］。Cut-Heat-Cut Assay是對(duì)PNGase單酶切分析法的一個(gè)重要補(bǔ)充。利用這一新的方法，LI等［42］發(fā)現(xiàn)第一個(gè)糖蛋白核心巖藻糖苷酶（cFase I），HOU等［41］發(fā)現(xiàn)第一個(gè)糖蛋白核心木糖苷酶（gpcXase I）及第一個(gè)細(xì)菌脫敏操縱子。糖苷酶/N-糖苷酶序貫酶切法可以為糖鏈解碼提供一種新的策略。

5.2 糖鏈檢測(cè) （1）質(zhì)譜法：利用質(zhì)譜（MS）技術(shù)檢測(cè)糖鏈，首先將樣品糖蛋白上的糖鏈分離下來(lái)，不同結(jié)構(gòu)的糖鏈在電場(chǎng)中帶上不同量的電荷，根據(jù)質(zhì)譜峰的分子量判斷糖鏈結(jié)構(gòu)，根據(jù)峰高分析同種糖鏈的含量。1988年Karas等首次用激光解析電離質(zhì)譜（LDI-MS）分析全血清聚糖譜［43］。在LDI-MS的基礎(chǔ)上，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）于樣本中添加基質(zhì)，由基質(zhì)從激光中吸收能量，根據(jù)分子在電場(chǎng)作用下到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間來(lái)測(cè)定離子質(zhì)荷比，是目前糖組學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的方法。（2）液相色譜法：液相色譜法包括高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜法（UPLC）和親水作用液相色譜法（HILIC）等，均通過(guò)色譜柱分離樣品并鑒定。UPLC較HPLC的色譜柱粒徑更小，利于物質(zhì)分離且檢測(cè)更為靈敏，具有分離糖異構(gòu)體和分析相對(duì)豐度的能力［44］。HILIC采取遞減有機(jī)溶劑比例的梯度進(jìn)行洗脫，對(duì)人血清IgG、RNase B和胎球蛋白的寡糖有較好的分離度［45］。另外，液相色譜法與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，可將靈敏度提高至納克水平［46］。（3）毛細(xì)管電泳法（CE）：CE分析糖鏈?zhǔn)抢冒l(fā)生硫酸化、糖基化的糖鏈會(huì)帶有負(fù)電荷，可在電場(chǎng)中發(fā)生分離［47］。所需的進(jìn)樣量少，標(biāo)本檢測(cè)靈敏度更高，但電滲作用會(huì)因樣品組成而變化，對(duì)分離的重復(fù)性有一定影響。LIU等［48］使用CE分析肝細(xì)胞癌患者血清糖蛋白上的N-糖鏈，發(fā)現(xiàn)α1酸性糖蛋白上的α（1，3）-巖藻糖三觸角糖鏈增多，帶有平分型β-N-乙酰葡萄胺的糖鏈減少。（4）核磁共振波譜法：核磁共振波譜（NMR）是使物質(zhì)在躍遷中產(chǎn)生能量差，表現(xiàn)出共振譜達(dá)到檢測(cè)鑒定的方法。糖蛋白寡糖鏈上不同的糖基會(huì)釋放不同的信號(hào)，若糖基發(fā)生位移，在NMR光譜中會(huì)顯示為不同位置的識(shí)別信號(hào)峰。目前可檢測(cè)糖鏈中糖基的連接順序、糖苷鍵的種類(lèi)與糖鏈的立體構(gòu)型［49］。由不同糖苷鍵連接的甘露糖，其信號(hào)峰在位置和強(qiáng)弱上都有差異［50］。

6 小結(jié)與展望

糖基化是蛋白質(zhì)重要的翻譯后修飾之一，對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有一定影響［5］。血清IgG和自身抗體均為糖蛋白，且自身免疫性疾病的患者血清IgG和自身抗體Fc段上不同類(lèi)型糖基化水平存在升高或降低。血清IgG的N-糖基化修飾，與抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用等炎癥途徑的激活或抑制相關(guān)。IgG糖基化與自身免疫性疾病的相關(guān)性有待進(jìn)一步探究。自身免疫性疾病患者IgG發(fā)生糖基化改變，部分伴有糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，提示可以從糖基化相關(guān)基因的角度，探索自身免疫性疾病發(fā)生的機(jī)制。

隨著糖基化分析技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)IgG N-糖基化與自身免疫性疾病的關(guān)聯(lián)有了更多認(rèn)識(shí)，并逐漸成為研究關(guān)注的熱點(diǎn)。目前用于糖基化分析的檢測(cè)技術(shù)有質(zhì)譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法及核磁共振波譜法等，這些技術(shù)為從糖基化角度研究自身免疫性疾病的致病機(jī)制，提供技術(shù)手段。血清IgG的N-糖基化水平，與自身免疫性疾病進(jìn)程有一定關(guān)聯(lián)性，可能成為自身免疫性疾病的潛在生物標(biāo)志物，為診斷、治療預(yù)后提供參考，也給疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物研究帶來(lái)重大意義。