清金化痰湯治療支氣管擴(kuò)張癥的作用機(jī)制*

鞏雪，曲妮妮，李金宗

1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 遼寧沈陽 110032 2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 遼寧沈陽 110032

支氣管擴(kuò)張癥為支氣管樹狀分支的不可逆性擴(kuò)張[1]，是一種致殘性疾病，有統(tǒng)計(jì)分析其發(fā)病率逐年增高，并且可以影響任何年齡段的人。主要癥狀為咳嗽咯痰，并發(fā)持續(xù)性咳嗽和勞累性呼吸困難[2]，甚至部分病人只是反復(fù)咯血[3]。其疾病名稱來源于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，但其基礎(chǔ)理論可追溯到中國古代中醫(yī)所謂的“肺癰”“肺脹”等肺系疾病。研究表明，中醫(yī)藥對(duì)于支氣管擴(kuò)張癥的干預(yù)效果顯著[4]。隨著中醫(yī)藥的日益發(fā)展，通過數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)在系統(tǒng)生物學(xué)的理論基礎(chǔ)上，分析生物疾病系統(tǒng)和中藥有效成分相關(guān)靶點(diǎn)，能夠更加準(zhǔn)確合理地指導(dǎo)中藥在臨床治療中的運(yùn)用[5]。經(jīng)文獻(xiàn)整理研究，清金化痰湯所囊括之藥物，由黃芩與山梔子，知母，桑白皮，瓜蔞仁，貝母，麥門冬，橘紅，茯苓，桔梗，甘草11味中草藥共同配伍而成，臨床上常用于治療呼吸系統(tǒng)疾病中證屬痰熱蘊(yùn)肺及相關(guān)癥狀綜合征。但中醫(yī)藥向來遵循整體觀念和辨證論治這個(gè)基本出發(fā)點(diǎn)，對(duì)方藥和疾病的關(guān)系研究較少，因而探尋清金化痰湯的與支氣管擴(kuò)張癥的關(guān)系有重要價(jià)值。

資料與方法

1 清金化痰湯有效成分的篩選

于TCMSP數(shù)據(jù)庫[6]，以黃芩、梔子、川貝母、桑白皮、瓜蔞、橘紅、桔梗、知母、茯苓、甘草11種中草藥為搜索詞，通過計(jì)算機(jī)檢索方式得到中草藥相關(guān)化學(xué)成分。因麥冬在TCMSP中搜索不到，故于TCMIP數(shù)據(jù)庫[7]中檢索。而后將信息匯總，使用PubChem數(shù)據(jù)庫[8]確認(rèn)化學(xué)成分，獲取相對(duì)應(yīng)的2D結(jié)構(gòu)及smiles號(hào)。導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫，選擇胃腸道吸收利用度GA值為“高”，并且Lipinski Veber、Ghose、Muegge、Egan 5個(gè)選項(xiàng)中2個(gè)以上為“是”為活性成分[9]。

2 清金化痰湯靶點(diǎn)預(yù)測

將所有活性化學(xué)成分2D結(jié)構(gòu)或smiles號(hào)導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，以物種為“homosapiens”，probability＞0.1為篩選條件[10]，預(yù)測清金化痰湯活性成分作用靶點(diǎn)。

3 檢索已知的支氣管擴(kuò)張癥靶點(diǎn)

于GeneCards在線數(shù)據(jù)平臺(tái)[11]，以“bronchiectasis”為關(guān)鍵詞，篩選與支氣管擴(kuò)張癥聯(lián)系密切的潛在靶點(diǎn)。

4 篩選藥物-疾病共同靶點(diǎn)

利用R語言4.1.2獲得清金化痰湯與支氣管擴(kuò)張癥共同靶點(diǎn)，于Venny 2.1在線平臺(tái)繪制韋恩圖進(jìn)行可視化。

5 “復(fù)方-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析

利用Cytoscape 3.8.2，展示“復(fù)方-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中共同靶點(diǎn)、關(guān)鍵藥物化學(xué)成分、疾病之間的相互作用關(guān)系。

6 清金化痰湯治療支氣管擴(kuò)張癥的PPI分析

使用String數(shù)據(jù)庫PPI分析功能處理共同靶點(diǎn)，選擇物種為“homosapiens”、置信度＞0.4，隱藏離散點(diǎn)，其余設(shè)置默認(rèn)，獲得可以展示蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)，從而明確清金化痰湯與支氣管擴(kuò)張癥共同靶點(diǎn)蛋白間的相互作用。運(yùn)用Cytoscape 3.8.2對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行美化，并且篩選出核心靶點(diǎn)。

7 復(fù)方-疾病共同靶點(diǎn)的GO及KEGG富集分析

利用R語言4.1.2及org.Hs.eg.db等相關(guān)程序包，對(duì)潛在共同靶點(diǎn)的生物過程BP、細(xì)胞組分CC、分子功能MF這3個(gè)方面分別實(shí)現(xiàn)富集分析，選擇每項(xiàng)前10繪制可視化柱狀圖。選擇KEGG富集分析前20條進(jìn)行可視化。從而探究清金化痰湯治療支氣管擴(kuò)張癥的可能潛在作用機(jī)制。

8 分子對(duì)接

于PubChem數(shù)據(jù)庫[12]下載清金化痰湯核心成分的2D結(jié)構(gòu)，作為配體。于PDB數(shù)據(jù)庫[13]下載核心基因的蛋白結(jié)構(gòu)，作為受體。在Pymol軟件對(duì)受體蛋白去水、加氫、加電荷。配體及受體均需在AutoDock 1.5.6更改為pdbqt格式。運(yùn)用Pymol獲得對(duì)接盒子xyz坐標(biāo)軸參數(shù)，輸入AutoDock-Vina開始分子對(duì)接，這時(shí)計(jì)算機(jī)CPU運(yùn)算得出最低結(jié)合能。PyMol獲得的受體與配體結(jié)合的復(fù)合物，導(dǎo)入PLIP平臺(tái)[14]進(jìn)行分析，使用PyMol對(duì)最佳分子對(duì)接模式進(jìn)行可視化。

結(jié)果

1 清金化痰湯活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

依照上述標(biāo)準(zhǔn)，檢索并篩選清金化痰湯的化學(xué)成分，并結(jié)合已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，去重后共得出清金化痰湯533種活性成分。SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫提取清金化痰湯533種活性成分的作用靶點(diǎn)，根據(jù)Uniport ID刪除重復(fù)項(xiàng)，最終共得出清金化痰湯活性成分的靶點(diǎn)基因1140個(gè)。靶點(diǎn)基因與活性成分一一匹配，剔除49個(gè)未匹配成功成分，最終確定該方的活性化學(xué)成分為484個(gè)。

2 支氣管擴(kuò)張癥靶點(diǎn)獲取結(jié)果

GeneCards數(shù)據(jù)庫中得出與支氣管擴(kuò)張癥聯(lián)系密切的已知潛在靶點(diǎn)1348個(gè)。

3 藥物與疾病的共同靶點(diǎn)獲取

通過R語言得到共同靶點(diǎn)210個(gè)，于Venny 2.1在線平臺(tái)繪制韋恩圖。見圖1。

圖1 藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

4 “復(fù)方-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

將清金化痰湯中533個(gè)活性成分與210個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中，隱藏游離節(jié)點(diǎn)（刪除114個(gè)與疾病靶點(diǎn)無交集的活性成分），展示“復(fù)方-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。見圖2。成分度值越大，說明其在治療支氣管擴(kuò)張癥中發(fā)揮作用越顯著。選取度值前10的成分，作為清金化痰湯治療支氣管擴(kuò)張癥的核心成分。見表1。

圖2 “復(fù)方-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)

表1 度值排名前10的活性成分

5 清金化痰湯治療支氣管擴(kuò)張癥的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)

依照上述標(biāo)準(zhǔn)，使用String數(shù)據(jù)庫PPI分析功能處理共同靶點(diǎn)，刪除1個(gè)離散節(jié)點(diǎn)，選擇tsv格式文件下載，并且導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。網(wǎng)絡(luò)圖含有209個(gè)節(jié)點(diǎn)和3682條邊，運(yùn)用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯═opological Data Analysis，TDA），根據(jù)接近中心性CC、借助度中心性DC、介度中心性BC、局部邊連通性LAC和網(wǎng)絡(luò)中心性NC、特征向量中心性EC這6個(gè)指標(biāo)，以大于中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行3次計(jì)算分析，后獲得9個(gè)核心基因，分別是GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、STAT3、JUN、MAPK3。見圖4、圖5。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因篩選流程圖

圖5 核心基因

6 GO靶點(diǎn)通路分析結(jié)果

GO富集分析表明清金化痰湯治療支氣管擴(kuò)張癥靶點(diǎn)影響了2535個(gè)生物學(xué)過程，包含77個(gè)細(xì)胞組成成分，涉及了167個(gè)分子功能。BP主要有細(xì)胞間黏附的調(diào)控、白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、白細(xì)胞與細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、單個(gè)核細(xì)胞分化、肽基-酪氨酸磷酸化、對(duì)外界刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、肽基酪氨酸修飾、T細(xì)胞活化等；CC包含膜筏、膜微域、質(zhì)膜外側(cè)、水泡腔、分泌顆粒管腔、胞質(zhì)小泡腔、免疫突觸、細(xì)胞頂端部分、空泡腔、質(zhì)膜筏等成分；MF主要涉及跨膜受體蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性、趨化因子結(jié)合、絲氨酸肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、C-C趨化因子受體活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、C-C趨化因子結(jié)合等。見圖6。

圖6 GO富集分析

7 KEGG富集分析結(jié)果

KEGG富集分析得到153條通路，富集比較明顯的前20個(gè)通路包括：晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體AGE-RAGE信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、Th17細(xì)胞分化、乙肝、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、恰加斯病、人T細(xì)胞白血病病毒1型感染、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、前列腺癌、蛋白多糖與癌癥、NF-κB信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、PD-L1在腫瘤中的表達(dá)及PD-1檢查點(diǎn)通路、冠狀病毒新冠肺炎、甲型流感、細(xì)胞衰老、弓形蟲病等。見圖7。

圖7 KEGG富集分析

8 分子對(duì)接分析結(jié)果

研究表明，結(jié)合能為負(fù)數(shù)時(shí)配體與受體可以自動(dòng)結(jié)合，其結(jié)合能越低，對(duì)接模式越穩(wěn)定[15]。見表2。結(jié)果可知，山奈酚、槲皮素、7，4'-二羥基普黃酮、芹菜素與5個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合能均較低，并且可以形成穩(wěn)定氫鍵，證明清金化痰湯治療支氣管擴(kuò)張癥效果頗佳。為了結(jié)果更加可視化，使用PyMol軟件對(duì)結(jié)合能小于- 9.0 KJ/mol的6種對(duì)接模式進(jìn)行繪圖。見圖8。

圖8 分子對(duì)接模式圖

討論

1 藥物-疾病關(guān)系闡述

本病屬于難治性疾病，其主要癥狀為咳嗽、咯痰。在中醫(yī)學(xué)中，咳喘為肺氣氣機(jī)上逆所致。又因氣血相隨，氣機(jī)上逆而血隨之升從而可見咯血。賀夢(mèng)雪等[16]從調(diào)暢肺氣對(duì)支氣管擴(kuò)張癥進(jìn)行論治，宗慧琪等[17]認(rèn)為可以通過調(diào)理肺氣之上交氣機(jī)以達(dá)人體升降相因，所以通過梳理肺氣可以有效干預(yù)治療本病。吳夢(mèng)清等[18]認(rèn)為通過化痰逐瘀法可對(duì)本病有良好干預(yù)效果。

由于反復(fù)性呼吸道感染及氣道損傷，杯狀細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞等上皮細(xì)胞組織受損，分泌粘液增多，導(dǎo)致痰液增多，氣道平滑肌受損從而擴(kuò)張，氣道擴(kuò)張導(dǎo)致粘液清除失敗，感染風(fēng)險(xiǎn)再度增加。所以，持續(xù)性細(xì)菌感染、免疫反應(yīng)失調(diào)、纖毛清除障礙和氣道阻塞等機(jī)制相互作用和自我延續(xù)，隨著時(shí)間的推移導(dǎo)致肺功能一步步受損[3]。

清金化痰湯來源于明朝葉文齡所著《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》，方中橘紅擅梳理肺氣，更有顯著的止咳化痰效果。茯苓屬利水滲濕藥，而炎癥反應(yīng)為水液堆積，進(jìn)而劫煉津液化為痰。氣機(jī)不利導(dǎo)致氣機(jī)停滯，陽氣熏蒸則阻滯而化熱，熱之極致便會(huì)化火。因而方中配合瓜蔞仁、貝母、桔梗以達(dá)到清熱滌痰之功，并以黃芩、梔子、桑白皮來泄肺中郁火。正如河間學(xué)派理論所言，“氣有余便是火”。這種“有余”是相對(duì)而言，并非絕對(duì)化，阻滯造成局部堆積依舊是相對(duì)有余。此為火證、熱證，那么火熱傷津液，所以配合麥冬知母以達(dá)到滋養(yǎng)肺陰的功效。又以甘草調(diào)和，以防止更多的副作用產(chǎn)生。金之母土也，土者脾也。甘草甘緩之性調(diào)和諸藥而控制藥效吸收利用，是“氣歸于精而味歸于形”也。全方有清熱潤肺之功，可針對(duì)支氣管擴(kuò)張癥的相關(guān)癥狀進(jìn)行有效干預(yù)。

2 藥物-疾病交集靶點(diǎn)及潛在作用機(jī)制分析

本次研究篩選獲得的山奈酚、槲皮素、7，4'-二羥基普黃酮、芹菜素均屬于類黃酮化合物，是一種廣泛的存在于我們?nèi)粘５纳攀愁惣に?。氣道粘膜炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為粘膜下腺體增生肥厚，以及粘液分泌過多。山奈酚和槲皮素皆可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，拮抗TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌，同時(shí)增強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá)程度，進(jìn)而拮抗炎癥反應(yīng)[19-21]。Cicek M[22]等通過大鼠實(shí)驗(yàn)研究表明，芹菜素可以抑制氧化應(yīng)激，減少炎性細(xì)胞的產(chǎn)生，從而達(dá)到改善肺損傷的目的。山奈酚通過阻斷支氣管上皮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，有效減少粘液分泌，同時(shí)抑制杯狀細(xì)胞增生[23]。來源于甘草的7，4'-二羥基黃酮，可調(diào)節(jié)NF-κB抑制MUC5AC基因表達(dá)[24]，從而減少粘液產(chǎn)生。正如氣行則津不停，液不阻則痰不凝，從而可以達(dá)到化痰止咳之目的。Treg細(xì)胞具有免疫抑制性，可以抑制Th17細(xì)胞，拮抗IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氣道重塑過程。而槲皮素可加強(qiáng)Treg細(xì)胞分化、減弱Th17細(xì)胞分化，來恢復(fù)Th17/Treg的平衡[25]，達(dá)到這一治療作用。7，4'-二羥基黃酮還可抑制嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生[26]，有效降低哮喘支氣管擴(kuò)張表型及支氣管肺曲霉病患者患者血清IgE水平，減輕氣道炎癥。正如《內(nèi)經(jīng)》所言，“正氣存內(nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。上述核心成分均可減少粘液分泌，拮抗炎癥反應(yīng)，改善機(jī)體免疫力，延緩氣道重塑，減輕氣道損傷。

本次研究發(fā)現(xiàn)9個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白，分別是GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、STAT3、JUN、MAPK3。GAPDH分布在人體的各個(gè)部分，參與糖酵解的能量代謝，還參與了細(xì)胞衰老凋亡、DNA修復(fù)及自噬、炎癥反應(yīng)條件、免疫調(diào)節(jié)等生理過程。Takaoka Y等[27-28]研究表明，GAPDH可以顯著降低促炎細(xì)胞因子和血清趨化因子的表達(dá)，且可通過調(diào)節(jié)NAD1/NADH平衡，影響巨噬細(xì)胞吞噬功能和極化，從而改善大鼠肺損傷。Menéndez R等[29]通過對(duì)165名患者進(jìn)行臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL17、TNF、IL-6和IL-8水平越高，患者支氣管擴(kuò)張程度越廣泛，氣道阻塞越嚴(yán)重。IL-6為炎癥反應(yīng)重要因子，還參與免疫、代謝、再生和神經(jīng)過程的調(diào)節(jié)，對(duì)因病毒感染和細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)有重要調(diào)節(jié)作用[30]。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子家族的一員，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮恢復(fù)，改善支擴(kuò)患者的咯血癥狀。同時(shí)VEGFA參與缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路，缺氧或者持續(xù)的銅綠假單胞菌感染會(huì)誘導(dǎo)VEGFA合成，促進(jìn)生成小血管，使血管通透性升高并且滲入大量炎癥介質(zhì)與細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)[31]。STAT3可以影響Th17信號(hào)通路，生成IL-17使中性粒細(xì)胞聚集介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，還與因氣道損傷導(dǎo)致基底細(xì)胞向纖毛細(xì)胞分化的過程相關(guān)，并且參與粘液分 泌[32]。所以清金化痰湯可抑制相關(guān)炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力，減少咯血，改善肺功能以及呼吸道平滑肌氣道損傷，延緩氣道重塑過程。

GO與KEGG分析結(jié)果顯示，靶點(diǎn)基因主要富集在炎癥細(xì)胞間的黏附、免疫細(xì)胞分化與激活、蛋白質(zhì)特異性結(jié)合以及AGE-RAGE信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密不可分，RAGE是一種促炎因子，屬于免疫球蛋白超家族，其受體在肺部感染期間上調(diào)；AGE和RAGE均可以起肺細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡[33]。TNF能夠抗感染、拮抗病毒復(fù)制及蛋白質(zhì)合成，還可對(duì)抗細(xì)胞增殖[34]。在支擴(kuò)氣道炎癥進(jìn)展過程中人體自身免疫功能發(fā)揮作用，Th17細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞、TNF-α參與其中，銅綠假單胞桿菌的細(xì)菌反應(yīng)所釋放的內(nèi)毒素因子以及TNF-α因子會(huì)刺激樹突狀細(xì)胞，從而能夠引起T細(xì)胞的細(xì)胞分化，這將影響Th17細(xì)胞分化通路[35]。NF-kB是重要的二聚體轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附、生長信號(hào)、細(xì)胞增殖分化凋亡，在支氣管擴(kuò)張癥發(fā)病機(jī)制和急慢性炎癥反應(yīng)機(jī)制中起到重要作用?？梢娗褰鸹禍赏ㄟ^控制炎癥反應(yīng)、減少粘液分泌、提高機(jī)體免疫力、延緩氣道重塑等方面，多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療支氣管擴(kuò)張癥。

通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，核心成分山奈酚、槲皮素、7，4'-二羥基普黃酮、芹菜素與核心蛋白GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA的結(jié)合能均為負(fù)數(shù)。說明核心成分可以自動(dòng)結(jié)合核心蛋白，并且發(fā)揮作用，通過介導(dǎo)激活或抑制其相關(guān)通路，達(dá)到對(duì)支氣管擴(kuò)張癥的干預(yù)作用。

綜上所述，本研究闡明清金化痰湯中山奈酚在內(nèi)的多個(gè)有效成分可通過介導(dǎo)Th17細(xì)胞分化、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路在內(nèi)的多通路干預(yù)效應(yīng)，達(dá)到多成分多靶點(diǎn)多通路的有效干預(yù)。對(duì)臨床治療支氣管擴(kuò)張癥的作用機(jī)制具有借鑒意義，同時(shí)也為更臨床應(yīng)用提供了理論支撐。但由于數(shù)據(jù)庫信息不全面、藥材成分差異等問題，結(jié)論仍待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證。