復(fù)配組合物中6 種成分含量檢測方法研究

陳慧芳，何敬愉，劉林峰，潘丹陽，陳英杰，龔盛昭，

（1.廣州環(huán)亞化妝品科技股份有限公司，廣東 廣州 510700；2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

黃芩、大黃、金銀花、蒲公英、龍膽草、黃柏是歷史悠久、醫(yī)用價值高的傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、消腫祛腐的功能，也是常見具有抗菌作用的提取物［1-6］，由這些提取物按一定比例復(fù)配成廣州環(huán)亞化妝品科技有限公司研發(fā)的祛痘組合物，作為核心功效成分應(yīng)用于化妝品中，深受消費者喜愛。痤瘡丙酸桿菌（PA）與痤瘡密切相關(guān)，是誘發(fā)和加重痤瘡的重要因素之一。抑制PA 的生長是目前治療痤瘡和預(yù)防痤瘡的重要手段。黃岑（Scutellaria Baicalensisi Georgi）是唇形科植物黃岑的干燥根，黃酮類化合物黃芩苷（Baicalin， C21H18O11）是其主要成分之一，黃芩苷具有廣譜的抗菌活性，離體實驗表明，黃芩苷在相同濃度下抑制痤瘡丙酸桿菌的作用是甲硝唑的 2 倍，是紅霉素的 115 倍［5］。大黃（Rheum Palmatum L.）為蓼科大黃屬植物大黃的干燥根，研究顯示大黃主要活性成分大黃素對引起痤瘡的痤瘡丙酸桿菌（PA）具有明顯的抑制作用［2］。金銀花、蒲公英、黃柏，龍膽草等均對痤瘡丙酸桿菌有抑制作用［6］。因此將能反映藥材品質(zhì)的化合物如金銀花中的綠原酸、蒲公英中的咖啡酸、龍膽草中龍膽苦苷、黃柏中的小檗堿、黃芩中的黃芩苷和大黃中的大黃素納入含量測定中。

復(fù)配組合物中藥味多，成分復(fù)雜，藥材質(zhì)量參差不齊，在品控時單一的化學(xué)成分測定很難反映整個組合物的質(zhì)量優(yōu)劣，以及難以監(jiān)測其品質(zhì)，分別測定時，存在檢測成本高、時間長等缺點。王冬等人［7］通過超高效液相色譜法（UPLC）同時測定了藥物制劑中大黃素、咖啡酸、綠原酸、野黃岑苷、木樨草素和虎杖苷6 種成分的方法，該方法操作快速、高效、準確。高旭東等人［8］建立梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、小檗堿和大黃色韓浪分析的雙波長HPLC 法，方法精密度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準確。因此，本研究以綠原酸、咖啡酸、龍膽苦苷、小檗堿、黃芩苷、大黃素為外標，建立同時分析多種藥材和復(fù)配組合物的特征成分的HPLC-DAD 分析方法，以期為藥材和復(fù)配組合物制定質(zhì)量控制標準。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

超純水機（北京萊特有限公司）；QC150 超聲波清洗器（上海先光器械廠）；高效液相色譜儀：1260 型串聯(lián)DAD 檢測器（美國安捷倫公司）；SY - 2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海榮亞生化儀器廠）；水浴鍋：DSY-2-8 型（北京國華醫(yī)療器械廠）；JJ300B 精密電子天平（瑞士 Starorius 公司）。

1.2 材料

金銀花、蒲公英、龍膽草、黃柏、黃芩、大黃均購于廣州大參林藥店；磷酸、甲醇、無水乙醇均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）、綠原酸、咖啡酸、龍膽苦苷、小檗堿、黃芩苷、大黃素購于阿拉?。ㄉ虾＃┕煞萦邢薰?。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液的制備

采用回流提取的方法提取金銀花、蒲公英、龍膽草、黃柏、黃芩和大黃等單味藥材或按一定生藥比例復(fù)配而成的的祛痘組合物，提取溶劑為純化水、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度80℃，回流提取60 min，過濾收集濾液，濾液采用D101 大孔吸附樹脂吸附洗脫，先用水洗脫，水洗脫液棄去，再用70%乙醇洗脫，收集醇洗脫液。醇洗脫液用低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，甲醇定容至2 mL，0.45 μL 有機濾膜過膜，裝入樣瓶中備用。

2.2 對照品貯備液的配制

分別精密稱取1 mg 綠原酸、咖啡酸、龍膽苦苷、小檗堿、黃芩苷、大黃素標準品，分別用色譜級甲醇溶解定容至10 mL。6 種標準品溶液各吸取1 mL 混合用色譜級甲醇定容至10 mL，得到混合標準品溶液，備用。

2.3 HPLC 分析條件與方法適應(yīng)性試驗

（1）檢測波長的確定：根據(jù)文獻［9-13］，用紫外分光光度計對綠原酸、咖啡酸、龍膽苦苷、小檗堿、黃芩苷、大黃素6 種標準品溶液進行200~400 nm 波長掃描，選擇適合的分析波長。

（2）色譜條件：Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18（4.6×150 mm 2.7 μm），流動相為甲醇-0.05% 磷酸水溶液，梯度洗脫：0~6 min，10%~25% ；6~15 min， 25%~30% ；15~21 min，30%~40% ；21~27 min， 40%~55% ；27~40 min，55%~90%；流速 1 mL/min、柱溫40℃。

2.4 方法學(xué)考察

（1）標準曲線的制作：將2.2 配制好的混合標準品溶液過0.45μm 濾膜，用上述色譜條件分別進樣 5，10，15，20，25，50 μL，繪制標準曲線。

（2）精密度分析：分別配制綠原酸、咖啡酸、龍膽苦苷、小檗堿、黃芩苷、大黃素6 種特征成分標準品，分別在上述色譜條件下日內(nèi)6 個不同時間點進行進樣分析，由測得面積（A）計算標準偏差（SD）和相對標準偏差（RSD），獲得日內(nèi)精密度值。

（3）重復(fù)性分析：按2.1 的方法，用同一批中藥材復(fù)配的祛痘組合物制備6 份祛痘組合物提取液在上述色譜條件下進樣，由測得6 種特征成分面積（A）計算相對標準偏差（RSD），分析重復(fù)性。

（4）穩(wěn)定性分析：配制6 種標準品特征成分的混合標準溶液，室溫靜置，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 進樣，由測得各特征成分面積（A）分析溶液穩(wěn)定性。

（5）樣品回收率分析：稱取 6 份已測定了各特征成分的復(fù)配組合物，按2.1 方法制備供試溶液，加入適量混合標準液，在最優(yōu)色譜條件下進樣，分析樣品并計算回收率。

2.5 樣品中各特征成分液相色譜法含量分析

按照2.1 制備6 種藥材和復(fù)配組合物待測液，各平行3 份，進樣10μL，計算樣品中復(fù)配組合物含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜結(jié)果

3.1.1 檢測波長的確定

通過HPLC 全波長掃描可知（見圖1），要同時測定6 種特征成分標準品以及樣品，考慮到各組分的靈敏度并避免其他組分干擾，選擇280 nm 波長作為檢測波長較為合適。

圖1 6 種成分的在線紫外光譜圖

3.1.2 色譜圖分析

圖2a~2f 中分別為6 種單一標準品及單一藥材提取物的色譜圖，g 圖為混合標準品復(fù)配組合物色譜圖，峰1 至峰6 分別為綠原酸、咖啡酸、龍膽苦苷、小檗堿、黃芩苷、大黃素。從圖中可以看出，上述色譜條件下樣品以及復(fù)配組合物中的各特征成分均可實現(xiàn)有效分離。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 標準曲線的制作與檢出限

以進樣量為橫坐標x 軸，峰面積為y 軸，繪制6 種特征成分的標準曲線，見表1。由表1 可知，在5.43~144.0 μg/L 范圍內(nèi)，6 種標準品都表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表1 6 種成分標準品線性關(guān)系表

3.2.2 精密度分析

由表2 可知，在280 nm 波長下，6 種特征成分的RSD 都小于2.76%，表明本方法精密度良好。

表2 精密度分析結(jié)果

3.2.3 重復(fù)性分析

表3 為同一配比的復(fù)配組合物6 個平行樣品的重復(fù)性分析。由表3 可知，在280 nm 波長下，祛痘組合物樣品中6 種特征成分的RSD 均在2.56%內(nèi)，表明本方法重復(fù)性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性分析

由表4 可知，室溫靜置下，280 nm 波長下6種特征成分的RSD 均小于2.07%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

3.2.5 回收率分析

由表5 可知，6 種特征成分在本方法下加標回收率為95.72%~103.20%，RSD 小于4.76%，說明本方法結(jié)果可靠。

3.3 樣品中特征成分含量的檢測

圖2 6 個成分標準品、6 種藥材及組合物的HPLC 色譜圖

表3 重復(fù)性分析結(jié)果

表4 穩(wěn)定性分析結(jié)果

根據(jù)2.1 中的方法得到的單味藥材和復(fù)配組合物，按2.4 的方法測定，不同樣品中特征成分含量的結(jié)果見表6。

4 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜法建立了同時檢測綠原酸、咖啡酸、龍膽苦苷、小檗堿、黃芩苷和大黃素等6 種成分的HPLC 分析方法。6 種成分在該方法下分離效果良好，精密度高、重現(xiàn)性好、準確度高。該方法使用的C18為常見色譜柱，購買方便，流動相為甲醇和磷酸水，容易配制，具有簡單、快速、高效、適用性廣等特點，可用于藥材原料和復(fù)配組合物的質(zhì)量控制，也可為含有相關(guān)藥材的其它組合物的質(zhì)量控制提供參考。

表5 回收率分析結(jié)果 （n=6）

表6 不同樣品中6 種成分含量差異 （n=3）