DNA甲基化在癌癥預(yù)防與治療中的研究進(jìn)展

★ 羅黎明 劉志勇（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

世界衛(wèi)生組織在2019年提出癌癥是導(dǎo)致人類死亡的第1或第2大因素，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)編制的GLOBOCAN顯示，癌癥的診斷和治療受到新冠的影響，2021年全球估計有1 929萬例新癌癥病例和995.8萬例癌癥死亡［1-2］。以往研究癌癥的發(fā)生機(jī)制主要著眼于基因突變、缺失等DNA序列改變，從而導(dǎo)致癌基因和抑癌基因進(jìn)一步激活或者失活。科研工作者在不斷研究攻克癌癥的過程中，發(fā)現(xiàn)DNA序列的改變可癌癥的發(fā)生，非傳統(tǒng)遺傳的表觀遺傳調(diào)控也同樣在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文主要以表觀遺傳修飾之DNA甲基化為靶點，簡單總結(jié)其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用和中藥抗腫瘤的去甲基化作用。

1 DNA甲基化

早在1983年，有研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，人類結(jié)腸癌細(xì)胞中特定基因的DNA甲基化減少。同年，另有研究報道癌細(xì)胞全基因組范圍的DNA甲基化中間產(chǎn)物5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）明顯降低［3］?，F(xiàn)階段研究者對表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制的了解仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)遺傳學(xué)，但DNA甲基化在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要性是毋庸置疑的。

DNA甲基化是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基可逆地添加到DNA序列中胞嘧啶的第五號位置的碳原子上面，形成5-甲基胞嘧啶的過程。見圖1。

圖1 DNA甲基化

人類基因組中近80%的CpG序列二核苷酸中可以檢測到DNA甲基化。癌癥中DNA甲基化異常指的是DNA過甲基化或低甲基化。DNA過甲基化指的是甲基的獲得，總是抑制轉(zhuǎn)錄和降低抑癌基因表達(dá)。而DNA低甲基化指的是DNA缺乏甲基化，影響基因組整體穩(wěn)定性或激活原癌基因。與DNA甲基化相關(guān)的酶有三類，分別具有建立、去除和識別DNA甲基化的功能，它們被形象地稱作“書寫者”“擦除者”和“讀取器”。“書寫者”是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，催化甲基添加到胞嘧啶殘基上，包括DNMT1/2、DNMT3A/B和DNMT3L等?！安脸摺笔荄NA 去甲基化酶，修飾并除去甲基，包括TET1/2/3等?！白x取器”是甲基識別相關(guān)的酶，識別并結(jié)合甲基最終影響基因表達(dá)，包括MeCP2、MBD1/2/4、UHRF蛋白，鋅指蛋白等。

2 DNA甲基化的建立與癌癥的關(guān)系

目前已知人類基因組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族包 括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L［4］。DNMT1、 DNMT3A和DNMT3B能夠直接催化甲基加成到DNA上。DNMT1優(yōu)先甲基化半甲基化DNA，在DNA復(fù)制過程中定位于親代 DNA 鏈中的甲基化CpG 位點，與新合成的DNA鏈結(jié)合并使其甲基化，以精確模擬DNA復(fù)制前存在的原始甲基化模式［5］。此外，還具有修復(fù)脫氧核糖核酸甲基化的能力。因此，DNMT1被稱為“維持DNA甲基化酶”。DNMT3A和DNMT3B在結(jié)構(gòu)與功能上極為相似，與DNMT1不同，DNMT3A和DNMT3B不偏好半甲基化DNA，可以對未修飾的DNA建立新的甲基化，將非甲基化CpG轉(zhuǎn)化為甲基化的CpG，因此被稱為“從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶”［6］。DNMT2和DNMT3L是非典型家族成員，不具有胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。DNMT2是一種RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，它能特異性甲基化天冬氨酸38位胞嘧啶［7］。DNMT3L可作為 Dnmt3A重新啟動甲基化的一般刺激因子，與DNMT3A結(jié)合形成異四聚體促進(jìn)DNA從頭甲基化，并通過與組蛋白去乙?；?相互作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制［8］。DNMT3C是一個新的DNA甲基化酶，通過在嚙齒動物基因組中復(fù)制 Dnmt3B進(jìn)化而來，在雄性生殖系中特異性地促進(jìn)年輕反轉(zhuǎn)座子啟動子的甲基化，這種特殊的活性是小鼠生育所必需的［4］。

DNA甲基化建立和維持過程中DNMTs的參與是必不可少的，也因此成為癌癥治療和抗癌新藥物研發(fā)的重要靶點。多項研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞和組織中DNMT1表達(dá)過量。DNMT1的表達(dá)與前列腺癌前體病變以及預(yù)后復(fù)發(fā)標(biāo)志物GSTP1和APC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，GSTP1和APC在前列腺癌中高度甲基化［9］。這表明DNMT1在前列腺癌進(jìn)展過程中的關(guān)鍵基因甲基化和抑制中起作用。大約25%的人類髓系或淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤包括急性髓細(xì)胞白血病和T細(xì)胞急性淋巴性白血?。?0］，存在DNMT3A突變。Yang L等［11］建立了一個DNMT3A損失模型，發(fā)現(xiàn)DNMT3A 缺失導(dǎo)致 DNA 甲基化降低，主要發(fā)生在小鼠和人類樣本的造血增強(qiáng)子區(qū)域。這些證據(jù)表明 DNMT3A 在血液疾病發(fā)展中起著重要作用。

3 DNA去甲基化與癌癥

“擦除者”是指能夠移除和修改DNA甲基化的酶，是將甲基化胞嘧啶通過不同途徑或方式轉(zhuǎn)化還原成未修飾胞嘧啶的過程。該過程目前存在主動和被動兩種方式。被動去甲基化發(fā)生于DNA復(fù)制過程中，DNMT1功能被阻斷或者活性降低，甲基化維持功能減弱，5mC含量稀釋從而實現(xiàn)DNA被動去甲基化。在DNA復(fù)制過程中，核因子首先粘附半甲基化DNA，阻斷了DNMT1功能，被粘附的DNA不能被完全甲基化，從而導(dǎo)致5mC減少［12］。另一方面，DNMT1及其輔助因子UHRF1組成的復(fù)合物無法識別含有5-羥基甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmc）、5-甲 酰 基 胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）或5-羧基胞嘧啶（5-carboxycytosine，5cac）的半修飾二核苷酸，新合成DNA鏈上的胞嘧啶不能繼續(xù)甲基化，最終導(dǎo)致5mC減少［13］。隨著DNA多次復(fù)制之后5mC的含量逐漸被稀釋降低，實現(xiàn)DNA的被動去甲基化。

主動去甲基化可以發(fā)生在分裂或非分裂細(xì)胞中，需要一系列酶促反應(yīng)例如通過雙加氧酶TETs酶的作用或堿基切除修復(fù)（base excision repair,BER）機(jī)制將已經(jīng)甲基化的胞嘧啶還原成未修飾的胞嘧啶。目前已知兩條DNA主動去甲基化途徑，雙加氧TET-糖苷酶TDG途徑，胞嘧啶核苷脫氨酶AID或胞嘧啶脫氨酶APOBEC脫氨基作用。TET-TDG途徑主要功能酶TET酶雙加氧酶家族，家族成員TET1/2/3都能將5mC轉(zhuǎn)化成5-羥甲基胞嘧啶5hmC。TETs繼續(xù)將5hmC一步步氧化成5-甲酰胞嘧啶5fC和5-羧基胞嘧啶5caC，最后在胸腺嘧啶DNA糖苷酶TDG的作用下堿基切除修復(fù)最終將5mC轉(zhuǎn)化為胞嘧啶［14］。AID/APOBEC作用于氨基，可以將5mC脫氨基轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，經(jīng)過G/T錯配修復(fù)后，誘導(dǎo)堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）通路并在TDG作用下將胸腺嘧啶轉(zhuǎn)化為胞嘧啶?；蛘?mC在TET作用下轉(zhuǎn)化為5hmC后，AID/APOBEC作用于5hmC脫氨基形成5-羥甲基尿嘧啶5hmU［15］，最后在TDG作用下堿基切除修復(fù)，將5hmU轉(zhuǎn)化成胞嘧啶。有研究提出5hmC上沒有AID/ APOBEC脫氨酶的作用靶點，APOBEC不能作用于已經(jīng)被TET氧化修飾的胞嘧啶堿基5hmC、5fC、5caC［16］。5mC可以在兩個位點進(jìn)行化學(xué)修飾：胺基和甲基。5mC的胺基可以通過AID/APOBEC脫胺，將5mC轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。5mC的甲基可以通過Tet酶介導(dǎo)的添加羥基來修飾，生成5hmC。5hmC也可以在兩個位置進(jìn)行化學(xué)修飾：胺基和羥甲基。AID/APOBEC可以脫氨5hmC，產(chǎn)生5hmU。5hmC的另一個化學(xué)途徑是Tet可以進(jìn)一步氧化5hmC形成5fC和5caC。最終，每個途徑的產(chǎn)物-Thy、5hmU、5fC和5caC-被識別并裂解，替換為由TDG或SMUG1介導(dǎo)的裸胞嘧啶。見圖2。

圖2 DNA去甲基化途徑

癌癥發(fā)生的標(biāo)志性事件之一是腫瘤抑制基因啟動子處整體低甲基化和局部高甲基化。DNA甲基化可能會使基因失活,在多種癌細(xì)胞株，包括乳腺癌、鼻咽、食管癌、肺癌、宮頸癌和腎癌，以及淋巴瘤，都顯示出高頻率的TET1啟動子甲基化和沉默。TET1催化結(jié)構(gòu)域的異位表達(dá)重新激活了沉默的腫瘤抑制基因（DLit2，ZNF382，HOXA9和DKK1），并顯著抑制了癌細(xì)胞的增殖［17］。另一項報道支持TET抑制腫瘤作用的研究是通過抑制α酮戊二酸脫氫酶增加氧化反應(yīng)中TET酶的輔助因子-酮戊二酸水平，在該研究中，α酮戊二酸增加了體內(nèi)高侵襲性轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型和細(xì)胞系中TET的活性，下游抗轉(zhuǎn)移微RNA（mir-200）家族表達(dá)的增加。而mir-200的升高導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺轉(zhuǎn)移下調(diào)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移從而達(dá)到抑癌作用［18］。這些發(fā)現(xiàn)佐證了TET1的腫瘤抑制作用。同時也有多方面的研究報道過TET 的致癌活性，包括TET1的表達(dá)促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，激活TNBC 中的 PI3K 致癌信號，影響卵巢上皮癌和三陰性乳腺癌中的細(xì)胞遷移、腫瘤干細(xì)胞致瘤性等［19］。TETs調(diào)控基因表達(dá)是多途徑多層次的，TETs是腫瘤抑制因子還是致癌基因取決于細(xì)胞環(huán)境、調(diào)節(jié)模式、不同的相互作用伙伴以及上游和下游信號通路。

4 DNA甲基化的識別與癌癥

“讀取器”是指能夠識別DNA甲基化的酶，主要有3個蛋白家族：MBD蛋白家族，UHRF蛋白，鋅指蛋白家族。MBD蛋白家族包括第一個確定的甲基結(jié)合蛋白MeCP2以及MBD1，MBD2，MBD3和MBD4［20］。家族成員都包含一個甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)我换蚨鄠€對稱甲基化CpG位點具有更高的親和力［21］。MeCP2含有一個轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域TRD，通過TRD與Dnmt1結(jié)合，并將Dnmt1招募到半甲基化DNA中進(jìn)行維持性甲基化［22］。MeCP2、MBD1、MBD2大部分是與組蛋白去乙酰化酶復(fù)合物相互作用從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄抑制的功能［23］。MBD3由于MBD結(jié)構(gòu)域的突變而不能直接與DNA結(jié)合［20］。MBD4正常情況下能夠與DNA結(jié)合，但它結(jié)構(gòu)域上含有T-G錯配糖苷酶，優(yōu)先識別鳥嘌呤與尿嘧啶、胸腺嘧啶或5-氟尿嘧啶的錯配，并結(jié)合參與錯配修復(fù)的蛋白質(zhì)［24］。UHRF家族包括UHRF1和UHRF2，UHRF蛋白家族除了結(jié)合DNA而抑制轉(zhuǎn)錄以外，更重要的是，它們可以與DNMT1結(jié)合并靶向半甲基化的DNA鏈，尤其是在DNA的復(fù)制過程中起著維持DNA甲基化的作用［25］。最后是鋅指蛋白，包括Kaiso，ZBTB4和ZBTB38。Kaiso用3個鋅指基序來結(jié)合兩個連續(xù)甲基化的CpG，而ZBTB4和ZBTB38則可以結(jié)合單個甲基化的CpG位點［26］。與MDB蛋白家族類似，鋅指蛋白也可以抑制轉(zhuǎn)錄。比如，在人和老鼠的結(jié)腸癌中，Kaiso就是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，它與甲基化的CpG簇結(jié)合并抑制甲基化的抑癌基因的表達(dá)［27］。

5 中藥的抗腫瘤與去甲基化作用

以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)的中藥因其療效好且無嚴(yán)重副作用的優(yōu)點越來越多地被應(yīng)用于腫瘤治療中，作為輔助或者替代療法，有效地提高了患者生存率，改善了患者的生活質(zhì)量［28-29］。許多中藥植物化學(xué)物質(zhì)參與5-hmC 的形成和失活的DNA甲基化過程。廣泛存在于水果蔬菜等各種植物中的維生素C已被證明參與DNA羥甲基化過程，發(fā)揮抗腫瘤作用［30］。因此，推測中藥在癌癥治療中的一個重要功能是調(diào)控TET依賴的DNA去甲基化。逆轉(zhuǎn)腫瘤相關(guān)基因異常高甲基化，去甲基化恢復(fù)腫瘤抑制基因的表達(dá)成為抗腫瘤研究和新藥開發(fā)的熱點。迄今為止，中藥與 DNA 去甲基化關(guān)系的研究還很有限。

在一項關(guān)于乳腺癌的研究中，經(jīng)薯蕷皂苷處理后的乳腺癌細(xì)胞TET2和TET3表達(dá)上調(diào)，TET1表達(dá)下調(diào)，并且對細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移有抑制作用［31］。天花粉為清熱瀉火類藥物,主要用于治療熱病口渴、黃疸、肺燥咳血、癰腫等，近年來發(fā)現(xiàn)它的有效成分天花粉蛋白對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的脾酪氨酸激酶基因有明顯的去甲基化作用［32］，對人宮頸癌細(xì)胞HeLa和Caski的APC基因也有去甲基化作用［33］。丹參具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等活性,在臨床上用于治療心腦血管疾病、癌癥以及各種炎癥，丹參酮ⅡA可通過下調(diào)肝癌細(xì)胞DNMT1，DNMT3a，DNMT3b的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化狀態(tài)，其抑制肝癌細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與激活NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)Nrf2基因CpG島的去甲基化有關(guān)［34］。葡萄科、豆科、百合科、桃金娘科、蓼科等多種植物中的白藜蘆醇上調(diào)前列腺癌細(xì)胞LNCap、PC3和DU145中5hmC和TET1水平，下調(diào)5mC水平從而去甲基化TIMP2、TIMP3［35］基因，抑制腫瘤的遷移和侵襲。黃連中的小檗堿通過抑制DNMT1和DNMT3B表達(dá)逆轉(zhuǎn)甲基化基因TP53的甲基化狀態(tài)并增加表達(dá)，誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266凋亡［36］。另一項研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能增加tet3的表達(dá)并去甲基化mir-145，mir-145靶向HK2并抑制它的表達(dá)，從而拮抗卵巢癌細(xì)胞的瓦爾堡效應(yīng)［37］。當(dāng)歸主要功效是補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸主要活性成分Z-蒿本內(nèi)酯能使前列腺腫瘤中Nrf2啟動子CpG島去甲基化,從而再激活Nrf2基因和Nrf2目的基因表達(dá)［38］。當(dāng)歸對肝癌細(xì)胞、白血病KG-1細(xì)胞系等癌細(xì)胞都有抑制增殖活性的作用［39-40］，但是否跟去甲基化有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

6 結(jié)語

中藥作為DNA去甲基化藥物治療腫瘤優(yōu)勢巨大，同時也有很多難點。中藥成分復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞不容易對中藥產(chǎn)生耐藥性，同時也很難確定其抗腫瘤有效成分，從而限制了中藥在臨床抗腫瘤治療中的應(yīng)用。中藥去甲基化的研究大部分是單一的化學(xué)成分，有關(guān)中藥復(fù)方的DNA去甲基化研究鮮有報道。中藥與DNA去甲基化關(guān)系的研究還很有限，主要是單一成分對腫瘤某一高甲基化抑癌基因，去甲基化重新激活該基因，從而達(dá)到抑癌作用或者干預(yù)DNA轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)從而調(diào)控基因甲基化狀態(tài)。

癌癥是一類極其復(fù)雜的疑難雜癥，中藥作為DNA去甲基化藥物，應(yīng)進(jìn)一步研究中藥復(fù)方的抗腫瘤活性成分及活性組群，篩選出具有去甲基化作用的靶向成分，闡明其作用機(jī)制，提高其生物學(xué)效應(yīng)，擴(kuò)大其在臨床抗腫瘤治療中的應(yīng)用。