超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜快速檢查橘紅顆粒（膠囊、片）中水麥冬酸

★ 鄧茂芝 洪燕 周云峰 吳喆 鄧杰華 黃炳泉（.宜春市檢驗(yàn)檢測(cè)中心 江西 宜春336000；.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 南昌 33009）

橘紅顆粒（膠囊、片）是由化橘紅、陳皮、法半夏等藥味制成的復(fù)方制劑，具有化痰止咳、清肺的功效，收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部［1］。橘紅顆粒方中的法半夏為天南星科植物半夏塊莖的炮制加工品，具有燥濕化痰的療效［2-3］。近年來(lái)，隨著半夏野生資源減少、需求量增大、人工栽培技術(shù)滯后等問(wèn)題日益凸顯［4］，正品半夏的供給越來(lái)越難以滿足市場(chǎng)的需要，以致出現(xiàn)半夏同屬或同科偽品混用、冒充現(xiàn)象［5-8］。雖然已有快速檢查半夏藥材和虎掌南星藥材中水麥冬酸的方法報(bào)道［9］，但是該方法僅針對(duì)半夏原藥材是否摻偽品進(jìn)行鑒別檢查?；⒄颇闲菫樘炷闲强浦参锘⒄频母稍飰K莖［10］，外觀與半夏類似，常規(guī)性狀鑒別難以分辨，易帶入以半夏為原料的中藥復(fù)方制劑中，給該類制劑的安全有效用藥帶來(lái)隱患。目前，橘紅顆粒（膠囊、片）的質(zhì)量研究主要集中在有效成分柚皮苷的鑒別或含量測(cè)定方面［11-12］，而中藥成方制劑中開(kāi)展半夏真實(shí)性的檢查尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以虎掌南星的特征性成分水麥冬酸為定性指標(biāo)，采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLCMS/MS）建立橘紅顆粒（膠囊、片）中水麥冬酸快速檢查方法，篩查制劑是否存在以虎掌南星代替投料的行為。該方法的建立為控制制劑中半夏原料的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)，更是為提高橘紅顆粒（膠囊、片）的藥品質(zhì)量提供監(jiān)管手段。

1 儀器與試藥

H-class/xevo超高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)waters公司）；KH-250DB超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

水麥冬酸（批號(hào)：112042-202002，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；法半夏對(duì)照藥材（批號(hào)：DSTYF000101）、虎掌南星對(duì)照藥材（批號(hào)：DST210910-109）均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；橘紅制劑樣品32批次，其中橘紅顆粒26批（樣品序號(hào)1～26），橘紅膠囊3批（樣品序號(hào)27～29），其余為橘紅片，樣品信息見(jiàn)表1；缺法半夏的橘紅顆粒陰性樣品、含虎掌南星的橘紅顆粒陽(yáng)性樣品由江西海爾思藥業(yè)股份有限公司提供。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器檢測(cè)條件

色 譜 柱：Waters ACQUITY UPLC?CSHTMC18柱（1.7 μm× 2.1 mm×100 mm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.03%氨水溶液，梯度 洗脫：0～2 min 5%A～5%A，2～2.5 min 5%A～75%A，2.5～4 min 75%A～75%A，4～5 min 75%A～5%A，5～8 min 5%A～5%A；流速：0.2 mL/min。質(zhì)譜掃描模式：ESI+；數(shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；水麥冬酸的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 206→125和m/z 206→171。

2.2 溶液的配制

水麥冬酸對(duì)照品溶液：取水麥冬酸對(duì)照品適量，加20%甲醇溶液制成1 mL約含300 ng的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取本品約2 g，置100 mL量瓶中，加入20%甲醇溶液約80 mL，超聲30 min，放冷至室溫，加20%甲醇溶液至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液：稱取不含法半夏的橘紅顆粒樣品約2 g，按供試品溶液的處理方法制備陰性樣品溶液。

陽(yáng)性樣品溶液：稱取含虎掌南星的橘紅顆粒樣品約2 g，按供試品溶液的處理方法制備陽(yáng)性樣品溶液。

對(duì)照藥材溶液：稱取半夏、法半夏和虎掌南星對(duì)照藥材各約0.1 g（按處方量換算），按供試品溶液的處理方法制備對(duì)照藥材溶液。

2.3 專屬性

將“2.2”項(xiàng)下配制的各種溶液依照“2.1”項(xiàng)的條件依次進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，虎掌南星對(duì)照藥材溶液、陽(yáng)性樣品溶液均出現(xiàn)與水麥冬酸對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，而法半夏對(duì)照藥材和陰性樣品均無(wú)與水麥冬酸對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，說(shuō)明橘紅顆粒中法半夏和其他藥味對(duì)虎掌南星的水麥冬酸的測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 MRM監(jiān)測(cè)圖

2.4 檢測(cè)限

取水麥冬酸對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋成一系列溶液依次測(cè)定。以信噪比S/N約為3對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，最低檢出濃度為6.6 μg/L。

2.5 精密度

取“2.2”項(xiàng)配制的水麥冬酸對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄水麥冬酸離子對(duì)m/z 206→171的峰面積，水麥冬酸峰面積的RSD為3.46%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性

平行取陽(yáng)性樣品6份，按制備供試品溶液方法處理，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，含量RSD為4.11%，表明重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性

取一份重復(fù)性項(xiàng)下的陽(yáng)性樣品溶液，分別在0、1、2、4、8 h記錄峰面積，比較峰面積的波動(dòng)性，峰面積RSD為3.87%，提示在8 h內(nèi)樣品溶液較穩(wěn)定。

2.8 樣品測(cè)定

對(duì)收集的32批橘紅顆粒（膠囊、片）樣品依次測(cè)定，均未檢出水麥冬酸成分。對(duì)于保留時(shí)間與對(duì)照品一致的樣品，在與對(duì)照品濃度相近時(shí)，比較離子豐度比（K）是否與對(duì)照品溶液相一致，如不一致，可確定未檢出，判斷依據(jù)見(jiàn)表2。

表2 離子豐度比允許偏差

3 討論

敬勇等［13］采用高效液相色譜法對(duì)半夏中的虎掌南星偽品進(jìn)行了檢查分析，本研究初期借鑒了該法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行定性檢測(cè)，但發(fā)現(xiàn)要達(dá)到原藥材的取樣量，按處方量需稱取橘紅顆粒樣品18 g左右，且考慮到該法樣品前處理較復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、雜質(zhì)峰干擾較多，最后采用樣品需求量少、靈敏度高、分析速度快的UPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，可有效檢出陽(yáng)性樣品中的水麥冬酸。

為使水麥冬酸的質(zhì)譜響應(yīng)達(dá)到最佳水平，需探索優(yōu)化液相和質(zhì)譜條件。通過(guò)考察乙腈-0.1%甲酸、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）、乙腈-0.03%氨水溶液4個(gè)流動(dòng)相體系和質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式、掃描模式，最終選擇乙腈-0.03%氨水溶液流動(dòng)相體系、MRM監(jiān)測(cè)和正離子掃描。水麥冬酸的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 206→125和m/z 206→171，其裂解規(guī)律為在正離子模式下水麥冬酸的母離子206［M+H+NH3］+失去一分子NH3和一分子H2O后成子離子171［M+H+NH3-NH3-H2O］+，該子離子進(jìn)一步失去一分子CH3CH2OH裂解成子離子125［M+H+NH3-NH3-H2O-CH3CH2OH］+。

水麥冬酸的極性較強(qiáng)，在反相色譜系統(tǒng)中保留時(shí)間較短，在對(duì)方法的耐用性考察時(shí)發(fā)現(xiàn)不同型號(hào)的C18柱、柱溫、流速等對(duì)水麥冬酸的峰形和測(cè)定結(jié)果幾無(wú)影響，只會(huì)稍微影響其出峰時(shí)間。從樣品測(cè)定結(jié)果可知，市售樣品未含有水麥冬酸而陽(yáng)性樣品可檢出，說(shuō)明所建方法可有效甄別橘紅顆粒（膠囊、片）中虎掌南星冒充法半夏投料的行為，但對(duì)于可檢出的最低摻入量沒(méi)有進(jìn)行研究，此項(xiàng)工作將進(jìn)一步深入展開(kāi)。

總之，所建方法快速、準(zhǔn)確，能在一定程度上獲悉橘紅顆粒（膠囊、片）中法半夏的投料情況，并作為橘紅顆粒（膠囊、片）中法半夏藥味的質(zhì)量控制方法。