液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋粉中 喹諾酮類藥物殘留

◎ 張 威，胡婷婷，秦培余，姜 珊，陳 露，劉晨曦，劉婉秋

（吉林省遼源市食品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，吉林 遼源 136200）

隨著時(shí)代的發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)食品的要求已不再局限于簡(jiǎn)單的維持生命和果腹，對(duì)食品的安全、營養(yǎng)和滋味提出了更高的要求[1]。隨著人們生活節(jié)奏的加快，方便、營養(yǎng)、快捷的食品更加受到人們的追捧。而雞蛋粉的出現(xiàn)正好滿足了人們的這一需求。

現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)雞蛋粉中獸藥殘留檢測(cè)方法作出具體的要求。因檢測(cè)方法的不足，不合格的雞蛋粉產(chǎn)品在市場(chǎng)中大肆流通。液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法可根據(jù)被測(cè)物（雞蛋粉）的特征離子、保留時(shí)間等結(jié)構(gòu)信息，以較高的靈敏度和選擇性，準(zhǔn)確判定待測(cè)物是否為陽性，避免了假陽性樣品的檢出[2]。該方法的確立從傳播途徑上減少了殘留現(xiàn)象，彌補(bǔ)了我國在雞蛋粉中喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)方法的空缺，為市場(chǎng)監(jiān)督執(zhí)法部門對(duì)市售及出口雞蛋粉的監(jiān)督管理提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)保障，規(guī)范了養(yǎng)殖戶的行為，對(duì)于從源頭上控制抗生素的使用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）（美國AB SCIEX公司）；天平：感量為0.01 g（YP202N）和0.000 1 g（BSA124S-CW）；高速大容量冷凍離心機(jī)：6 000 r·min-1（TG20KR-D）；渦旋混合器（QL-8665，6）；氮吹儀（TTL-DCII）。

1.2 材料與試劑

喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（濃度：100 mg·L-1，體積：1 mL，編號(hào)：IST47508-100M），包括恩諾沙星（CAS號(hào)：93106-60-6）、環(huán)丙沙星（CAS號(hào)：85721-33-1）、諾氟沙星（CAS號(hào)：70458-96-7）、培氟沙星（CAS號(hào)：6159-55-3）、沙拉沙星（CAS號(hào)：98105-99-8）、洛美沙星（CAS號(hào)：98079-51-7）、依諾沙星（CAS號(hào)：74011-58-8）和氧氟沙星（CAS號(hào)：82419-36-1）；甲酸（安譜，CAS：64-18-6）；乙腈（色譜純fisher）；凈化管（Wondapak QuEChERS P/N5010-015204）；色譜柱（島津Shim-pack GIST C18100 mm×2.1 mm，2 μm P/N227-30001-04）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

（1）提取。稱取2 g（精確至0.01 g）雞蛋粉樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 2%甲酸乙腈渦旋30 s，超聲提取10 min后，于6 000 r·min-1離心10 min，上清液待凈化。

（2）凈化。取上清液2 mL于QuEChERS SPE凈化管中，渦旋30 s，于6 000 r·min-1離心5 min，取上清液1 mL，于40 ℃水浴氮?dú)獯抵两?，加? mL 0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液（9+1）定容，超聲波振蕩5 min，過0.2 μm微孔濾膜，供HPLC-MS/MS測(cè)定。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確量取8種喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品1 mL，用乙腈溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋成濃度為1.0 μg·L-1、 5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、25.0 μg·L-1、 50.0 μg·L-1和100.0 μg·L-1的8種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 色譜條件

流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫條件參見表1；流速：0.1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃。

表1 梯度洗脫條件表

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓：5.5 kV；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力（CUR）：10 psi；霧化氣壓力：50 psi；輔助氣壓力：50 psi；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能量見表2。

表2 8種喹諾酮類藥物定性離子、定量離子、去簇電壓、碰撞能量、保留時(shí)間表

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑優(yōu)化

分別使用0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、2.0%甲酸乙腈、5.0%甲酸乙腈以及0.5%甲酸甲醇、1.0%甲酸甲醇、5.0%甲酸甲醇和10.0%甲酸甲醇作為提取溶液對(duì)雞蛋粉中的8種喹諾酮進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)8種喹諾酮藥物不溶或者微溶于甲醇，而蛋白質(zhì)在甲醇中的溶解性較強(qiáng)，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，提取效果不明顯，回收率較低。乙腈能使蛋白質(zhì)變性[3]，有利于目標(biāo)化合物的提取，加入一定濃度的酸化乙腈溶液可以有效提取目標(biāo)化合物，同時(shí)沉淀蛋白[4]，大大提高提取率。但酸的濃度過高，也會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。因此，比較了響應(yīng)值的強(qiáng)度及回收率，最終確定提取溶液的濃度為2.0%甲酸乙腈。不同濃度甲酸乙腈提取液提取效果見圖1。

圖1 不同濃度甲酸乙腈提取液提取效果圖

2.1.2 凈化裝置的優(yōu)化

固相萃取是常用的獸藥殘留檢測(cè)的有效方法[5]。有研究表明，酸化乙腈的提取液未凈化會(huì)導(dǎo)致較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)[6-7]，而EDTA-Mcllvaine緩沖液由于提取液混濁而導(dǎo)致固相萃取柱堵塞[8]，從而使回收率大大降低。考慮雞蛋粉是粉狀物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量較高，QuEChERS SPE凈化管可完全避免堵柱現(xiàn)象的發(fā)生，本次試驗(yàn)選用QuEChERS SPE凈化管，減少了洗滌溶劑的時(shí)間，提高了凈化效果。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

8種喹諾酮化合物的極性相似，因此梯度較大的流動(dòng)相比例不利于化合物在色譜柱中的分離，比較了近60種不同梯度的流動(dòng)相，結(jié)合響應(yīng)值的強(qiáng)度，回收率、保留時(shí)間等因素，最終確定流動(dòng)相中的有機(jī)相為0.1%甲酸乙腈溶液，無機(jī)相為0.1%甲酸水溶液。洗脫條件如表1所示。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將8種喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用乙腈稀釋至濃度0.2 mg·kg-1，以20.0 μL·min-1的流速注入質(zhì)譜儀，在ESI+模式下進(jìn)行Q1掃描，確定母離子。再進(jìn)行MS2掃描，依據(jù)不同的碰撞能量和去簇電壓，選擇響應(yīng)值最強(qiáng)的兩對(duì)離子作為子離子，最后確定8種喹諾酮化合物的MRM條件，見表2。

2.4 線性關(guān)系、方法檢出限、回收率

將8種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照上述色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定，外標(biāo)法定量。得到8種喹諾酮化合物的線性關(guān)系均大于0.999，線性關(guān)系良好。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S/N≥3所對(duì)應(yīng)的濃度作為本方法的檢出限，8種喹諾酮的方法檢出限均為 1.0 μg·kg-1。8種喹諾酮化合物的線性關(guān)系見表3。

表3 8種喹諾酮類化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)表

在空白雞蛋粉中添加0.01 mg·kg-1，0.02 mg·kg-1， 0.10 mg·kg-13個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)試6次?；厥章试?3.2%～102.0%，RSD小于23%，滿足獸藥殘留檢測(cè)的要求（見表4）。

表4 8種喹諾酮化合物在雞蛋粉中不同添加濃度回收率、RSD表（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了雞蛋粉中8種喹諾酮類藥物殘留的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)投入較低，可以滿足企事業(yè)等檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)獸藥殘留檢測(cè)的需要。