陸艷艷 沈剛 王劍波 朱宏偉 趙軍寧? 郝俊杰 何世堂?
(1 中國(guó)科學(xué)院聲學(xué)研究所北京 100190)
(2 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院成都 610041)
麝香是一味沿用至今的稀貴中藥材,為鹿科馬麝、林麝或原麝雄體香囊中的干燥分泌物。麝香含有大環(huán)化合物如麝香酮、甾族化合物(雌二醇、膽甾醇)等。麝香酮是麝香的主要有效成分之一,具有開(kāi)竅醒神、活血通經(jīng)、消腫止痛等功效,且具有雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、強(qiáng)心、抑制腫瘤細(xì)胞,對(duì)缺血性心臟障礙有預(yù)防和治療的作用[1-2]。
麝香中麝香酮常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜法(Gas chromatography,GC)、紫外-可見(jiàn)分光光度法(Ultraviolet and visible spectrophotometry,UV)等[3-4],然而這些方法的檢測(cè)儀器體積過(guò)于龐大,且分析時(shí)間較長(zhǎng),一般需要30 min以上,只適用于實(shí)驗(yàn)室分析,無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快檢(Point-of-care testing,POCT)需求。
聲表面波(Surface acoustic wave,SAW)傳感器作為一種聲-電換能器,能夠在很小的叉指換能器中實(shí)現(xiàn)。傳感器由兩個(gè)基本相同的SAW器件與對(duì)應(yīng)的振蕩電路構(gòu)成。一路振蕩器與氣相色譜結(jié)合,使用精密溫控來(lái)吸附待測(cè)氣體,作為測(cè)試回路;另一路振蕩器則作為參考基準(zhǔn),計(jì)算差頻后可最大程度上消除外圍環(huán)境如振動(dòng)、溫度等對(duì)于振蕩器頻率穩(wěn)定性的影響。聲表面波傳感器面積僅12 mm2,因此檢測(cè)器體積相對(duì)較小[5-6]。
本實(shí)驗(yàn)使用中國(guó)科學(xué)院聲學(xué)研究所與四川省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合研制的氣相色譜-聲表面波(GCSAW)聯(lián)用技術(shù)對(duì)麝香進(jìn)行快速檢測(cè),其具體的原理框圖見(jiàn)圖1[5]。在采集階段,麝香樣品通過(guò)采樣泵進(jìn)入預(yù)濃縮管,在預(yù)濃縮管麝香樣品揮發(fā)性成分被吸收;在進(jìn)樣分析階段,切換六通閥,載氣瓶中的氮?dú)獍杨A(yù)濃縮管(溫度升高至250°C)中采集到的樣品帶入色譜柱?;衔镞M(jìn)入色譜柱,色譜柱只有1 m長(zhǎng),采用柱上升溫系統(tǒng),使得色譜柱升溫速率較快,達(dá)到10°C/s。不同化合物在色譜柱分離效果會(huì)不一樣,其到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間也會(huì)不同,根據(jù)化合物出峰時(shí)間進(jìn)行定性分析;不同質(zhì)量的化合物會(huì)引起檢測(cè)器頻率發(fā)生改變,根據(jù)檢測(cè)器頻率的變化量可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。
圖1 聲表面波氣相色譜儀原理框圖[5]Fig.1 Principle block diagram of SAW gas chromatograph[5]
利用GC-SAW聯(lián)用技術(shù)對(duì)麝香易揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量分析,具有分析操作簡(jiǎn)便、體積小、分析速度快等特點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)化合物的廣譜(揮發(fā)和半揮發(fā)性有機(jī)物)、高靈敏度(10-12級(jí))、快速(<5 min)分析[5],適合于現(xiàn)場(chǎng)分析。目前GC-SAW在水質(zhì)監(jiān)測(cè)、環(huán)境、精油等方面體現(xiàn)了較好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[7-9],但在中藥麝香酮含量的檢測(cè)還未涉及。本文研究了GC-SAW在中藥麝香檢測(cè)中的方法學(xué)應(yīng)用,為中藥麝香中麝香酮的現(xiàn)場(chǎng)快速定量分析提供一種新的快捷的檢測(cè)技術(shù)。
聲表面波氣相色譜儀:中國(guó)科學(xué)院聲學(xué)研究所(諧振型聲表面波傳感器,基頻500 MHz;色譜柱DB-5(1 m×0.18 mm×0.25 μm))。恒溫加熱器:廈門(mén)宇電科技有限公司。
高純氮?dú)?99.999%):北京兆格氣體科技有限公司。乙醇(≥99.5%):TEDIA。麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/mL),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。S1-S16麝香樣品:由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院方清茂研究員鑒定為中藥麝香正品。
1.2.1 麝香酮標(biāo)準(zhǔn)品的配制
標(biāo)準(zhǔn)品配制:取質(zhì)量濃度為100 mg/mL的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過(guò)逐級(jí)稀釋,分別配制含量為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL和3.2 μg/mL的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.2.2 樣品的前處理
樣品前處理:取干燥的麝香樣品20 mg放入試劑瓶中,加入5 mL無(wú)水乙醇,超聲30 min后,使用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,得到濾液,取20 μL于2 mL無(wú)水乙醇中,得到待測(cè)樣品。
色譜條件:DB-5色譜柱,初始溫度45°C,按10°C/s程序升溫至180°C。進(jìn)樣口溫度為200°C;檢測(cè)器溫度為40°C;六通閥溫度為160°C;載氣為99.999%純度的氮?dú)猓? mL/min;泵吸時(shí)間為10 s;分析時(shí)間為20 s[10-11]。1.6 μg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣0.1 μL,如圖2所示,麝香酮保留時(shí)間為6.62 s,峰形較好,在20 s時(shí)間內(nèi)可達(dá)到良好的分離效果。
圖2 1.6 μg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試色譜圖Fig.2 Test chromatogram of 1.6 μg/mL muscone standard solution
取含量為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL和10 μg/mL的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,在2.1節(jié)的色譜條件下分別測(cè)試3次,以麝香酮的質(zhì)量濃度對(duì)其響應(yīng)值(峰面積)均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸曲線方程為y=1830.3x+364.88,相關(guān)系數(shù)R=0.9976,在0.2~10 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖3)。
圖3 GC-SAW中不同質(zhì)量濃度麝香酮的響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig.3 Response standard curves of musk with different concentrations in GC-SAW(n=3)
依據(jù)校準(zhǔn)曲線的偏差和斜率方法計(jì)算麝香酮檢測(cè)限和定量限,根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)曲線已知質(zhì)量濃度的響應(yīng)值,使用Excel中的Linest函數(shù)和檢出限公式如下:檢測(cè)限D(zhuǎn)L=3.3σ/S;定量限QL=10σ/S,其中,σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差;S為斜率。計(jì)算得到麝香酮檢出限為0.158 μg/mL,進(jìn)樣量為0.1 μL,即檢出限絕對(duì)質(zhì)量為15.8 pg。計(jì)算麝香酮定量限為0.478 μg/mL,進(jìn)樣量為0.1 μL,即定量限絕對(duì)質(zhì)量為47.8 pg。
對(duì)0.2 μg/mL、0.8 μg/mL、3.2 μg/mL三種質(zhì)量濃度的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)測(cè)定6次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)分別為3.24%、3.09%和2.89%(見(jiàn)表1)。測(cè)試結(jié)果表明該方法的精密度良好。
表1 不同質(zhì)量濃度麝香酮標(biāo)液精密度測(cè)試數(shù)據(jù)(n=6)Table 1 Precision test data of different concentrations of muscone standard solution(n=6)
取配制好的質(zhì)量濃度為0.8 μg/mL和3.2 μg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各6瓶,每瓶測(cè)定3次取平均值,計(jì)算組間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值,測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。測(cè)試麝香酮重復(fù)性RSD值為4.23%以內(nèi),表明該方法的重復(fù)性較好。
表2 麝香酮溶液重復(fù)性測(cè)試數(shù)據(jù)(n=3)Table 2 Repeatability test data of muscone solution(n=3)
取配制好的質(zhì)量濃度為0.8 μg/mL的麝香酮溶液,放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后分別測(cè)定其響應(yīng),每瓶測(cè)定3次取平均值,表3結(jié)果顯示,其RSD值為4.49%以內(nèi),表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
表3 麝香酮甲液穩(wěn)定性測(cè)試數(shù)據(jù)(n=3)Table 3 Stability test data of muscone solution(n=3)
1號(hào)干燥麝香樣品取6份,每份約10 mg,分別置于試劑瓶中,各加入100 mg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液3.5 μL,再加入無(wú)水乙醇5 mL,超聲30 min后,使用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,得到濾液,取20 μL混入2 mL無(wú)水乙醇中,得到待測(cè)樣品。進(jìn)樣0.1 μL測(cè)試,每瓶測(cè)定3次,取平均值計(jì)算回收率,結(jié)果如表4所示,平均回收率為98.64%,RSD為4.53 %。
表4 不同質(zhì)量濃度麝香酮標(biāo)液加樣回收率測(cè)試數(shù)據(jù)Table 4 Recovery rate test data of muscone standard solution with different concentrations
根據(jù)2.1節(jié)的測(cè)試條件,測(cè)試16組不同產(chǎn)地、不同年齡段和不同品種的麝香樣品,每組測(cè)試3次,1號(hào)麝香樣品測(cè)試結(jié)果如圖4所示,16組麝香樣品中麝香酮的含量如表5所示。
表5 16組樣品中麝香酮含量測(cè)試結(jié)果(n=3)Table 5 Test results of muscone content in 16 groups samples(n=3)
圖4 1號(hào)麝香樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of No.1 musk sample
測(cè)試16組不同產(chǎn)地、不同品種、不同年齡段的麝香樣品,其麝香酮含量在2.10%~3.84%范圍內(nèi),含量均高于藥典要求的2%。從測(cè)試結(jié)果分析,不同產(chǎn)地、不同品種、不同年齡段的麝香酮含量差異較大。四川圭興林麝中麝香酮含量最高,且三年生林麝麝香酮含量高于一年生林麝,一年生林麝麝香酮含量為3.45%,三年生麝香酮含量為3.84%。陜西鳳縣一年生林麝的麝香酮含量最低,為2.10%。三年生的林麝和馬麝中麝香酮含量均大于一年生,說(shuō)明麝香生長(zhǎng)年份越長(zhǎng),麝香酮含量越高。不同產(chǎn)地、不同年齡段的馬麝和林麝麝香酮含量差異不明顯。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GC-SAW聯(lián)用技術(shù)對(duì)麝香中主要成分麝香酮探索性地進(jìn)行檢測(cè),采用柱上升溫系統(tǒng),7 s內(nèi)可檢出麝香酮。使用GC-SAW聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)麝香酮定性、定量檢測(cè),且具有較好的響應(yīng)特性、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。本文通過(guò)液體進(jìn)樣對(duì)麝香酮進(jìn)行定量分析,定量測(cè)定在0.2~10 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性,麝香酮的最低檢出限為15.8 pg。測(cè)試16組麝香樣品,麝香酮含量最高的為四川圭興林麝,含量最低的為陜西鳳縣林麝,三年生的麝香酮含量均大于一年生,與中草藥報(bào)道的爵香產(chǎn)量從麝一歲到三歲半呈遞增速度相符合[12-13]。麝香酮作為麝香質(zhì)量的控制指標(biāo)之一,采用GC-SAW對(duì)麝香中主要成分麝香酮進(jìn)行定量分析,可用于指導(dǎo)中藥麝香質(zhì)量評(píng)價(jià)。
本文分析GC-SAW在檢測(cè)麝香酮定量分析的潛在應(yīng)用,為中藥麝香現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)快檢提供一種新的分析技術(shù)。在此研究的基礎(chǔ)上與中國(guó)藥典方法進(jìn)行比較,中國(guó)藥典中使用傳統(tǒng)氣相色譜法測(cè)試麝香酮含量,測(cè)試一個(gè)樣品需要30 min以上,取樣量需要為200 mg,而GC-SAW分析方法可在幾十秒內(nèi)可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè),取樣量只需要20 mg,在皮克級(jí)、納克級(jí)顯示出良好的靈敏度。因此,GC-SAW新方法有望作為分析中藥麝香的替代分析技術(shù),提供簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度的分析方法。