硝化/脲酶抑制劑對(duì)設(shè)施菜地土壤菌群和氮素轉(zhuǎn)化影響的研究進(jìn)展

李魯震， 趙長盛*， 陳慶鋒，2， 劉 婷， 李 磊， 郭貝貝

(1．齊魯工業(yè)大學(xué)/山東省科學(xué)院 山東省分析測(cè)試中心， 山東 濟(jì)南 250014； 2．山東師范大學(xué) 地理與環(huán)境學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300)

0 引言

我國是蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)大國，設(shè)施蔬菜種植面積約410萬hm2，并且設(shè)施菜地規(guī)模逐年擴(kuò)大[1]。在我國設(shè)施菜地中，為保證設(shè)施蔬菜的高產(chǎn)量和滿足作物對(duì)氮素的大量需求，大量施加氮肥。據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)施菜地每年施加氮肥高達(dá)1 500 kg/hm2，是農(nóng)田作物的4～6倍[2]，但平均氮肥利用率低于20%[3]。然而，氮肥的科學(xué)施用是使農(nóng)作物增產(chǎn)的前提，科學(xué)的氮肥用量約為522 kg/hm2，若氮肥施用過度，易造成土壤硬度增加，降低作物產(chǎn)量，嚴(yán)重降低氮素利用率。氮肥的高施加量和低利用率導(dǎo)致過量氮素在土壤中積累，通過硝態(tài)氮淋溶、N2O和NH3的排放等多種途徑釋放到水體或大氣中，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境問題[4-5]。

土壤礦化、硝化和反硝化作用主要是由微生物主導(dǎo)[6]，作用于氮素轉(zhuǎn)化過程，影響氮素在土壤中的遷移與轉(zhuǎn)化，微生物在土壤環(huán)境中的作用不言而喻[7]。設(shè)施菜地土壤中微生物的結(jié)構(gòu)和豐度根據(jù)種植方式、時(shí)空變化及氮肥施用量等因素變化。氮肥的高施加量顯著降低土壤中菌群的功能多樣性，在氮素轉(zhuǎn)化過程中主要受AOA、AOB和nirk反硝化細(xì)菌等功能菌群的作用[8]。有機(jī)肥的施加為土壤微生物活動(dòng)提供營養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)其活性，但引進(jìn)外來微生物和酶類。

由于土壤中微生物的活動(dòng)、礦化、硝化和反硝化作用，引起了N2O排放及NO3--N淋溶[9]。在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，氮素以NO3--N形式的損失量高達(dá)13 Tg/yr，N2O的釋放量約為4.1 Tg/(N·yr)[10-11]，而設(shè)施菜地系統(tǒng)中的N2O排放和NO3--N淋溶量通常高于附近或其他大田作物[12-13]。馬林等[14]研究表明，設(shè)施菜地種植模式下，氮素淋失強(qiáng)度為117.5 kg/(N·hm2)，遠(yuǎn)高于露天蔬菜、小麥-玉米輪作和春玉米3種種植模式。N2O是重要的溫室氣體，NH3雖不是溫室氣體，但促進(jìn)N2O產(chǎn)生[15]。在整個(gè)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，設(shè)施菜地系統(tǒng)與其他系統(tǒng)相比，由于環(huán)境封閉、施肥量大、灌溉頻繁且相對(duì)較高的土壤溫度和含水率等特點(diǎn)，氮素淋溶的風(fēng)險(xiǎn)性最高[16-17]。

雖然研究者已進(jìn)行一些實(shí)地研究，量化設(shè)施菜地的N2O排放或NO3--N淋失[18]，但由于氮素淋溶存在較大的時(shí)空變化，具有局限性，仍缺乏最佳的氮肥管理措施[19-20]。與其他農(nóng)業(yè)模式相比，對(duì)設(shè)施菜地系統(tǒng)氮素淋溶機(jī)制的研究較少，開展氮肥、硝化抑制劑和脲酶抑制劑對(duì)不同種植年限設(shè)施菜地系統(tǒng)中菌群和氮素淋溶影響的研究，對(duì)氮肥資源化利用、減少環(huán)境污染、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要價(jià)值，并為土壤菌群的作用機(jī)制等方面奠定基礎(chǔ)。

1 設(shè)施菜地土壤氮素轉(zhuǎn)化途徑

在設(shè)施菜地土壤中，植物吸收土壤中的部分氮素以滿足生長需要，為保持土壤環(huán)境系統(tǒng)內(nèi)的氮素平衡，需要對(duì)這部分土壤施加氮肥或有機(jī)肥。土壤是一個(gè)動(dòng)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)，涵蓋生物、有機(jī)物、無機(jī)物、水和空氣。土壤中存在的氮素種類不同，不同形態(tài)氮素之間的轉(zhuǎn)化過程可表征土壤的供應(yīng)能力[21]。

1.1 土壤有機(jī)氮礦化

土壤中氮素主要以有機(jī)氮形式出現(xiàn)，而植物吸收利用的是無機(jī)氮，需要經(jīng)礦化過程使有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)氮，被作物直接吸入體內(nèi)參與物質(zhì)循環(huán)[22-23]。在氮素礦化時(shí)，無機(jī)氮發(fā)生積累和淋溶，造成農(nóng)業(yè)非點(diǎn)源污染。在氮礦化方面，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同類型的土壤進(jìn)行長期研究表明，產(chǎn)生的大量N2O使研究區(qū)域氣溫上升，土壤中無機(jī)氮含量和氮素利用效率與氮素礦化速率呈正相關(guān)[24]。過燕琴等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在氮素礦化量和礦化速率方面，設(shè)施菜地明顯高于露天菜地。MINGZHU等[25]研究認(rèn)為，尿素的添加未改變土壤總氮礦化速率，但可促進(jìn)活性有機(jī)氮的礦化。

土壤氮素礦化過程受到土壤含水量、土壤溫度和微生物等影響[22]。在含水量低的情況下顯著影響土壤中微生物生長，使礦化作用受到阻礙，降低礦化速率。土壤溫度對(duì)微生物活性的影響較大，在低溫環(huán)境中阻礙硝化細(xì)菌的硝化功能；相反，在高溫環(huán)境中，微生物的反硝化作用會(huì)加強(qiáng)，生成N2O和N2，但降低氮素利用率。STANFORD等[26]研究發(fā)現(xiàn)在-4～40℃，土壤氮礦化量與溫度呈正相關(guān)。周才平等[27]對(duì)不同含水量的2種森林土壤進(jìn)行研究表明，當(dāng)溫度在5～35℃，礦化速率隨溫度的上升而增加。

1.2 土壤氮素硝化及反硝化作用

硝化過程可謂是全球氮循環(huán)、植物營養(yǎng)和環(huán)境治理過程的重要一步。硝化速率越高，作物氮素利用效率可能越低，硝化作用的第一步和限速過程是由微生物AOA或AOB進(jìn)行[28]。在氮素轉(zhuǎn)化的過程中，硝化作用和反硝化作用主要影響因子有溫度、含水率、pH、有機(jī)質(zhì)含量等[29-30]，因此，可以確定不同種類土壤的硝化和反硝化活性之間存在差異。

大氣中90%的N2O來源于土壤硝化和反硝化作用，土壤硝化過程是土壤氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過程，也是導(dǎo)致干旱土壤中N2O排放的重要途徑之一[31]。氨氧化微生物主導(dǎo)的氨氧化過程限制硝化過程，有副產(chǎn)物N2O產(chǎn)生，氨氧化微生物對(duì)N2O的排放有關(guān)鍵作用[32-33]。針對(duì)NO3--N淋溶問題，崔敏等[34]研究發(fā)現(xiàn)，北方大部分蔬菜種植區(qū)域的土壤和地下水中NO3--N含量嚴(yán)重超標(biāo)。巨曉棠等[35]針對(duì)北京地區(qū)的設(shè)施菜地土壤研究顯示，深度為4 m的土壤中NO3--N的累積量高達(dá)1 230 kg/hm2，深度為2～4 m的土壤中434 kg/hm2的NO3--N不能被作物吸收，氮素?fù)p失量是糧食作物系統(tǒng)的3.5倍。

BURTON等[36]將原生林和種植園林土壤作對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在形成對(duì)比的原生林生態(tài)系統(tǒng)中，硝化作用占有優(yōu)勢(shì)。ALLEN等[37]在深入探討河口和樹林土壤產(chǎn)生N2O時(shí)空變異時(shí)認(rèn)為，由于氧化還原電位的影響，使得硝化作用占主導(dǎo)地位。HUYGENS等[38]通過15N同位素示蹤法研究首次發(fā)現(xiàn)將近99%的異化硝態(tài)氮還原成銨態(tài)氮，并認(rèn)為在南方森林土壤中主要是反硝化過程。其不僅確保土壤中氮素的積累，還對(duì)維持土壤養(yǎng)分具有一定價(jià)值。蘇靜等[39]研究表明，pH主要通過影響NH3含量的變化和土壤的硝化速率，導(dǎo)致其對(duì)土壤硝化作用和微生物具有顯著影響。若研究對(duì)象是熱帶區(qū)域酸性土壤，氨肥的施加可能影響其酸堿度，使其上升，但不會(huì)直接對(duì)土壤發(fā)生硝化反應(yīng)產(chǎn)生任何影響[40]。不同年限和不同季節(jié)的NO3--N淋失量差異顯著，若在我國華北地區(qū)的設(shè)施菜地，夏季的NO3--N淋失量最大。

2 氮肥和抑制劑對(duì)氮素轉(zhuǎn)化和酶活性的影響

2.1 設(shè)施菜地氮素轉(zhuǎn)化

2.1.1 過量施肥 農(nóng)民為保持和增加作物產(chǎn)量，大量施用氮肥。然而，有研究表明，過量施肥可能重新塑造設(shè)施菜地系統(tǒng)中的菌群，增加N2O的排放和NO3--N的淋溶量[21]。滴灌施肥已被證實(shí)是一種通過直接將水和養(yǎng)分輸送到作物根部以提高作物產(chǎn)量、節(jié)省氮投入和減少水分利用的先進(jìn)技術(shù)[41]。有研究認(rèn)為，地表滴灌施肥聯(lián)合硝化抑制劑是解決該地區(qū)氮肥施用過多、地下水抽采過多問題的較好選擇[42]。ZHANG等[43]利用DNDC模型對(duì)溫室蔬菜的評(píng)估顯示，有機(jī)肥或合成氮肥的施用量增加明顯增加N2O的排放和NO3--N的淋溶，但不會(huì)使蔬菜產(chǎn)量持續(xù)增加，總體上有機(jī)肥優(yōu)于尿素的施加效果。

2.1.2 硝化抑制劑 硝化抑制劑對(duì)土壤環(huán)境有顯著影響，通過調(diào)控土壤中酶的活性，減少氮素的損失[44]。2-氯-6(三氯甲基)-吡啶(CP)是常用于農(nóng)業(yè)土壤中的硝化抑制劑，硝化抑制劑的核心機(jī)制是通過銅螯合使氨單加氧酶失活，從而阻礙氨氧化劑的增加[45]。研究發(fā)現(xiàn)，生物有機(jī)肥的使用提高土壤氮素含量，而硝化抑制物質(zhì)的施加能夠在一定程度上控制土壤中氮素轉(zhuǎn)化從而明顯提高氮素轉(zhuǎn)化效率[25]。硝化抑制劑有效抑制硝化過程的同時(shí)，也成為農(nóng)業(yè)土壤中最普遍應(yīng)用的肥料添加劑之一[28]。然而，硝化抑制劑與脲酶抑制劑的聯(lián)合使用可以更有效控制N2O的形成以及對(duì)氨氧化微生物的反應(yīng)機(jī)理值得進(jìn)一步深入研究[46]。此外，CP與有機(jī)肥結(jié)合對(duì)設(shè)施菜地土壤NH3的釋放機(jī)制仍不明確。

許紀(jì)元等[47]在研究CP對(duì)設(shè)施番茄氮素遷移的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施氮量為300 kg/hm2時(shí)，施加CP可使番茄增產(chǎn)31.4%，氮肥回收率提高9.2%，但氨排放增加3.65 kg/hm2。研究表明，CP對(duì)于減少氮素?fù)p失有促進(jìn)作用，可減少農(nóng)田土壤的N2O排放，但施加CP存在NH3釋放增加的風(fēng)險(xiǎn)[48-49]。探討CP在不同土壤環(huán)境下對(duì)氨氧化微生物的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，CP對(duì)AOA和AOB等菌群的抑制作用對(duì)于不同的土壤類型效果存有差異[50]。

2.1.3 脲酶抑制劑 脲酶作用于土壤中的尿素，而脲酶抑制劑則能抑制尿素在土壤中的水解速率。比較多種脲酶抑制劑，正丁基硫代磷酸酰三胺(NBPT)是最有效的脲酶抑制劑之一。NBPT在土壤中轉(zhuǎn)化為類似物N-(正丁基)三酰胺磷酸(NBPTO)，最終使脲酶失活，減緩尿素水解[51-52]。NBPT的特點(diǎn)是迅速出現(xiàn)效果且持續(xù)周期較長，適用于多種土壤類型。然而，除減少底物供應(yīng)外，NBPT對(duì)硝化過程的影響機(jī)制仍不清楚[53]。

脲酶抑制劑可以延長氨態(tài)氮在土壤中的滯留時(shí)間，從而提高肥料的肥效，減少氮肥施用對(duì)氣候和環(huán)境的影響[54]，并且抑制AOB、AOA及相關(guān)酶的活性，有效的延緩NH4+氧化成NO3-，減慢了NO3-積累，使土壤具有較高的NH4+含量[55]。萬年鑫等[56]通過綜合多因素的研究發(fā)現(xiàn)，NBPT能明顯減少尿素的損失，增加秋馬鈴薯產(chǎn)量，且其效果優(yōu)于CP處理。賴睿特等[57]研究發(fā)現(xiàn)，硝化抑制劑、脲酶抑制劑以及生物質(zhì)炭的使用，均可能抑制養(yǎng)殖肥液灌溉之后N2O排放，不利于硝化過程的進(jìn)行，而且2種抑制劑的組合效果明顯優(yōu)于單一抑制劑。在實(shí)驗(yàn)室和田間試驗(yàn)中，NBPT的效果最好，可以將尿素肥料中的氨排放量減少30%～70%，將NBPT添加到尿素和硝酸銨溶液肥料中可以減少50%的氨排放[58]。綜上所述，以設(shè)施菜地為研究對(duì)象，NBPT抑制N2O和NH3的產(chǎn)生，減緩氮素淋溶速率。

2.2 氮肥配施抑制劑影響酶活性

設(shè)施菜地土壤中生物的分泌物及其肢體殘留物和細(xì)菌等可產(chǎn)生的酶類在進(jìn)行全系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換等各方面發(fā)揮不可或缺的功能[56]。根據(jù)土壤酶活性可推斷微生物的活性，目前如何利用這種土壤酶活性表征大氣中的污染物對(duì)于土壤各方面的影響逐漸成為熱點(diǎn)話題。土壤氮素轉(zhuǎn)化主要依靠相關(guān)微生物和各種酶完成，土壤中存在各種轉(zhuǎn)化酶、脲酶、氧化還原酶等，各自在各領(lǐng)域發(fā)揮著不同的酶促作用。土壤酶主要以吸附態(tài)的方式存活，與其他腐殖質(zhì)相互聯(lián)系并共存，提升土壤酶活性有助于增加土壤肥力。

與土壤氮素轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的3種酶為土壤脲酶、硝酸還原酶和亞硝酸還原酶[46]。由于設(shè)施菜地系統(tǒng)屬于密封性強(qiáng)、高溫高濕的環(huán)境，明顯提高土壤酶活性和酶對(duì)底物的結(jié)合能力[59]。

在其作用機(jī)制方面，具有抑制脲酶活性功能的脲酶抑制劑在一定程度上能夠抑制氮肥的吸收和水解，而硝化抑制劑對(duì)于土壤氮素轉(zhuǎn)化過程中酶活性的影響不同。李君[44]研究表明，在小麥抽穗與灌漿期間，單施尿素處理的脲酶活性與對(duì)照處理相比無顯著差異，而尿素配施2種抑制劑的處理顯著優(yōu)于其他處理。從結(jié)果分析，土壤中亞硝酸還原酶和硝酸還原酶活性在施肥條件下會(huì)發(fā)生變化，抑制劑的使用對(duì)兩者有不同的影響，使得亞硝酸還原酶活性有所降低，硝酸還原酶活性得以改善?？傊P(guān)于設(shè)施菜地土壤酶活性的研究較少，但在整個(gè)農(nóng)業(yè)土壤氮素循環(huán)體系中，設(shè)施大棚內(nèi)土壤礦化過程越劇烈，土壤酶活性越高。

3 土壤菌群

李君[44]通過末端限制性片段多態(tài)性分析(T-RFLP)研究設(shè)施菜地在不同栽培年限下土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)的改變情況并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法定量分析AOA、AOB和nirK型反硝化細(xì)菌群落豐度的變化情況。在菌群分析中光循環(huán)儀480II系統(tǒng)中，通過定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)研究硝化和反硝化過程中微生物功能標(biāo)記基因的豐度[60]。

研究表明，過量施肥對(duì)設(shè)施菜地土壤微生物的結(jié)構(gòu)有顯著影響，使微生物的種類明顯減少，與減肥作對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Rhodanobacter屬的菌群被過量富集[21]。除此外，添加生物質(zhì)、硝化抑制劑、脲酶抑制劑或新興有機(jī)污染物DEHP等對(duì)菜田中的細(xì)菌、反硝化細(xì)菌等微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度等方面產(chǎn)生一定的影響。CHEN等[61]在研究生物炭和硝化抑制劑對(duì)N2O排放與氨氧化微生物影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，生物炭對(duì)AOA和AOB的生長均有促進(jìn)作用，而DMPP單獨(dú)抑制了AOB的活性和生長。TAO等[62]研究表明，硝基吡啶(NP)的添加顯著減少石灰性土壤中AOB的豐度，抑制紅壤中AOA的生長，且線性回歸分析表明，紅壤PNR與AOB和AOA豐度呈正相關(guān)，而鈣質(zhì)土壤僅與AOB呈正相關(guān)。MENG等[53]研究發(fā)現(xiàn)，硝化抑制劑DCD(雙氰胺)使得AOB停滯生長，并抑制AOB在硝化反應(yīng)過程中的作用，NP和NBPT阻礙AOA的生長。微生物在設(shè)施菜地作物生長和氮素循環(huán)方面存在顯著差異，如何提高氮素利用率和作物質(zhì)量、氮肥配施2種抑制劑在設(shè)施栽培條件下對(duì)AOA、AOB和其他土壤微生物菌群的影響機(jī)制成為關(guān)鍵問題。

4 展望

研究氮肥配施抑制劑對(duì)設(shè)施菜地土壤菌群及氮素淋溶的響應(yīng)機(jī)制，是為了調(diào)控土壤氮素轉(zhuǎn)化過程，提高氮素利用率，減少氮素淋溶，增強(qiáng)土壤肥力。結(jié)合設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展、氮肥利用與環(huán)境保護(hù)三條主線，可開展以下幾方面研究工作：研究氮肥、CP和NBPT三者聯(lián)用對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化的影響，以礦化速率和硝化速率表征；不同處理對(duì)N2O和NH3排放的影響；不同處理對(duì)土壤微生物量碳、微生物量氮和土壤酶活性的影響；利用16S rRNA分析氨氧化微生物和nirk反硝化細(xì)菌等土壤菌群的豐度變化，并探討菌群豐度與土壤潛在硝化勢(shì)(PNR)和N2O排放量的關(guān)系。