p16及其與皮膚腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

鄧寧寧，馬志紅

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院皮膚科，黑龍江 牡丹江 157011)

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，是一類多階段的、多基因、多因素、多途徑導(dǎo)致的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受損的疾病，其中癌基因與抑癌基因的表達(dá)和調(diào)控異常是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移的重要原因之一。p16是一種繼抑癌基因p53之后發(fā)現(xiàn)的另一種最常見的腫瘤抑制基因，p16基因產(chǎn)物是分子量為16000的蛋白質(zhì)，是一種細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4和CDK6的抑制物，在調(diào)控細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[1]。本文就p16的結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)制及其與皮膚腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

1 p16的結(jié)構(gòu)

p16又稱為多種腫瘤抑制因子1(MTS-1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4a抑制劑(INK4a)或細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(p16INK4a和CDKN2A)，是一種腫瘤抑制因子，是位于人類染色體9p21.3的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑INK家族的成員[1-2]。Serrano等人[3]于1993年使用酵母雙雜合蛋白相關(guān)性篩選法研究CDK4作用的相關(guān)性蛋白時(shí)，第一次發(fā)現(xiàn)了p16基因，并克隆了p16的互補(bǔ)DNA。1994年Kamb等人[4]報(bào)道的一種多種腫瘤抑制因子，是運(yùn)用染色體移位技術(shù)和定向測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞系染色體9p21位點(diǎn)存在基因缺失和突變，將這種基因稱為p16基因。p16基因座位于9p21.3，全長8500bp,由外顯子1α、1β、2、3和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，是一種含148個(gè)氨基酸殘基、分子量約為16000的細(xì)胞周期相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白[5]。

2 p16的作用機(jī)制

真核細(xì)胞的細(xì)胞周期，一般分為間期和分裂期(M期)，其中間期又分為三期，即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。細(xì)胞周期中的每個(gè)階段都有其復(fù)雜的生化變化，其中G1→S期和G2→M期這兩個(gè)階段處在復(fù)雜活躍的分子水平的時(shí)期，是細(xì)胞周期中極其重要的兩個(gè)階段，尤其G1→S期的調(diào)控。p16是細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子，它作用于pRb(視網(wǎng)膜神經(jīng)母細(xì)胞瘤蛋白)上游，能抑制CDK4/6(cyclin D依賴的蛋白激酶4/6)，能使pRb保持低磷酸化，細(xì)胞停滯于G1期，主要是通過p16-Cyclin D1-CDK4/6-pRb途徑來實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞周期的。而CDK4/6只有在與cyclin D1結(jié)合后才有活性，CDK4/6與cyclin D1結(jié)合后能使Rb磷酸化，磷酸化后的Rb將與轉(zhuǎn)錄因子E2F解離，游離并活化的E2F入核內(nèi)，激活G1→S轉(zhuǎn)換，合成S期必需的基因產(chǎn)物(cyclin B1, dihydrofolate reductase, JUNB and others)，從而加速了細(xì)胞周期以及促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外p16蛋白能與cyclin D1蛋白競爭性結(jié)合CDK4/6并阻斷CDK4/6與cyclinD1結(jié)合形成復(fù)合體，從而Rb不能磷酸化，E2F不能游離活化，所以細(xì)胞增殖會受到抑制。由此可見p16不僅能調(diào)控細(xì)胞周期，還可以抑制細(xì)胞增殖[5-6]。

3 p16基因結(jié)構(gòu)及功能的異常

目前研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在p16基因失活，并且發(fā)現(xiàn)p16基因失活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展甚至預(yù)后有密切關(guān)系。引起p16基因失活的遺傳改變包括突變、純合缺失、啟動子過甲基化，其中最常見的遺傳改變是純合缺失和啟動子過甲基化。p16基因啟動子甲基化及累及p16基因的點(diǎn)突變常常不影響p16基因的活性[7-8]。有研究表明，p16蛋白的低表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后有關(guān)，比如卵巢癌、食管癌、口咽部鱗癌、乳腺癌等。

3.1 基因突變基因突變指的是DNA序列發(fā)生的堿基替換，一般包括少量堿基的插入或缺失，又稱為點(diǎn)突變p16基因突變主要包括剪接位點(diǎn)突變、部分核苷酸堿基序列缺失、重新排列、位移或插入其他堿基序列。但是一般認(rèn)為p16基因發(fā)生突變的概率遠(yuǎn)低于純合缺失和啟動子過甲基化。Hardie L J等[9]探討食管癌p16 mRNA表達(dá)與p16基因突變、缺失之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)p16突變不常見，僅占2%，但是在43%的組織學(xué)正常上皮中及85%的腫瘤樣本中檢測到了p16基因啟動子過甲基化。

3.2 基因缺失缺失主要表現(xiàn)為純合缺失和雜合缺失。p16基因發(fā)生純合缺失時(shí)會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p16 mRNA和p16蛋白均不能表達(dá)；而p16基因發(fā)生雜合缺失時(shí)，沒有發(fā)生缺失的部分基因可以正常表達(dá)，但如果這一部分基因發(fā)生甲基化修飾或突變，會使細(xì)胞內(nèi)p16基因失活、蛋白水平下降。López等[10]在27個(gè)原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌和20個(gè)健康粘膜樣本的充分表征的系列中研究了p16基因，使用甲基化特異性確認(rèn)異常啟動子高甲基化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)除了3個(gè) (11%) 之外，所有研究的樣本都在9p21段出現(xiàn)損失，這最常見的發(fā)現(xiàn)是p16基因座的小缺失(外顯子1α)(44%)。

3.3 啟動子過甲基化DNA甲基化是由DNA胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)來催化的，可以將甲基從一個(gè)S-腺苷甲硫氨酸上轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的C-5位置上。DNA甲基化幾乎特異地發(fā)生在CpG核苷處，CpG核苷在基因組中并不是隨機(jī)分布的，相反，基因組中存在著CpG核苷富集的區(qū)域，稱為CpG島。抑癌基因5’端啟動子區(qū)CpG島的高甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)失活是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)主要事件。因此，DNA甲基化越來越被認(rèn)為是一種有前途的表觀遺傳和診斷生物標(biāo)志物。Jae Jun Lee使用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)方法，評估231例浸潤性乳腺癌和90例導(dǎo)管內(nèi)癌標(biāo)本中p16基因的甲基化狀態(tài)和p16蛋白表達(dá)水平，結(jié)果示p16基因啟動子經(jīng)常過甲基化，不僅在侵襲性腫瘤樣本中，而且在導(dǎo)管內(nèi)癌樣本中也是如此，研究還發(fā)現(xiàn)p16基因的啟動子高甲基化與p16蛋白表達(dá)之間沒有明確的關(guān)聯(lián)[11]。多項(xiàng)研究表明，啟動子過甲基化會導(dǎo)致淋巴瘤中p16蛋白表達(dá)的喪失。Robaina等人在51個(gè)淋巴瘤腫瘤樣本中使用焦磷酸測序研究了CDKN2A甲基化，在72.5%的樣本中發(fā)生了CDKN2A啟動子的甲基化，而在約41%的樣本中仍未檢測到p16蛋白的核表達(dá)，甲基化與CDKN2A mRNA缺失之間存在關(guān)聯(lián)。在這項(xiàng)研究中，處于III / IV期32個(gè)患者樣本中(80%)檢測到CDKN2A啟動子甲基化[12]。

4 p16與皮膚腫瘤

4.1 瘢痕疙瘩瘢痕疙瘩是繼發(fā)于皮膚損傷后組織過度纖維修復(fù)形成的良性皮膚腫瘤，主要表現(xiàn)為結(jié)節(jié)樣皮損，或呈蟹足樣向周圍擴(kuò)展，超出原損傷范圍。有研究表明瘢痕疙瘩中存在成纖維細(xì)胞的過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積和向正常皮膚組織侵襲生長的特征。季江等[13]采用免疫組化法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法以及亞硫酸氫鹽修飾后測序(BSP法)對瘢痕疙瘩皮損中的p16蛋白表達(dá)情況、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)情況以及p16基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果示瘢痕疙瘩皮損中p16基因mRNA表達(dá)較正常皮膚低、瘢痕疙瘩中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平較正常皮膚高，且瘢痕疙瘩中p16啟動子區(qū)甲基化水平明顯高于正常皮膚組織，由此可以認(rèn)為瘢痕疙瘩中p16甲基化及其低表達(dá)情況與其發(fā)生發(fā)展可能存在一定聯(lián)系。Limandjaja研究發(fā)現(xiàn)肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩都表現(xiàn)出衰老標(biāo)記物p16表達(dá)增加，并分布在整個(gè)瘢痕區(qū)域，提示成纖維組織的異常增殖可能與p16蛋白有關(guān)[14]。

4.2 脂溢性角化病脂溢性角化病( Seborrheic keratosis,SK) 是一種常見的良性的皮膚腫瘤，好發(fā)于中老年人，主要是因角質(zhì)細(xì)胞成熟遲緩所致。Smolyannikova等通過免疫組織化學(xué)對130名SK皮損檢測p53、p16和Ki67的表達(dá)，結(jié)果示超過50%的皮損中p16過表達(dá)，且在高細(xì)胞增殖活性的情況下，p53、p16的表達(dá)顯著增加，刺激性SK可能存在惡性腫瘤轉(zhuǎn)化[15]。在SK中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)紊亂提示腫瘤抑制因子激活和角質(zhì)形成細(xì)胞衰老。彭程、施巖等[16]應(yīng)用免疫組化法檢測p16蛋白在50例脂溢性角化病皮損和10例正常皮膚組織中的表達(dá)情況，結(jié)果示78% (39/50)皮損中p16表達(dá)在表皮細(xì)胞全層，而正常皮膚組織僅40%少量表達(dá)在顆粒層，提示p16蛋白的表達(dá)可能參與了SK的發(fā)病。

4.3 皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮膚鱗狀細(xì)胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma)又稱為棘細(xì)胞癌，是一種常見發(fā)生于上皮細(xì)胞的皮膚惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于基底細(xì)胞癌，但是轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)卻高于基底細(xì)胞癌，其發(fā)生機(jī)制主要與紫外線照射、化學(xué)致癌物、病毒感染(HPV16、18等)及遺傳等有關(guān)。有研究證實(shí)紫外線可以誘導(dǎo)皮膚癌患者皮損中p16/CDKN2A的表達(dá)降低[17]。Lisa N Tyler等[18]使用免疫組織化學(xué)確定了光化性角化病、原位鱗狀細(xì)胞癌和皮膚浸潤性鱗狀細(xì)胞癌中p16表達(dá)的增加，發(fā)現(xiàn)在非腫瘤性和惡性皮膚病變中p16基因啟動子過甲基化的頻率非常低(6%)。齊淑貞等[19]使用PCR法、western blot及甲基化特異性PCR對皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織分別檢測了p16 mRNA表達(dá)、p16蛋白表達(dá)以及p16基因啟動子甲基化情況，結(jié)果為皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中p16 mRNA及p16蛋白較正常皮膚組織低表達(dá)，而甲基化陽性率高于正常皮膚組織，提示了p16 mRNA及p16蛋白低表達(dá)情況可能與鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

4.4 皮膚基底細(xì)胞癌皮膚基底細(xì)胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma)又稱為基底細(xì)胞上皮瘤，是一種局部侵襲性緩慢生長的皮膚惡性腫瘤，很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。有研究證實(shí)p16蛋白低表達(dá)可能參與了基底細(xì)胞癌的發(fā)生。范林明等人[20]使用免疫組化技術(shù)對54例基底細(xì)胞癌組織檢測p16蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果示p16蛋白呈現(xiàn)為低表達(dá)，提示p16可能與基底細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。Kanellou等[21]對基底細(xì)胞癌組織中腫瘤抑癌基因p16 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了研究，并與正常皮膚組織進(jìn)行對比，結(jié)果示p16 mRNA表達(dá)水平低于正常皮膚組織，且p16基因測序存在突變情況，亦可能使蛋白表達(dá)水平降低。也有一些研究表明p16蛋白在基底細(xì)胞癌中過表達(dá)情況[22]，提示了p16蛋白過表達(dá)可能與其預(yù)后有關(guān)。

4.5 黑素瘤黑素瘤(melanoma)是一種來源于黑素細(xì)胞的惡性程度較高的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占所有皮膚腫瘤的4%，而占所有皮膚惡性腫瘤相關(guān)的死亡率高達(dá)80%，是人類最致命的癌癥之一。抑癌基因p16/CDKN2A仍然是家族性黑素瘤中最常見的改變基因，有研究表明它的發(fā)生與抑癌基因p16/CDKN2A的缺失相關(guān)[23-24]。Ming Bai等[25]的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)CDKN2A (p16INK4A) 和 CDKN2A (p14ARF) 過表達(dá)抑制黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。王雙雙等[26]通過免疫組化技術(shù)檢測Spitz痣和黑素瘤皮損中p16蛋白表達(dá)情況，結(jié)果示Spitz痣皮損中p16蛋白高表達(dá)，而黑素瘤皮損中表達(dá)缺失。

4.6 paget病又稱為濕疹樣癌，是一種少見的皮膚腫瘤，好發(fā)于乳房、陰囊及會陰等處，其病因仍不太清楚。Gloria Zhang等人[27]通過免疫組織化學(xué)方法檢測了40例原發(fā)性外陰paget病中p16的表達(dá)，其中90%患者有p16表達(dá)，提示p16的表達(dá)與疾病的進(jìn)展相關(guān)；同時(shí)還觀察上皮內(nèi)原發(fā)性外陰paget病主要具有細(xì)胞質(zhì)p16免疫反應(yīng)性，而細(xì)胞核p16免疫反應(yīng)性主要見于侵襲性原發(fā)性外陰paget病，結(jié)果提示p16表達(dá)可能參與原發(fā)性paget病的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展。

4.7 原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(primary cutaneous T cell lymphoma)，又稱蕈樣肉芽腫，是起源于T細(xì)胞的可累及淋巴結(jié)和內(nèi)臟的一種皮膚原發(fā)的淋巴瘤。張春雷等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞顯示出致癌基因(bmi-1和ras基因)和腫瘤抑制基因(p16基因)表達(dá)的變化，從而增加增殖。崔成軍等人[29]使用免疫組化技術(shù)和PCR法研究了蕈樣肉芽腫的p16蛋白表達(dá)及其甲基化狀態(tài)，結(jié)果示蕈樣肉芽腫中存在p16蛋白表達(dá)缺失，且71.43%患者出現(xiàn)p16基因啟動區(qū)CpG島異常甲基化，提示了p16在蕈樣肉芽腫的起病或者疾病進(jìn)展過程中起著一定的作用。

5 結(jié)語

p16是一種繼抑癌基因p53之后發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，主要是通過p16-Cyclin D1-CDK4/6-pRb途徑來實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞周期的。目前已有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在p16基因失活和p16蛋白的低表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)p16基因失活及低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展甚至預(yù)后有密切關(guān)系。但也有一些研究中腫瘤組織內(nèi)存在p16蛋白過表達(dá)情況，可能是因?yàn)楸恢掳┮蛩卮碳て浔磉_(dá)所致。

綜上所述，p16與皮膚腫瘤的關(guān)系密切，但是p16基因在皮膚腫瘤方面的研究仍需繼續(xù)探索，比如p16基因診斷、基因治療以及判斷預(yù)后等方面。