MSCs-Exo對創(chuàng)面愈合炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及機(jī)制研究進(jìn)展*

王文瑞，黃曉飛，孫田靜 綜述，喻安永審校

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，貴州遵義 563000)

創(chuàng)面愈合是指致傷因子的作用造成組織缺失后，局部組織通過再生、修復(fù)、重建，進(jìn)行修補(bǔ)的一系列復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，受多層面、多因素調(diào)控，是針對組織細(xì)胞損傷的一種固有防御性反應(yīng)[1]。皮膚損傷后，受損區(qū)域皮膚組織會進(jìn)入一個動態(tài)的、高度可控的恢復(fù)過程，主要包括止血、炎癥、增殖和組織重塑4個連續(xù)交織的階段[2]。如果愈合過程不順利，急性皮膚創(chuàng)面在3個月內(nèi)無法通過正常、有序、及時的修復(fù)過程達(dá)到解剖和功能上的完整性，將演變?yōu)槁云つw創(chuàng)面[3]。炎癥反應(yīng)及瘢痕形成均為創(chuàng)面愈合的必經(jīng)過程，其中炎癥反應(yīng)有助于清除創(chuàng)面壞死物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長因子釋放，而瘢痕形成則有助于盡早關(guān)閉創(chuàng)面，縮短創(chuàng)面愈合時間，二者共同促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)[4]。有研究證實(shí)，慢性創(chuàng)面難愈可能與過度且持續(xù)的異常創(chuàng)面炎癥密切相關(guān)，通過炎癥反應(yīng)抑制干預(yù)可有效改善創(chuàng)面局部炎癥刺激，提高潰瘍面愈合效果，并加快愈合進(jìn)程[5]。創(chuàng)面炎癥干預(yù)已成為慢性難愈合創(chuàng)面治療研究的重要靶點(diǎn)之一，為此學(xué)界嘗試了許多方法，并始終在尋找更有效的解決方法。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及MSCs源性外泌體(MSCs-Exo)等在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注，可有效修復(fù)創(chuàng)面并有效減輕創(chuàng)面異常炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本綜述對創(chuàng)面愈合過程進(jìn)行介紹，分析MSCs-Exo調(diào)控創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的機(jī)制，歸納和總結(jié)MSCs-Exo減輕創(chuàng)面異常炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的研究現(xiàn)狀，為MSCs-Exo未來臨床應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)治療和研究提供參考。

1 創(chuàng)面愈合過程

創(chuàng)面愈合是一個動態(tài)又復(fù)雜的生理過程[6]。在止血期，創(chuàng)面局部血管收縮，血流量減少，內(nèi)源性及外源性凝血過程啟動，血小板聚集于裸露的膠原纖維上，釋放5-羥色胺、前列腺素、磷脂和二磷酸腺苷(ADP)等血管活性物質(zhì)，吸引更多的血小板聚集，加速血凝塊形成，此時凝血過程完成。進(jìn)入炎癥期，隨著一氧化氮、白細(xì)胞介素(IL)等炎癥物質(zhì)釋放，早期收縮的血管擴(kuò)張，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞游出血管向創(chuàng)面趨化，吞噬入侵的細(xì)菌，消化壞死的組織細(xì)胞碎片，同時，組織細(xì)胞溶酶體釋放蛋白溶酶加速消化過程，使創(chuàng)面清潔，以啟動組織的修復(fù)過程。進(jìn)入創(chuàng)面增殖和組織重塑階段，巨噬細(xì)胞刺激成纖維細(xì)胞增殖分化，合成膠原蛋白，毛細(xì)血管和結(jié)締組織的反應(yīng)性增生形成肉芽組織，并在生長因子[如血小板衍生性生長因(PDGF)]作用下不斷成熟，填充創(chuàng)面基底部，同時創(chuàng)面周緣健存的基底細(xì)胞開始增生，并向中心部位移行，使創(chuàng)面不斷縮小。當(dāng)創(chuàng)面被再生的上皮細(xì)胞完全覆蓋后，內(nèi)部膠原纖維重新排列，毛細(xì)血管數(shù)目減少，創(chuàng)面局部顏色減退，在結(jié)締組織收縮作用下完全合攏，組織層次恢復(fù)正常，創(chuàng)面得以愈合。

2 創(chuàng)面愈合過程炎癥反應(yīng)

創(chuàng)面炎癥反應(yīng)持續(xù)時間及程度與創(chuàng)面大小、創(chuàng)傷機(jī)制、局部血供、創(chuàng)面治療措施是否及時有效等因素有關(guān)，早期創(chuàng)面清創(chuàng)、植皮，調(diào)控異常炎癥，治療原發(fā)病，改善機(jī)體全身狀態(tài)均有助于創(chuàng)面修復(fù)痊愈[7]。研究顯示，炎癥反應(yīng)期延長可引起創(chuàng)面微環(huán)境變化，進(jìn)而延緩創(chuàng)面愈合[8]。創(chuàng)面愈合早期，免疫應(yīng)答反應(yīng)有助于清除病原體，但是，過度且持續(xù)的炎癥反應(yīng)將促進(jìn)慢性創(chuàng)面的形成，加速肥厚性瘢痕的產(chǎn)生，炎性組織中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞持續(xù)及過度浸潤，受體[如Toll樣受體(TLR)]過度激活，IL-6、IL-17、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子持續(xù)過度表達(dá)，大量促炎細(xì)胞因子和蛋白酶持續(xù)作用可引起組織血管過度收縮，導(dǎo)致血供障礙及組織損傷，同時血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、PDGF、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等生長因子水平降低，有氧自由基生成過多、鈣離子超載等因素均可導(dǎo)致愈合進(jìn)程停留在炎癥反應(yīng)期，抑制創(chuàng)面修復(fù)[9]。在增殖與組織塑形階段，炎癥異常持續(xù)可引起創(chuàng)面基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性增加、蛋白酶組織抑制物減少，成纖維細(xì)胞老化、纖維連接蛋白變性與碎片化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過量破壞并阻礙肉芽組織形成，抑制上皮組織的修復(fù)，因此早期調(diào)控創(chuàng)面異常炎癥反應(yīng)顯得格外重要[10]。

3 MSCs-Exo創(chuàng)面修復(fù)研究現(xiàn)狀及對異常炎癥反應(yīng)調(diào)控作用

3.1 MSCs-Exo創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

MSCs作為人體組織重要的組成成分之一，可來源于骨髓、脂肪、臍帶等多種組織，現(xiàn)已廣泛用于創(chuàng)面修復(fù)、腦損傷等疾病治療。移植后的干細(xì)胞存活數(shù)量隨時間的推移急劇下降，極少量存活的干細(xì)胞并不能從根本上影響新生組織的再生構(gòu)建，更有可能是通過局部微環(huán)境的改變而產(chǎn)生作用[11]。有研究證實(shí)，MSCs-Exo既保留MSCs的功能特性，同時又具有更低的免疫原性與更高的安全性，目前已廣泛用于神經(jīng)退行性疾病、脊髓損傷、骨性關(guān)節(jié)炎、糖尿病潰瘍創(chuàng)面等疾病研究及治療[12]。MSCs-Exo直徑30～100 nm，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，可由差速離心、沉淀、免疫分離等方法提取，并通過釋放蛋白、脂質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)，構(gòu)成細(xì)胞間信號傳遞系統(tǒng)[13]。 MSCs-Exo在不同階段分別參與炎癥反應(yīng)調(diào)控，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，抑制瘢痕的形成。MSCs-Exo最大限度保留了MSCs損傷修復(fù)、炎癥抑制、免疫調(diào)節(jié)的作用，在創(chuàng)面修復(fù)中顯示出了極大的潛力，同時具有更長的半衰期、更低的免疫原性、更好的穩(wěn)定性，一方面可以直接作用于創(chuàng)面，促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成，增加生長因子的表達(dá)，另一方面具有免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制和抗炎作用，對創(chuàng)面異常炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，加速創(chuàng)面愈合[12]。

3.2 MSCs-Exo對創(chuàng)面修復(fù)異常炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用

3.2.1MSCs-Exo對巨噬細(xì)胞及炎癥因子的調(diào)控作用

炎癥初期，創(chuàng)面局部微環(huán)境誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變，巨噬細(xì)胞分泌的CXCL9、CXCL10等趨化因子吸引中性粒細(xì)胞聚集，并釋放IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子促進(jìn)創(chuàng)面炎癥發(fā)生，清除壞死組織并防止細(xì)菌侵襲[14]。進(jìn)入增殖及組織重塑階段，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，通過分泌產(chǎn)生IL-10、TGF-β等抗炎因子抑制炎癥反應(yīng)持續(xù)，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)[15]。若M1型巨噬細(xì)胞不能及時向M2型轉(zhuǎn)化，持續(xù)的炎癥信號將建立正反饋環(huán)，放大炎癥反應(yīng)效應(yīng)，使創(chuàng)面滯留在炎癥反應(yīng)期，影響創(chuàng)面愈合[16]。MSCs-Exo通過Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、微RNA(miR)-146a、miR-9、miR-127、miR-155和miR-125b等途徑有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，縮短炎癥反應(yīng)時間，同時通過Notch信號通路和核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信號軸減少TNF-α、IL-1α、IL-6等炎癥因子分泌，增加IL-10、TGF-β、CCL1等抗炎因子分泌，并抑制核因子-κB(NF-κB)和p38絲裂素活化蛋白激酶(p38-MAPK)信號通路，減少巨噬細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)創(chuàng)面M1/M2型巨噬細(xì)胞比例，減少炎癥因子釋放，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)[17-19]。

3.2.2MSCs-Exo對中性粒細(xì)胞及炎性因子的調(diào)控作用

創(chuàng)面局部血液循環(huán)障礙、壞死組織形成、趨化因子大量釋放均可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化，促使中性粒細(xì)胞靶向損傷部位釋放氧自由基，蛋白水解酶發(fā)揮抗感染及保護(hù)創(chuàng)面作用，同時刺激成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞增殖，增加血管通透性，分泌促炎細(xì)胞因子(如IL-17)和生長因子(如VEGF)，形成對中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等持續(xù)募集和激活[20]。若炎癥持續(xù)，上述反應(yīng)加重組織損傷，導(dǎo)致創(chuàng)面局部循環(huán)障礙，加速炎性損傷的發(fā)生，使創(chuàng)面加深和擴(kuò)大，有研究表明早期應(yīng)用氧自由基清除劑及蛋白酶抑制劑可有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合[21]。MSCs-Exo通過抑制C5b-9復(fù)合物的形成，有效減少中性粒細(xì)胞浸潤及IL-17釋放，減輕創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)，并通過抑制TNF-α、IL-1β、金屬蛋白酶的基因表達(dá)及釋放，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的生成，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對局部中性粒細(xì)胞的吞噬作用，釋放miRNA(如miR-1 24-3p)片段，使創(chuàng)面局部釋放的炎癥因子及中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，避免過多中性粒細(xì)胞趨化與活化所致創(chuàng)面損傷，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[22-24]。

3.2.3MSCs-Exo對淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞及炎性因子的調(diào)控作用

創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞將抗原信息呈遞給CD4+T淋巴細(xì)胞，激活輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)2，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖分化及遷移，釋放IL-4、 IL-5、IL-10、IL-13等炎癥因子和促纖維化因子，加速ECM合成與沉積，影響膠原代謝，加速病理性瘢痕的形成[25]。同時，損傷局部血管導(dǎo)致大量T淋巴細(xì)胞滲出，釋放干擾素及促炎介質(zhì)影響成纖維細(xì)胞增殖活性和膠原的沉積，延緩創(chuàng)面愈合并促進(jìn)瘢痕形成[26]。損傷局部聚集的肥大細(xì)胞可釋放TGF-β、PDGF等促纖維化因子及組胺、類胰蛋白酶等細(xì)胞質(zhì)顆粒，刺激成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的合成及膠原合成，延緩急性炎癥反應(yīng)并促進(jìn)瘢痕形成[27]。肥大細(xì)胞過量聚集、活化對缺血性皮膚傷口的張力產(chǎn)生負(fù)面影響，并通過釋放擴(kuò)血管物質(zhì)(如組胺)導(dǎo)致出血，抑制凝血過程，延緩創(chuàng)面愈合[28]。MSCs-Exo通過傳遞抗原、miRNA等多種物質(zhì)，抑制樹突狀細(xì)胞的活化并誘導(dǎo)耐受，調(diào)節(jié)創(chuàng)面免疫平衡，同時可通過增強(qiáng)程序性死亡配體-1(PD-L1)、galecin-1和TGF-β的基因表達(dá)，抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增殖，抑制B淋巴細(xì)胞的分化及炎癥作用，加速活化T淋巴細(xì)胞的凋亡，減少Th17和Th22的生成，促進(jìn)Th1轉(zhuǎn)化為Th2，上調(diào)自身反應(yīng)抑制性淋巴細(xì)胞比例，誘導(dǎo)免疫耐受，減少干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)，增加IL-6、IL-10、TGF-β等抗炎細(xì)胞因子分泌，有效抑制創(chuàng)面免疫反應(yīng)，加速創(chuàng)面愈合[29-32]。同時MSCs-Exo可降低血清免疫球蛋白E(IgE)水平，減少嗜酸性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞活化，減少IL-4、IL-23、IL-31和TNF-α炎癥因子的表達(dá)和組胺等物質(zhì)的釋放，縮短凝血過程，促進(jìn)創(chuàng)面愈合及預(yù)防瘢痕形成[33]。

3.2.4MSCs-Exo對成纖維細(xì)胞及血管生成的調(diào)控作用

慢性創(chuàng)面通常伴隨組織缺失及局部血液循環(huán)障礙，常引起炎癥持續(xù)，導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合或不愈。若皮下組織長期暴露可促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)細(xì)菌繁殖，細(xì)菌通過分泌蛋白、壞死物質(zhì)形成生物膜，削弱免疫細(xì)胞、抗生素等對細(xì)菌的作用，不能及時清除有害物質(zhì)，延緩創(chuàng)面愈合[34]。組織再生需要流動的血液提供氧氣和營養(yǎng)并為中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞滲出活化清除壞死物質(zhì)提供條件，充足的血液可以改善局部微循環(huán)，減少感染發(fā)生。MSCs-Exo可分泌VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(BFGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)等多種生長因子，促進(jìn)血管生成[35]。MSCs-Exo還可通過上調(diào)miR-31、hsa-miR-760 基因的表達(dá)和下調(diào)hsa-miR-423-3p 基因的表達(dá)，影響ITGA5 和 HDAC5 基因的表達(dá)，達(dá)到促血管化的目的[36-37]。成纖維細(xì)胞可通過遷移、增殖和分泌等來促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)組織生長、填滿創(chuàng)面[38]。MSCs-Exo激活 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷移，增加Ⅰ型和Ⅲ型膠原分泌，使Ⅱ型膠原沉積增加，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌ECM相關(guān)蛋白和MMP-1分泌，增加TGF-β1 和纖連蛋白表達(dá)，加快創(chuàng)面愈合速度，促進(jìn)上皮化的發(fā)生[39-40]。

3.2.5MSCs-Exo創(chuàng)面修復(fù)臨床前研究及臨床應(yīng)用

MSCs-Exo可有效抑制異常創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，目前市面上存在多種包含外泌體的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。如直接將間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體提純后制成水凝膠，緩慢釋放可用于創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕治療[41]；將人臍帶MSCs-Exo、表皮生長因子和透明質(zhì)酸鈉配合，可用于創(chuàng)面修復(fù)及美容去瘢[42]；添加纖連蛋白、VEGF、纖維芽細(xì)胞生長因子、上皮細(xì)胞生長因子、HGF、TGF、1-磷酸鞘氨醇、神經(jīng)酰胺-1-磷酸，制成包含外泌體的復(fù)合物，同樣具有不錯的創(chuàng)面修復(fù)效果[43]；將外泌體制成凍干粉，可更加長久地發(fā)揮其生物活性；同時，將外泌體加入粘貼材料，制成敷貼，貼附于壓瘡皮膚，可降低創(chuàng)面組織中肌成膠原纖維細(xì)胞數(shù)量，并調(diào)節(jié)Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白及高遷移率族蛋白1(HMGB1)、TGF-β表達(dá)水平，動態(tài)調(diào)控創(chuàng)面愈合過程[44]；將芭花、洋甘菊、金縷梅、海藻酸鹽等成分與MSCs-Exo制作成為復(fù)合物，可加速創(chuàng)面止血過程，促進(jìn)損傷修復(fù)，同時具有抗炎抑菌、止癢、保濕等效果，加速創(chuàng)面愈合[45]。

4 小 結(jié)

皮膚損傷是臨床常見疾病之一，我國整體創(chuàng)面發(fā)生率呈上升趨勢，糖尿病、血液循環(huán)障礙等原因?qū)е碌穆詣?chuàng)面逐漸增多。炎癥反應(yīng)期延長引起組織血液灌注不足及缺血性損傷，可能是創(chuàng)面難愈的重要原因。創(chuàng)面異常炎癥反應(yīng)是臨床上慢性難愈合創(chuàng)面治療的主要靶點(diǎn)之一， MSCs-Exo可有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，減少中性粒細(xì)胞的浸潤和激活，抑制樹突狀細(xì)胞活化并誘導(dǎo)耐受，減少皮損中肥大細(xì)胞數(shù)量，抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增殖，加速活化T淋巴細(xì)胞的凋亡，上調(diào)抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞比例，誘導(dǎo)免疫耐受，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷移，調(diào)節(jié)膠原沉積類型，促進(jìn)血管生成，增加IL-10、TGF-β等抗炎因子的分泌，減少TNF-α、IL-1α等炎癥因子的分泌多途徑發(fā)揮抗炎作用，縮短創(chuàng)面炎癥反應(yīng)時間，加速創(chuàng)面愈合，并預(yù)防瘢痕形成。MSCs-Exo作為創(chuàng)面修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，既可保留MSCs的功能特性，同時具有更低的免疫原性與更高的安全性，有望成為一種極具前景的創(chuàng)面修復(fù)治療方式，且臨床上目前已存在針對創(chuàng)面修復(fù)的多種包含外泌體的醫(yī)療產(chǎn)品。明確MSCs-Exo臨床應(yīng)用安全性、劑量、療程與創(chuàng)面炎癥嚴(yán)重程度及持續(xù)時間的關(guān)系，明確其在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)、不良反應(yīng)發(fā)生及如何批量獲取與儲存MSCs-Exo均為MSCs-Exo臨床應(yīng)用需要首先解決的問題，需要開展更多多中心及大樣本的隨機(jī)對照試驗(yàn)和臨床研究來明確。