內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究進(jìn)展*

張 嬌 綜述，宋少裕，王 釗，周立宇，呂長亮，李南南，毛 輝 審校

(1.吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院/湘西自治州人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 吉首 416000；2.湖南省湘西土家族苗族自治州鳳凰縣吉信鎮(zhèn)衛(wèi)生院，湖南 416200)

膠質(zhì)瘤是一種極具侵襲性的腦腫瘤，臨床上治療非常有限，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)切除聯(lián)合放化療。由于無法通過手術(shù)清除所有腫瘤細(xì)胞，加上對治療的抵抗(血-腦屏障對化療藥物的阻礙)，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的高復(fù)發(fā)率和低生存率，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的生存期僅為12～15個(gè)月，5年生存率不足5%。與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞為了激活致瘤信號通路及對抗宿主的腫瘤抑制機(jī)制，會增加蛋白質(zhì)合成并進(jìn)行一些代謝修飾，這種合成活動大部分發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。然而，腫瘤細(xì)胞不斷暴露于細(xì)胞內(nèi)DNA損傷和修復(fù)應(yīng)激，以及其他細(xì)胞外損傷，因此加大了出現(xiàn)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)紊亂的風(fēng)險(xiǎn)。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)概述

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)分泌途徑的重要場所，負(fù)責(zé)脂類和蛋白質(zhì)合成及鈣離子依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，正常生理情況下正確折疊的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到指定部位發(fā)揮作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能可被各種病理和生理刺激所破壞，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧、低葡萄糖、氨基酸饑餓、生長因子缺乏、乳酸中毒、氧化應(yīng)激和病毒感染等環(huán)境時(shí)，蛋白質(zhì)翻譯和分泌增加，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，從而導(dǎo)致ERS的發(fā)生，激活非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[1]。UPR不斷監(jiān)視著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊情況，必要時(shí)啟動反作用措施以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于一定的ERS狀態(tài)下，穩(wěn)態(tài)的UPR不僅通過減少合成新蛋白質(zhì)和增加蛋白質(zhì)折疊來應(yīng)對應(yīng)激，還可以通過ERS使相關(guān)蛋白降解或自噬來減少錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，從而降低蛋白質(zhì)的毒性。然而，當(dāng)過度應(yīng)激超過UPR的監(jiān)控能力時(shí)，受損細(xì)胞通過激活UPR啟動細(xì)胞凋亡程序[2-3]。

UPR由3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白：RNA依賴蛋白酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需求酶α1(IRElα)、和活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6))觸發(fā)的不同信號通路組成(包括PERK-eIF2α-ATF4，IRE1α-XBP1和ATF6通路)。伴侶蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)/GRP78位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，是ERS的中樞傳感器。在生理?xiàng)l件下BiP/GRP78與3個(gè)傳感器PERK、IRE1、ATF6處于結(jié)合失活狀態(tài)，發(fā)生ERS時(shí)，BiP/GRP78從3個(gè)跨膜蛋白組成的復(fù)合物中釋放，隨后激活相應(yīng)的UPR通路以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[4]。這是通過抑制蛋白合成，胞質(zhì)中的蛋白酶體刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)，以及上調(diào)伴侶蛋白和折疊酶的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞無法應(yīng)對ERS時(shí)，就會激活轉(zhuǎn)錄因子乙酰膽堿脂酶同源蛋白(C/EBP-CHOP)來誘發(fā)凋亡[5-6]。

2 ERS的信號通路

2.1PERK信號通路 PERK是一種跨膜蛋白，具有N端應(yīng)激敏感結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)激活結(jié)構(gòu)域。PERK的主要底物是真核生物翻譯啟動因子2α(eIF2α)。在ERS時(shí)，磷酸化的eIF2α阻止eIF2-GTP-Met-tRNA三元復(fù)合物的結(jié)合而抑制mRNA的翻譯，此外，PERK和BiP分離使PERK自磷酸化，從而導(dǎo)致eIF2α磷酸化來抑制蛋白質(zhì)的翻譯，XBP1使蛋白合成被抑制，從而阻止ERS中錯(cuò)誤折疊蛋白的進(jìn)一步積累。同時(shí)反常地增加了一些在5′端上游開放閱讀框mRNA的翻譯，如ATF4。ATF4是一種轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊、氧化應(yīng)激、自噬和氨基酸代謝。然而，如果ERS仍未解決，持續(xù)的PERK激活將導(dǎo)致C/EBP-CHOP轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)，并增加Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-8]。

2.2IRE1信號通路 IRE1是真核細(xì)胞中一種保守的跨膜蛋白，在ERS中起重要作用。正常情況下，IRE1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的GRP78結(jié)合，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，IRE1通過自磷酸化被激活，表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性，切除IRFE1信號通路下游分子(XBP1)堿基，生成活性剪接體(XBP1s)，調(diào)控ERAD活性基因的激活、蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜擴(kuò)張[9]。IRE1還被發(fā)現(xiàn)通過招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2 (TRAF2) 激活JUN N端激酶(JNK)， JNK磷酸化并抑制Bcl-2、Bcl-xL的抗凋亡活性，或激活BIM、BID的促凋亡功能來啟動細(xì)胞凋亡途徑[10]。

2.3ATF6信號通路 ATF6是一種跨膜轉(zhuǎn)錄蛋白，具有2種亞型：ATF6α和ATF6β。但ATF6被激活時(shí)，ATF6α移位到高爾基體被當(dāng)?shù)氐牡鞍譙1P和S2P切割，生成細(xì)胞質(zhì)片段ATF6f 遷移至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)ERAD和XBP1基因的轉(zhuǎn)錄[11]。UPR還與自噬相關(guān)，自噬是細(xì)胞分解代謝的一個(gè)主要過程，其將大量蛋白質(zhì)聚集物和受損的細(xì)胞器隔離，并在自噬小體中降解，自噬作為另一種EDRA機(jī)制，與3個(gè)UPR信號通路緊密相關(guān)[12]。

3 ERS在膠質(zhì)瘤中的作用

3.1膠質(zhì)瘤中的PERK信號 當(dāng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞處于缺氧或葡萄糖缺乏時(shí)PERK表達(dá)增加。腫瘤細(xì)胞處于缺氧的微環(huán)境時(shí)，通常傾向于糖酵解而不是氧化磷酸化作為其主要的能量產(chǎn)生途徑。糖酵解的第一個(gè)關(guān)鍵酶——己糖激酶II (HK2)在膠質(zhì)瘤中大量表達(dá)，功能依賴于Akt的激活，允許HK2轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體外膜，并誘導(dǎo)從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉(zhuǎn)變。有研究表明，Akt的磷酸化可以通過PERK的激活來調(diào)節(jié)。沉默的PERK可以通過阻斷Akt和HK2線粒體轉(zhuǎn)位降低低糖應(yīng)激條件下ATP和乳酸的產(chǎn)生，從而增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡[13]，強(qiáng)調(diào)了PERK在腫瘤形成中的必要性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白BiP/GRP78和ATF4在GBM細(xì)胞系中的表達(dá)水平與增殖率呈正相關(guān)，研究表明GBM患者和U87來源的小鼠異種移植中BiP/GRP78和UPR轉(zhuǎn)錄因子水平均升高，特別是PERK通路最活躍，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PERK的沉默抑制了腫瘤的進(jìn)展[14]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)獲得轉(zhuǎn)移潛能，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動性和細(xì)胞死亡抗性。EMT細(xì)胞通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和MMP7，有規(guī)律地激活UPR的PERK通路，此外，其還增強(qiáng)了轉(zhuǎn)移相關(guān)溶酶體相關(guān)膜糖蛋白3 (LAMP3)基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞中絲狀偽足的形成，并誘導(dǎo)細(xì)胞黏附，這是腫瘤細(xì)胞外滲和膠質(zhì)瘤整體進(jìn)展所必需的[15]。

3.2膠質(zhì)瘤中的IRE1信號 研究表明，IRE1可以改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到核信號1(ERN1)的特性，并可能參與腫瘤發(fā)生，IRE1/XBP1軸可降低成熟細(xì)胞對低氧誘導(dǎo)死亡的敏感性[4]。IRE1信號通路還通過激活B細(xì)胞的核因子κB(NF-κB)光鏈增強(qiáng)子及調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-6 (IL-6)和IL-1β的分泌，參與促腫瘤性炎癥，從而在炎癥相關(guān)的膠質(zhì)瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。研究證明，IRE1信號在腫瘤侵襲性中起到重要作用，ERN1基因的P336 L突變在膠質(zhì)瘤中最常見。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到缺氧等外源性應(yīng)激時(shí)，ERS傳感器IRE1激活并上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)，而缺少IRE1基因的腫瘤細(xì)胞無法誘導(dǎo)VEGF-A表達(dá)，并且在體內(nèi)缺乏足夠的腫瘤生長和新血管生成[16]。IRE1低表達(dá)的膠質(zhì)瘤小鼠中，腫瘤新生血管和血液供應(yīng)減少，生長速度下降，存活率增加[17]。另外，IRE1被證明能促進(jìn)正常上皮細(xì)胞的遷移，提示其可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中起作用，XBP1信號通路可促進(jìn)免疫細(xì)胞的生長和腫瘤浸潤，并增加腫瘤侵襲標(biāo)志物的表達(dá)[18]。這一證據(jù)表明，IRE1依賴的信號在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有利于膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

3.3膠質(zhì)瘤中的ATF6信號 研究還表明，ATF6可被VEGF激活，提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，有助于腫瘤微環(huán)境的形成[19]。在膠質(zhì)瘤中已經(jīng)觀察到磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/雷帕霉素復(fù)合物1 (PI3K/Akt/ mTOR)通路的激活，可進(jìn)一步增加VEGF分泌，VEGF隨后通過磷酸肌苷磷脂酶Cγ (PLCγ)介導(dǎo)干擾mTORC1復(fù)合物[20]，激活UPR的ATF6和PERK分支。另一方面，ATF6下調(diào)可抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成[20]，提示UPR與VEGF信號通路在調(diào)控血管生成和塑造腫瘤微環(huán)境中有重要作用。

4 ERS為膠質(zhì)瘤治療提供可能靶點(diǎn)

UPR治療GBM可以從以下2點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)。一方面，可以將應(yīng)激增加到某一臨界點(diǎn)，超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的維持能力，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面，利用藥物通過抑制UPR反應(yīng)的3條通路之一來殺死癌細(xì)胞，阻止ERS的促腫瘤細(xì)胞生長功能。

4.1UPR傳導(dǎo)信號誘導(dǎo)劑 誘導(dǎo)UPR信號傳導(dǎo)的藥物可分為一般UPR激活劑和選擇性GRP78、ATF6和PERK誘導(dǎo)劑。一般UPR激活劑可以激活UPR的所有通路。

三角胍型倍半萜類自由基(RAD)通過誘導(dǎo)PERK、IRE1和ATF6信號通路的激活，上調(diào)UPR。經(jīng)過RAD的處理可導(dǎo)致eIF2α磷酸化增加，以及激活CHOP和ATF4表達(dá)，活化eIF2α-ATF4-CHOP通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]，提示RAD通過ERS依賴通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。經(jīng)選擇性5 -羥色胺再攝取抑制劑氟西汀(FLT)處理后的大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株，F(xiàn)LT激活CHOP及其下游效應(yīng)基因GADD34，增強(qiáng)了PERK和eIF2α的自動磷酸化，激活PERK-eIF2α-ATF4和ATF6級聯(lián)反應(yīng)，降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。同時(shí)FLT與替莫唑胺(TMZ)聯(lián)合可協(xié)同作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，是目前膠質(zhì)瘤化療的“金標(biāo)準(zhǔn)”[22]。吉非替尼誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤凋亡與GRP78、ATF4和CHOP蛋白表達(dá)升高，PERK、eIF2α與IRE1蛋白磷酸化，ATF6蛋白水解呈正相關(guān)，這些分子是ERS的重要標(biāo)志[23]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，蟾毒毒素中存在的蟾硫酮通過ERS誘導(dǎo)效應(yīng)導(dǎo)致U87和U373 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡，與TMZ共同作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，對腫瘤生長具有協(xié)同作用[24]。

有研究用抗表面定位GRP78的多克隆N-20抗體處理異種移植GBM小鼠的GBM細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)N-20抗體可通過抑制表面GRP78的功能來抑制癌細(xì)胞的存活和生長[25]。

GRP78和GPRP94等蛋白的過表達(dá)可提高膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)的抗輻射能力，用ERS誘導(dǎo)藥物2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)照射GSCs，通過CHOP誘導(dǎo)凋亡進(jìn)一步下調(diào)GSCs的活性，發(fā)現(xiàn)其活性呈劑量依賴性[27]。

在ERS下，誘導(dǎo)ATF6的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，然后釋放到細(xì)胞核中，其通過促進(jìn)ATF6調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。小分子蛋白穩(wěn)定調(diào)節(jié)因子147和263通過與調(diào)控蛋白[包括BiP和蛋白二硫化物異構(gòu)酶I (PDI)]相互作用間接增強(qiáng)ATF6的激活，這些調(diào)控蛋白能夠啟動ATF6向高爾基體的易位。另一方面，像147和263這樣的化合物可能通過靶向或模仿參與ATF6通路激活的其他分子來誘導(dǎo)ATF6活性[28]。

使用eIF4E/eIF4G相互作用抑制劑1 (4EGI-1)可誘導(dǎo)PERK磷酸化和XBP1 mRNA的表達(dá)，且呈劑量依賴性。還觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的形態(tài)學(xué)改變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放增加和CHOP蛋白上調(diào)，提示4EGI-1的抗癌作用與ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[29]。

4.2UPR抑制劑 一些化合物在體外和體內(nèi)膠質(zhì)瘤模型中均表現(xiàn)出選擇性抑制UPR的作用，從而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)化。小分子16F16是一種ATF6抑制劑，通過阻斷其靶點(diǎn)PDIA、16F16使細(xì)胞無法從應(yīng)激的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出ATF6， UPR不能對高ERS做出反應(yīng)[30]。

最近有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SCD1抑制劑CAY可引起IRE1信號介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，經(jīng)CAY治療異種移植小鼠模型的存活率增加， SCD1也被發(fā)現(xiàn)在ERS時(shí)期上調(diào)，以幫助緩解ERS并保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[31]。GSK2656157是PERK磷酸化抑制劑相關(guān)藥物，在膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤中均表現(xiàn)出抗血管生成和抗腫瘤作用[32]。

4.3作用于蛋白質(zhì)生成的小分子干擾劑 JLK1486是一種新的ERS誘導(dǎo)劑，可干擾蛋白質(zhì)折疊所需的二硫鍵形成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的積累，增加ERS并激活UPR。在缺氧、營養(yǎng)缺乏和低pH的環(huán)境中，伴隨著UPR激活的持續(xù)，其會導(dǎo)致促凋亡轉(zhuǎn)錄因子、ATF4和CHOP的上調(diào)，升高BiP/GRP78水平。因此，通過JLK1486進(jìn)一步增加ERS不利于腫瘤細(xì)胞的生存[33]。N-連接糖基化(NLG)抑制劑，如衣霉素(TUN)，在U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，通過抑制表皮生長因子(EGFR)的糖基化，從而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞對輻射敏感[17]。NLG抑制劑已在D54和U87MG膠質(zhì)瘤異種移植瘤模型中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

BFA是由一種青霉菌產(chǎn)生的高爾基體干擾物，已經(jīng)被證明會干擾高爾基體內(nèi)的蛋白質(zhì)成熟，從而捕獲異常蛋白并誘導(dǎo)ERS，BFA通過降低膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的表達(dá)來降低膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能[34]。

蛋白酶體抑制劑(PI)可引起異常蛋白的積累和ERS的升高，在體外膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒性作用[35]。有報(bào)道稱，PI奈非那韋和阿塔贊韋通過蛋白酶體抑制和上調(diào)控制UPR的關(guān)鍵分子來誘導(dǎo)UPR，奈非那韋與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)聯(lián)合使用，可進(jìn)一步激活膠質(zhì)瘤的UPR和凋亡[36]。

4.4引起鈣離子耗竭因子 有證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子耗竭的延長通過干擾伴侶蛋白的功能和蛋白質(zhì)的成核而引起蛋白質(zhì)的展開。因此，黃酮類化合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子 ATP酶(SERCA)抑制劑、鹽霉素等鈣離子耗竭因子可能能夠增加UPR反應(yīng)，導(dǎo)致其促凋亡途徑的激活[36]。

5 小結(jié)與展望

UPR是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，當(dāng)細(xì)胞無法維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定時(shí)被激活，為了緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積，UPR啟動自適應(yīng)輸出，減少蛋白質(zhì)折疊負(fù)荷，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌通路恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的能力。然而，當(dāng)這種糾正措施不能恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)時(shí)，UPR會促發(fā)死亡信號的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。膠質(zhì)瘤癌細(xì)胞內(nèi)存在許多威脅蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的因素(缺氧、營養(yǎng)剝奪、蛋白酶體功能障礙、分泌途徑需求增加及客戶蛋白的體細(xì)胞突變)，往往導(dǎo)致UPR過度激活。目前，關(guān)于UPR誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的研究揭示了一些可以用來操縱ERS反應(yīng)的未知機(jī)制，用其來對抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤的治療開啟了新的篇章，使用UPR調(diào)控藥物作為單一療法或與化療和放療聯(lián)合使用，提高腫瘤對當(dāng)前治療的敏感性，有可能延長膠質(zhì)瘤患者的預(yù)期壽命。但是，因?yàn)槟壳暗难芯看蠖鄶?shù)都是基于體外和臨床前研究，未來的研究還需要在體內(nèi)或臨床環(huán)境中測試不同藥物的作用，以更好地評估UPR的靶向效應(yīng)。總之，仍需要廣泛的研究來深入了解UPR的生理學(xué)及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)中的作用，以克服UPR靶向藥物的局限性和不良反應(yīng)。