靜電紡緩釋抗菌納米纖維的制備及抗菌性能研究

魏娜，張金珊，張金虎，劉芮銘，張正健，周云令，趙亞珠

（1.天津職業(yè)大學(xué) 包裝與印刷工程學(xué)院，天津 300410；2. 天津科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

纖維素作為一種來源廣泛、地球上最豐富的天然聚合物，受到了越來越廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[1-2]。采用纖維素制成的納米纖維功能性材料常被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物、工業(yè)等多個領(lǐng)域，其中結(jié)合抗菌劑制成的抗菌材料在食品包裝方面也被廣泛關(guān)注[3-4]。植物精油作為抗菌劑，具有綠色無污染、毒性低、易揮發(fā)、活性較高和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢[5]，但將其應(yīng)用在包裝材料時需要對其釋放速度加以控制，否則易出現(xiàn)精油釋放過快問題，從而導(dǎo)致在短時間內(nèi)包裝中精油的有效成分過高。這樣雖然能延長食品的貨架期，但是可能會引發(fā)食品安全問題[6]。由此，人們?yōu)榱碎_發(fā)新型包裝材料，將精油封裝到天然聚合物中，使其具有受控釋放、改善穩(wěn)定性和防止降解等優(yōu)點。在眾多封裝技術(shù)中，靜電紡絲可以在室溫下通過天然聚合物包裹精油制造食品包裝用納米/微米級材料[3,7-8]。通過對比發(fā)現(xiàn)，如果精油被緊密地封裝在聚合物中，無法實現(xiàn)對釋放速率的控制，現(xiàn)有研究中主要通過添加增孔材料等方式來控制精油的釋放速率[9]。文中將納米纖維素水凝膠[10]作為天然聚合物，實現(xiàn)對精油的包裹，且對致密的聚乙烯醇表面形成裂紋孔隙[11-13]，從而達(dá)到緩釋的目的。

1 實驗

1.1 材料

主要材料：納米纖維素水凝膠（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，粒徑為349.7 nm），實驗室自制；1788 型聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol，PVA），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；百里香精油（Thyme Oil，TEO），吉安市青原區(qū)綠源天然香料油提煉廠。

1.2 設(shè)備

主要設(shè)備：JDFSS-2 型靜電紡絲機，自主研發(fā)；FA25model 高速剪切機，弗魯克流體機械制造公司；DV2T 的旋轉(zhuǎn)式黏度計，BROOKFIELD 美國公司；JYW-200D 表面張力儀，承德市科承試驗機有限公司；DDS-307 電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；Delsa Nano 納米粒度分析儀，美國貝克曼庫爾特公司；FPA 型Zeta 電位儀，德國AFG 有限公司；JSM-IT300LV 型掃描電子顯微鏡，日本電子公司；Talos F200X G2 型透射電子顯微鏡，Thermo Fisher Scientific 公司；GCMS-QP2010 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津國際貿(mào)易有限公司；MEA1504-014型恒溫培養(yǎng)箱，巨孚儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靜電紡絲液的制備及其性能測試

首先將固含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為1%的納米纖維素水凝膠[14]與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的聚乙烯醇水溶液，按照質(zhì)量比3 ∶4 混合均勻；然后按照紡絲液總質(zhì)量的4%～10%添加百里香精油，并在1 000 r/min 下高速剪切10 min，使精油均勻乳化分散，經(jīng)離心消泡后得到紡絲液。對得到的紡絲液進行性能測試，具體測試方法如下[15]。

1）黏度。采用旋轉(zhuǎn)黏度計中的LV-4（64）轉(zhuǎn)子進行測試，測試時間為1 min，重復(fù)測試3 次，取平均值。

2）電導(dǎo)率。采用電極電導(dǎo)率測量法，電導(dǎo)率常數(shù)為0.997，并用溫度計測量待測樣品的溫度，開始測量時將溫度輸入儀器中，將導(dǎo)電棒浸入待測樣品中，待溫度穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)，重復(fù)測試3 次，取平均值。

3）表面張力。首先對待測液體的密度進行測定，將液體密度輸入設(shè)備進行表面張力測量，重復(fù)測試3次，取平均值。

4）粒徑。先將待測樣品在去離子水中進行稀釋，在稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%后再進行測量，重復(fù)測試3次，取平均值。

5）Zeta 電位和電位絕對值。先將待測樣品在去離子水中進行稀釋，在稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%后，將稀釋后的溶液超聲分散，然后進行測試，重復(fù)測試3 次，取平均值。

1.3.2 靜電紡絲納米纖維的制備

使用靜電紡絲機設(shè)備，在設(shè)定紡絲條件（電壓為16 kV，紡絲速率為0.8 mL/h，紡絲距離為11 cm，針頭內(nèi)直徑為0.7 mm，接收裝置為滾筒）下制備納米纖維[16-19]。

1.3.3 掃描電子顯微鏡

采用日本電子公司的JSM-IT300LV 型掃描電子顯微鏡（SEM）觀察分析靜電紡絲納米纖維的形貌，然后采用Image J 軟件在樣品圖像上隨機采樣50 個，取其平均值，從而得到納米纖維的平均直徑，并分析納米纖維直徑的分布情況。

1.3.4 透射電子顯微鏡

使用400 目銅網(wǎng)接收納米纖維，采用Thermo Fisher Scientific 公司的Talos F200X G2 型透射電子顯微鏡（TEM）分析納米纖維的透射電鏡測試結(jié)果。

1.3.5 緩釋性能測試

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對百里香精油的主要成分百里香酚進行檢測，通過峰面積來表征精油的釋放量[20]。

將制備的納米纖維放入頂空瓶中，并進行密封。將頂空瓶在同一條件下保存，在1 個周期內(nèi)（此次實驗為20 d）每2 d 對頂空瓶內(nèi)的氣體進行氣相分析，每組樣品的實驗條件、實驗參數(shù)均保持一致，測試條件與百里香酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析一致。

1.3.6 抗菌性能測試

此次實驗以黑曲霉、橘青霉、大腸桿菌、金黃葡萄球菌為供試菌種，在90 mm 的培養(yǎng)基內(nèi)進行抗菌實驗。首先，將配置好的乳液采用靜電紡絲制備納米纖維，將制備的納米纖維裁成直徑為6 mm 的圓形片，并以6 mm 空白鋁箔片為空白對照組，然后進行抗菌實驗。每組樣品設(shè)置3 個平行樣，將霉菌組的培養(yǎng)基置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中36 h，將細(xì)菌組的培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，觀察培養(yǎng)基上菌落的生長情況和抗菌圈直徑，并記錄、測量[21-22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜電紡絲液的性能分析

靜電紡絲過程中的影響因素主要為溶液性質(zhì)和紡絲條件。其中，溶液性質(zhì)（例如黏度、電導(dǎo)率、表面張力、粒徑）對所制備的納米纖維有較大影響，因此對其進行測試分析。這里針對4 種不同百里香精油含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、6%、8%、10%）紡絲液的黏度進行了測量，具體數(shù)據(jù)見圖1a。從圖1a 中可以看出，隨著百里香精油用量的增加，紡絲液的黏度也隨之增大。這是由于加入百里香精油后，它與聚乙烯醇分子間的相互作用力逐漸增強，分子間的纏結(jié)力也逐漸增強[23]。

精油含量的增加對紡絲液表面張力的影響見圖1b。從圖1b 中可以看出，增加百里香精油的用量可以提高紡絲液的表面張力，但是其變化趨勢不明顯。在精油濃度較低的情況下，聚合物間的相互作用較弱，表面張力也隨之減小。在靜電紡絲過程中，射流的形成主要依靠電場力的動力，當(dāng)電場力大于表面張力時，乳液才會形成穩(wěn)定的射流，才能順利完成紡絲[23]。

精油含量的增加對紡絲液電導(dǎo)率的影響見圖1c。從圖1c 中可以看出，隨著百里香精油含量的增加，導(dǎo)電率也呈現(xiàn)上升趨勢，但變化趨勢不明顯。在靜電紡絲過程中，聚合物溶液受到靜電斥力的拉伸作用，會產(chǎn)生聚合物微小射流，進而固化形成纖維，高電導(dǎo)率的聚合物受到的電場力作用更大[24]。

精油含量的增加對紡絲液粒徑的影響見圖1d。不同的百里香精油含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、6%、8%、10%）對應(yīng)的平均粒徑分別為368.8、375.3、371.4、394.4 nm，從這些數(shù)據(jù)可以看出，增加百里香精油的用量可以提高紡絲液的顆粒直徑，分布曲線均呈現(xiàn)單峰，顆粒直徑為100～600 nm，表明紡絲液的顆粒分散性較好、大小均一。當(dāng)百里香精油的含量增加時，顆粒直徑逐步增大，但是當(dāng)精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到10%時，顆粒直徑突然增大，說明百里香精油的含量對顆粒直徑有較大的影響[25]。

加入百里香精油后紡絲液的Zeta 電位值和Zeta電位絕對值見圖1e。研究表明，Zeta 電位的絕對值為30～60 mV 時，乳液呈穩(wěn)定狀態(tài)，絕對值越大則體系越穩(wěn)定。從圖1e 中可以看出，不同百里香精油含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、6%、8%、10%）對應(yīng)的Zeta 電位絕對值為40～50 mV，說明紡絲液呈穩(wěn)定狀態(tài)[26]。

圖1 靜電紡絲液各項性能測試Fig.1 Performance test of electrospinning solution

2.2 靜電紡絲納米纖維形貌分析

在保證靜電紡絲過程中工藝參數(shù)不變的情況下，研究了百里香精油的含量變化對納米纖維形貌的影響。4種精油含量的紡絲液所制備的納米纖維的形貌如圖2所示。從圖2 中可以看出，在工藝參數(shù)條件一定的前提下，隨著百里香精油含量的增加，納米纖維的直徑也隨著增大。在百里香精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、10%時，納米纖維拉伸不均勻，且出現(xiàn)了部分?jǐn)嗔熏F(xiàn)象。同時發(fā)現(xiàn)，在百里香精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%、8%時，納米纖維的均勻性達(dá)到相對最好的狀態(tài)。主要原因：精油的含量過高或過低，均會對紡絲液的物理性能造成影響，進而對納米纖維的表面形態(tài)造成影響。同時還發(fā)現(xiàn)，4 種精油含量的納米纖維表面均出現(xiàn)了不規(guī)則裂紋，而未添加納米纖維素水凝膠的納米纖維（如圖3 所示）并未出現(xiàn)此現(xiàn)象，說明納米纖維素水凝膠的加入使得納米纖維表面出現(xiàn)了裂紋，從而達(dá)到了精油可控釋放的目的。

圖2 精油含量不同的靜電紡絲納米纖維SEM 圖Fig.2 SEM image of electrospun nanofibers with different essential oil content

圖3 未添加纖維素納米纖維紡絲液靜電紡絲納米纖維SEM 圖Fig.3 SEM image of electrospun nanofibers without cellulose nanofiber spinning solution

不同精油含量的靜電紡絲納米纖維透射電鏡圖見圖4。由圖4 可知，纖維的分布較均勻，未出現(xiàn)精油聚集現(xiàn)象。說明將聚乙烯醇、纖維素納米纖維和百里香精油混合均勻，隨著精油含量的增加，納米纖維的直徑呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。

圖4 精油含量不同的靜電紡絲納米纖維TEM 圖Fig.4 TEM image of electrospun nanofibers with different essential oil content

2.3 靜電紡絲納米纖維的緩釋性能分析

通過氣相色譜質(zhì)譜分析百里香精油的主要化學(xué)成分和總離子流圖，如圖5 所示。結(jié)果表明，百里香精油中主要含有4 種物質(zhì)：百里香酚、臨異丙基苯甲烷、反式香葉醇、松油醇等。百里香酚是含量最多的成分，也是百里香精油的主要抗菌成分，出峰時間為17.5 min[17]。

圖5 百里香精油的總離子流圖Fig.5 GC chromatogram of thyme essential oil

百里香精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、6%、8%、10%時，納米纖維中的百里香酚在1 個周期內(nèi)（20 d）的釋放面積曲線見圖6。每2 d 對百里香酚的釋放面積進行測定，隨著時間的延長，百里香酚的出峰面積隨之增大，在14～16 d 時達(dá)到最大釋放量。通過查閱文獻(xiàn)可知，百里香精油直接釋放百里香酚會在第8 天達(dá)到最大釋放量[27]。由此可知，通過靜電紡絲技術(shù)將百里香精油進行包裹制備的納米纖維可以有效減緩百里香酚的釋放速率，從而有效延長水果的貨架期。

圖6 百里香酚出峰面積隨時間變化的情況Fig.6 Variation of thymol peak area with time

2.4 靜電紡絲納米纖維的抗菌實驗

此次實驗以黑曲霉、橘青霉、大腸桿菌、金黃葡萄球菌為供試菌種。實驗結(jié)果表明，放置納米纖維組均對菌種表現(xiàn)出抑制作用，且隨著百里香精油含量的增加，抗菌圈直徑也逐漸增大。不同精油含量下霉菌和細(xì)菌的抗菌圈直徑見表1。從表1 可以看出，百里香精油對霉菌和細(xì)菌的抗菌效果都較明顯，且隨著百里香精油含量的增加，抗菌效果越明顯。這是因為百里香精油中的有效成分——百里香酚的抗菌性較強，它可以抑制菌落的生長。

表1 不同精油含量下霉菌和細(xì)菌的抗菌圈直徑Tab.1 Diameter of inhibition zone of mold and bacteria under different content of essential oil mm

3 結(jié)語

將納米纖維素水凝膠、聚乙烯醇水溶液和百里香精油按照一定比例制備紡絲液，通過測試紡絲液的黏度、表面張力、電導(dǎo)率和粒徑等，分析了百里香精油含量對納米纖維形態(tài)的影響。

在紡絲條件和外部條件一定時，隨著紡絲液中百里香精油含量的增加，納米纖維的形態(tài)和直徑也隨之變化，在百里香精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%和10%時，納米纖維拉伸不均勻，且纖維出現(xiàn)了部分?jǐn)嗔熏F(xiàn)象。同時發(fā)現(xiàn)，在精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時，納米纖維的均勻性達(dá)到最佳狀態(tài)，此時納米纖維的直徑為137.5 nm。

氣相色譜質(zhì)譜分析儀的結(jié)果表明，采用靜電紡絲法將百里香精油包裹在納米纖維中，其中的百里香酚在14～16 d 時達(dá)到最大釋放量，而百里香精油直接釋放百里香酚在第8 天達(dá)到最大釋放量。在抗菌實驗中，納米纖維對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、黑曲霉和橘青霉均有持續(xù)的抑制作用，其抑制作用隨著百里香精油含量的增加而增強。