基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)的二至丸入血入腦成分分析

林雪，薛傲，徐艷明，孫琪，徐紅丹，，薛慧，楊波*，張寧，*（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 50040；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 54007）

二至丸由墨旱蓮、女貞子兩味藥組成，具有補益肝腎、滋陰止血的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，二至丸在抗衰老、益智等方面作用顯著[1]，能夠治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）[2]，但其發(fā)揮藥效的活性成分尚未明確。UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)以其高分辨率、高質(zhì)量精度的特點，在中藥成分定性定量分析領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢[3]。藥物轉(zhuǎn)運到作用部位才能發(fā)揮作用，吸收入血尤其入腦的成分可能是二至丸治療AD 的潛在藥效成分。目前對于二至丸入血入腦成分的研究相對較少，基于此，本實驗運用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)對給予二至丸的D-半乳糖（D-gal）模型大鼠的體內(nèi)成分進行分析，以期闡明二至丸治療AD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Dionex UltiMate 3000 戴安高效液相色譜儀，Q-Exactive Focus 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Bionoon-VAC1型真空濃縮儀（上海般諾生物科技有限公司）；Mikro 200R 型離心機（德國 Hettich 公司）。女貞子（酒）、墨旱蓮[北京同仁堂，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)陳效忠副教授鑒定符合2020年版《中國藥典》要求]。HPLC 級甲醇（美國Dikma 公司）；HPLC 級乙腈（美國Fisher 公司）；HPLC 級甲酸（美國Tedia 公司）。D-gal（上海吉至生化科技有限公司，批號：D96420，純度99%）。紅景天苷（批號：B20504）、特女貞苷（批號：B21240）、木犀草素（批號：A0108）、蟛蜞菊內(nèi)酯（批號：B20934）、芹菜素（批號：B20981）、齊墩果酸（批號：BP1026）（上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%）。

1.2 動物

SD 大鼠，雌性，SPF 級，12 只，210～250 g [黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK（黑）2018-004]。

2 方法

2.1 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 檢測條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35℃，流速0.3 mL·min－1，進樣量5 μL，流動相為0.1%的甲酸-水（A 相）和0.1%的甲酸-乙腈（B 相），梯度洗脫（0～3.5 min，5%～15%B；3.5～6.5 min，15%～30%B；6.5～12.5 min，30%～70%B；12.5～18 min，70%～100%B）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），采用正、負(fù)離子檢測模式；掃描范圍m/z50～1500 Da；噴霧電壓（＋）3.5 kV，（－）3.2 kV；離子傳輸管溫度320℃，AUG 氣體加熱溫度350℃；碰撞能量20、40、60 eV；鞘氣40 psi，輔助氣20 psi，吹掃氣10 psi；RF 鏡頭振幅（s-lens）60；分辨率一級高分辨質(zhì)譜70 000 FWHM，二級高分辨質(zhì)譜17 500 FWHM；動態(tài)排除時間5 s。

2.2 二至丸樣品及體外對照品溶液的制備

女貞子（酒）、墨旱蓮1∶1 比例混合，加入10 倍量的水，煎煮2 h，收集濾液，殘渣加等量水繼續(xù)煎煮1 h，過濾后合并濾液，濃縮成1 g·mL－1（以生藥量計）的藥液。取上述藥液適量加70%的甲醇溶液稀釋10 倍，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得二至丸樣品溶液。

精密稱定紅景天苷、特女貞苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素、齊墩果酸對照品各1 mg于量瓶中，以70%甲醇稀釋10 倍，配成0.1 mg·mL－1的對照品溶液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得體外對照品溶液。

2.3 血液、腦脊液樣品的采集和前處理

SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量隨機分為模型組、空白組，每組6 只，連續(xù)4 周模型組腹腔注射D-gal 250 mg/（kg·d），空白組腹腔注射等量的生理鹽水。實驗前禁食12 h，正常飲水，模型組灌胃給予二至丸藥液4.86 g·kg－1，給藥后60 min，微量乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，3000 r·min－1離心10 min，取上清置－80 ℃冰箱保存。取血后，固定大鼠頭部，75%乙醇對頸后部皮膚消毒，微量輸液針從枕骨大孔刺入小腦延髓池，抽取腦脊液于預(yù)冷的離心管中，3000 r·min－1離心10 min，取上層腦脊液，－80℃冰箱保存。

取空白血漿和含藥血漿各500 μL 于離心管中，加入2 mL 甲醇，30 μL 乙酸溶液渦旋混合1 min，超聲1 min，13 000 r·min－1離心10 min，取上清液，真空濃縮離心儀1500 r·min－1、40 ℃濃縮至干燥，用150 μL 70%甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm 微孔濾膜，即得血漿待測樣品溶液。取空白腦脊液和含藥腦脊液各200 μL 于離心管中，加入800 μL 甲醇，渦旋混合1 min，超聲1 min，13 000 r·min－1離心5 min，取上清液，真空濃縮離心儀1500 r·min－1、40 ℃濃縮至干燥，用60 μL 70%甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm 微孔濾膜，即得腦脊液待測樣品溶液。

2.4 二至丸成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立及數(shù)據(jù)處理

在TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）、TCMSP（http://www.tcmsp-e.com/）等中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中檢索二至丸及其單味藥成分結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)補充，對二至丸的化學(xué)成分信息進行整合匯總建立成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)處理采用Xcalibur 軟件，通過分析保留時間、精確分子質(zhì)量、元素組成、同位素豐度和一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖，結(jié)合二至丸成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、Pubchem 數(shù)據(jù)庫、對照品和相關(guān)文獻(xiàn)，對化學(xué)成分進行辨識分析。

3 結(jié)果

3.1 二至丸入血入腦原形化合物的鑒定

應(yīng)用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)，在正、負(fù)離子模式下，對二至丸樣品溶液、大鼠血漿和腦脊液中的成分進行檢測，結(jié)果二至丸樣品溶液、血漿和腦脊液總離子流圖見圖1。共發(fā)現(xiàn)原形入血成分25 種，原形入腦成分3 種，見表1。

表1 二至丸原形入血、入腦原形化合物信息表Tab 1 Information of prototype blood and brain compounds of Erzhi pills

圖1 正、負(fù)離子模式下二至丸TIC 圖Fig 1 TIC for Erzhi pills in both positive and negative ion modes

3.2 二至丸入血入腦原形成分解析

3.2.1 黃酮類化合物 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與雌激素相似，A、B 環(huán)上常被甲基、甲氧基等基團取代。在質(zhì)譜的高強度碰撞過程中，RDA 裂解。CO、CO2等中性分子的丟失是黃酮類化合物的主要裂解特征[20]。實驗中從二至丸給藥血漿中鑒別出黃酮類成分8 個，包括化合物3（20）、4（23）、5（26）、6（28）、7（29）、15、18、24；從給藥腦脊液中鑒別出黃酮類成分1 個，為化合物5（26）。以化合物26（5）和化合物28（6）為例來說明黃酮類化合物的鑒定過程?；衔?6（5）保留時間8.52 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z285.0401 [M-H]－，軟件推測分子式為C15H10O6，主要碎片離子包括m/z151.00 和m/z133.03，是準(zhǔn)分子離子峰m/z285.04通過黃酮類化合物的特征性裂解方式RDA 裂解得到的。與文獻(xiàn)報道[9]基本一致，故將其鑒定為木犀草素，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖2。化合物28（6）保留時間為9.26 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z269.0452 [M-H]－，軟件推測分子式為C15H10O5，主要碎片離子包括m/z225.06、201.06、181.06、159.04、117.03 等，其中m/z225.06 是準(zhǔn)分子離子峰失去一個中性的CO2分子所得，進而再失去一個CO2得到m/z181.06 碎片離子。m/z201.06 離子是準(zhǔn)分子離子峰丟失C3O2后經(jīng)氫重排所得，但其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定易丟失C2H2O 形成穩(wěn)定的具有共軛結(jié)構(gòu)的離子m/z159.04，m/z159.04 又可丟失C2H2O 生成碎片離子m/z117.03，碎片信息與文獻(xiàn)報道[9]基本一致，故將其鑒定為芹菜素，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖3。

圖2 木犀草素二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 2 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of luteolin

圖3 芹菜素二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 3 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of apigenin

3.2.2 香豆素類化合物 香豆素類化合物結(jié)構(gòu)與雌二醇相似，結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯和呋喃骨架容易發(fā)生CO2和CO 的中性丟失[17]。從二至丸給藥血漿中鑒別出香豆素類成分2 個，即化合物22 和27；從給藥腦脊液中鑒別出香豆素類成分1 個，為化合物27。以化合物27 為例，說明香豆素類化合物的鑒定過程?；衔?7 保留時間為8.78 min，軟件得到準(zhǔn)分子離子峰為m/z313.0351[M-H]－，推測分子式為C16H10O7，質(zhì)譜掃描獲得碎片離子m/z298.01、270.02、254.02 等，分別是準(zhǔn)分子離子峰依次丟失CH3、CO、CO2所得，與文獻(xiàn)報道[17]基本一致，故將其鑒定為蟛蜞菊內(nèi)酯，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖4。

圖4 蟛蜞菊內(nèi)酯二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 4 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of wedelolactone

3.2.3 苯乙醇苷類化合物 苯乙醇苷是一類以取代苯乙醇為苷元的苷，其成苷的中心葡萄糖基常連有芳香?；鵞10]。實驗從二至丸給藥血漿中鑒別出苯乙醇苷類化合物2 個，即化合物10 和11；從給藥腦脊液中亦鑒別到化合物11?；衔?1 保留時間為3.39 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z299.1153 [M-H]－，軟件推測分子式為C14H20O7，質(zhì)譜掃描得到碎片離子m/z179.05 和m/z119.05，分別為葡萄糖基碎片和酪醇-OH 的碎片離子，與文獻(xiàn)報道[10]基本一致，故鑒定其為紅景天苷，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖5。

圖5 紅景天苷二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 5 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of salidroside

3.2.4 萜類化合物解析 萜類以異戊二烯單位（C5單位）為基本骨架[8]，根據(jù)分子中C5單位的數(shù)量分為單萜、二萜、三萜等，在二至丸給藥血漿中共鑒別出萜類化合物3 種，即化合物1、8（30）、31。以化合物30 為例，說明萜類化合物的鑒定過程?；衔?0 保留時間為16.45 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z455.3531 [M-H]－，軟件推測分子式為C30H48O3，m/z391.23 是準(zhǔn)分子離子峰失去一分子H2O 和HCOOH 得到的離子碎片，與文獻(xiàn)報道[8]基本一致，故將其鑒定為齊墩果酸，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖6。

圖6 齊墩果酸二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 6 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of oleanolic acid

3.2.5 裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物 環(huán)戊并吡喃是裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物的特征結(jié)構(gòu)，在質(zhì)譜碰撞過程中該結(jié)構(gòu)的鍵會發(fā)生斷裂。裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物側(cè)鏈上的官能團也常以CH3OH、H2O、CO2和糖分子的形式丟失[9]。在二至丸給藥血漿中共鑒別出裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物3 種，即化合物16、19、21?；衔?1 保留時間為7.03 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z685.5621 [M-H]－，推測其分子式為C31H42O17，質(zhì)譜掃描獲得主要離子碎片包括m/z523.18、453.14、421.15 等。準(zhǔn)分子離子峰失去一分子C4H6O 產(chǎn)生m/z453.14 碎片，再失去一分子CH3OH 得到m/z421.15 碎片，m/z453.14、m/z421.15 及分子離子峰失去一分子葡萄糖得到的m/z523.18 碎片都是裂環(huán)環(huán)烯醚萜類裂解的典型片段。與文獻(xiàn)報道[9]基本一致，故將其鑒定為特女貞苷，二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖7。

圖7 特女貞苷二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 7 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of nuezhenide

4 討論

多成分、多靶點是二至丸復(fù)方體系的重要特點，也給二至丸治療AD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究帶來了挑戰(zhàn)。經(jīng)典復(fù)方體系研究往往以體外成分為研究對象[13]，血漿等內(nèi)環(huán)境對中藥復(fù)方成分的影響就很容易被忽視。因此，實驗采用具有較強分離、檢測能力的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)對二至丸的入血入腦成分進行檢測。二至丸成分復(fù)雜多樣，在血漿和腦脊液的復(fù)雜體系影響下更容易發(fā)生改變，為了最大程度獲取樣品中化合物的質(zhì)譜信息，實驗采用了正、負(fù)兩種離子化采集模式。結(jié)果在給藥血漿中鑒定出黃酮類、香豆素類、苯乙醇苷類、三萜類等多種類型的成分，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類成分木犀草素和芹菜素都具有促進神經(jīng)元修復(fù)和再生的神經(jīng)保護作用[21-22]。香豆素類成分蟛蜞菊內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙從而保護神經(jīng)退行性病變的作用[23]。苯乙醇苷類成分紅景天苷對大腦神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)作用也不容忽視，神經(jīng)元突觸的活性依賴降低能夠被其抑制[24]。Guo 等[25]研究發(fā)現(xiàn)三萜類成分齊墩果酸能夠調(diào)節(jié)亞錫鈣蛋白-1 和解偶聯(lián)蛋白-2信號而緩解AD 中的氧化應(yīng)激和Aβ沉積。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分梔子苷能夠下調(diào)mTOR 信號，使Aβ纖維的自噬和溶酶體清除增強。酚酸類成分原兒茶酸和咖啡酸也被證實具有改善神經(jīng)炎癥[27]，減少Aβ聚集[28]，進而改善AD 學(xué)習(xí)記憶障礙的藥理作用。此外，在給藥腦脊液中還鑒定出木犀草素、紅景天苷、蟛蜞菊內(nèi)酯3 種成分，提示它們對改善D-gal 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的過程中的貢獻(xiàn)可能更大。

目前，關(guān)于二至丸發(fā)揮改善D-gal 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的具體作用機制和代謝途徑研究還不明確，在后續(xù)研究中，作者將進一步考察這些入血尤其是入腦成分的生物活性和代謝途徑，并進行血液和腦脊液的藥動學(xué)監(jiān)測，明確具體的量效關(guān)系，為更好地闡明體二至丸治療AD 的體內(nèi)藥效物質(zhì)和作用機制提供實驗依據(jù)。