基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的六味地黃湯治療糖尿病的機(jī)制研究*

張艷軍，劉曉琴

（1.晉城市中醫(yī)醫(yī)院，山西 晉城 048000；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

糖尿病是因糖代謝異常及胰島素缺乏而引起人體組織功能發(fā)生障礙的一種代謝性疾病，常伴有許多的并發(fā)癥，以高血糖為主要標(biāo)志[1]。長期存在的高血糖會(huì)導(dǎo)致眼、腎臟、心臟、血管等的慢性損害、功能障礙[2]。據(jù)最新報(bào)道，目前全球成人糖尿病患病率為9.3%[3]；據(jù)估計(jì)，到2045年成人糖尿病患病率將達(dá)9.9%[4]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）報(bào)道，到2030年將會(huì)有5.78億成人患糖尿病[5]。糖尿病已成為當(dāng)前威脅人類生命健康的非傳染性疾病之一，然而，糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療糖尿病需要長期服用藥物，而降糖藥物有許多不良反應(yīng)及副作用，且很難根治。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬“消渴”范疇，且認(rèn)為其發(fā)生與陰虛燥熱有緊密關(guān)系，糖尿病治法在于補(bǔ)腎養(yǎng)陰。陰虛型消渴的代表方藥是六味地黃湯，其具有安全性高、毒副作用小、治療效果較理想等優(yōu)勢(shì)[6]。六味地黃湯處方中包括熟地黃、牡丹皮、山茱萸、澤瀉、山藥、茯苓6味中藥，其中熟地黃是君藥，具有補(bǔ)髓滋陰補(bǔ)腎的功效；山茱萸具有補(bǔ)益肝腎的功效；山藥具有降血糖、補(bǔ)腎、健脾等功效；牡丹皮、澤瀉、茯苓三味藥具有清熱、涼血、利水等功效[7]。有研究[8]表明六味地黃湯可以改善2型糖尿病模型大鼠的胰島素抵抗，可以改善糖尿病發(fā)病過程中存在的葡萄糖代謝異常情況、調(diào)節(jié)血脂[9]，可用于糖尿病、腎炎、神經(jīng)衰弱等患者的治療，廣泛應(yīng)用于臨床，且有良好的治療效果[10]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，藥物對(duì)疾病治療的研究已進(jìn)入到了細(xì)胞和基因水平。目前對(duì)六味地黃湯治療糖尿病及其并發(fā)癥的臨床研究報(bào)道較多，但對(duì)其活性成分、藥理作用及治療機(jī)制的研究報(bào)道較少；傳統(tǒng)的理論因缺少化學(xué)及生物學(xué)的表征，難以和現(xiàn)代科學(xué)融合[11]。因此，本研究著重探討六味地黃湯治療糖尿病的機(jī)制，找出其活性成分，并研究其藥理作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究工具 數(shù)據(jù)庫和軟件：基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/）；京都基因和基因組百科全書（KEGG，https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）；Strawberry Perl 5.30.2（Perl，http://Strawberryperl.com/）；R語言3.6.3（Lucent Technologies，http://www.r-project.org）；Cytoscape 3.7.2（The Cytoscape Consoritum，http://cytoscape.org）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物房溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由攝食飲水，所用小鼠實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究動(dòng)物處置符合“3R”原則。倫理批準(zhǔn)編號(hào)：JCPH.No20220713001。

1.3 藥物與試劑 六味地黃湯，方藥組成：熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g，澤瀉9 g。以上中藥材均購自山西和仁堂中藥飲片有限責(zé)任公司，且經(jīng)杜晨暉教授鑒定為正品。上述藥材煎煮兩次，濃縮為含生藥1 g/mL的藥液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。高脂飼料購自小黍有泰（北京）生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（STZ）（批號(hào)：WXBD4971V）購自美國Sigma公司；磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抗體（批號(hào)：CN89330）、p-PI3K抗體（批號(hào)：CN89330）、蛋白激酶B（Akt）抗體（批號(hào)：AA44161）、p-Akt抗體（批號(hào)：AA44161）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)：AA64132）均購自Bioworld公司；HRP-羊抗兔IgG（批號(hào)：BST16G15B16H55）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號(hào)：16F02A12）、廣譜磷酸酶抑制劑混合物（×100）（批號(hào)：16L21C83）、增強(qiáng)型RIPA裂解液（批號(hào)：16D16B02）均購自博士德生物工程有限公司；Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）（批號(hào)：20210311）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器 TGL-20B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）；GeneGnome成像系統(tǒng)（基因有限公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 糖尿病差異（關(guān)鍵）基因的獲取 利用GEO數(shù)據(jù)庫查找、下載有關(guān)糖尿病的矩陣文件和平臺(tái)文件[12]，獲得正常組樣品22個(gè)（GSM610904～GSM610925）和實(shí)驗(yàn)組樣品18個(gè)（GSM6 10886～GSM610903），利用Perl對(duì)其進(jìn)行整理；使用軟件R對(duì)所得樣本進(jìn)行篩選，繪制糖尿病GEO數(shù)據(jù)庫差異熱圖和火山圖。

2.1.2 六味地黃湯中藥有效成分的獲取 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找熟地黃、山藥、茯苓、牡丹皮、山萸肉、澤瀉的有效成分，篩選條件為生物口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18[13]。

2.1.3 六味地黃湯候選靶標(biāo)的獲取 在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載六味地黃湯中6味中藥的藥物靶點(diǎn)并進(jìn)行整理，再用Strawberry Perl 5.30.2軟件進(jìn)行藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)換。

2.1.4 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 Strawberry Perl 5.30.2軟件處理藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)換后的表格和差異基因表格，得到network.txt和node.txt兩個(gè)準(zhǔn)備文件，Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建六味地黃湯與糖尿病的“有效成分-靶點(diǎn)-疾病”中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅臉?gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)來源于以下幾個(gè)數(shù)據(jù)庫：DTP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND數(shù)據(jù)庫。運(yùn)用Cytoscape3.7.2對(duì)中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)里的所有基因進(jìn)行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)制作，構(gòu)建之前定義相關(guān)參數(shù)。PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)龐大的網(wǎng)絡(luò)，直接觀察看不出里面的基因或者蛋白，需要進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。再運(yùn)用Cytoscape 3.7.2中的CytoNCA包進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯怨?jié)點(diǎn)度值（Degree Centrality，DC）＞61、介數(shù)中心度（Betweenness Centrality，BC）＞100為篩選標(biāo)準(zhǔn)，創(chuàng)建子網(wǎng)絡(luò)后，最終得到核心網(wǎng)絡(luò)。

2.1.6 GO富集分析、KEGG富集分析 通過R語言，選擇生物過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3個(gè)模塊對(duì)六味地黃湯中的靶點(diǎn)和糖尿病基因進(jìn)行GO富集分析、KEGG富集分析；利用Perl語言將六味地黃湯干預(yù)糖尿病的關(guān)鍵靶標(biāo)名稱轉(zhuǎn)換為Entrez ID后，以P＜0.05為篩選條件，運(yùn)用Cytoscape構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并將信號(hào)通路富集結(jié)果可視化。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 造模與分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組8只和造模組32只。正常組小鼠喂食普通飼料，造模組小鼠喂食高脂飼料。飼養(yǎng)10周后，禁食過夜，造模組小鼠按100 mg/kg劑量腹腔注射STZ造模，正常組小鼠腹腔注射同等劑量的檸檬酸緩沖液，1次/d，連續(xù)3 d。注射后測(cè)空腹血糖值，以血糖值≥11.1 mmol/L為造模成功條件。將32只造模成功小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、六味地黃湯低劑量組、六味地黃湯高劑量組、二甲雙胍組，每組8只。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)給藥 六味地黃湯低、高劑量組小鼠分別灌胃給予六味地黃湯，7.5、15 g/kg；二甲雙胍組小鼠灌胃給予二甲雙胍溶液，250 mg/kg；模型組與正常組小鼠灌胃給予等體積純凈水，1次/d，連續(xù)4周。末次給藥后12 h，10%水合氯醛麻醉小鼠，取腎臟，備用。

2.2.3 Western blotting 法檢測(cè)小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白的表達(dá)水平 取小鼠腎臟，使用T-PER組織蛋白提取試劑提取蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE法分離30 μg蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，于5%脫脂奶粉中孵育30 min，室溫封閉1 h后，與抗體p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、β-actin（1∶500）在4 ℃孵化過夜；TBST洗膜后，與HRP標(biāo)記兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h。GeneGnome成像系統(tǒng)曝光，Image J軟件分析，所得灰度值即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖尿病差異（關(guān)鍵）基因 以lgFC≥1、P＜0.05為條件對(duì)糖尿病矩陣文件和平臺(tái)文件進(jìn)行處理得到糖尿病的差異基因2 255個(gè)，其中上調(diào)基因1 004個(gè)，下調(diào)基因1 251個(gè)；繪制糖尿病GEO數(shù)據(jù)庫差異熱圖（見圖1A）和GEO數(shù)據(jù)庫差異火山圖（見圖1B）[14]。熱圖中橫坐標(biāo)為組別（C.正常組；T.實(shí)驗(yàn)組），縱坐標(biāo)為基因名稱，其中，紅色、黑色和綠色分別代表高表達(dá)、中表達(dá)和低表達(dá)。火山圖中，lgFC＜0為綠色，表示在實(shí)驗(yàn)組為下調(diào)基因；lgFC=0為黑色，表示正常組與實(shí)驗(yàn)組無差異基因；lgFC＞0為紅色，表示在實(shí)驗(yàn)組為上調(diào)基因；顏色越亮表示基因表達(dá)越顯著。差異基因RPS4Y2和RPS4Y1在正常組高表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)組低表達(dá)；差異基因XIST在實(shí)驗(yàn)組高表達(dá)，在正常組低表達(dá)。（見圖1）

圖1 糖尿病GEO 數(shù)據(jù)庫差異熱圖（A）與火山圖（B）

3.2 六味地黃湯中主要有效成分 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共找到有效成分74個(gè)，其中，熟地黃2個(gè)、山茱萸20個(gè)、山藥16個(gè)、牡丹皮11個(gè)、茯苓15個(gè)、澤瀉10個(gè)[15]。（見表1）

表1 六味地黃湯各種中藥有效成分

3.3 六味地黃湯靶標(biāo) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索處方中各個(gè)中藥的藥物靶點(diǎn)，并進(jìn)行中藥復(fù)方靶點(diǎn)整理后，得到584個(gè)有效成分和靶點(diǎn)，其中熟地黃34個(gè)、山茱萸130個(gè)、山藥144個(gè)、茯苓30個(gè)、澤瀉9個(gè)、牡丹皮237個(gè)。進(jìn)行藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)換，得到506個(gè)有用結(jié)果，即熟地黃30個(gè)、山茱萸108個(gè)、山藥122個(gè)、茯苓23個(gè)、澤瀉9個(gè)、牡丹皮214個(gè)。

3.4 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共有24個(gè)有效成分，30個(gè)基因，其中來源于山藥的有效成分最多（9個(gè)）；網(wǎng)絡(luò)圖共有53個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中藥物分子24個(gè)、靶點(diǎn)基因29個(gè)，共有82條連線；藥物分子中槲皮素（Degree=23）、山奈酚（Degree=12）、β-谷甾醇（Degree=5）度值較大，作用的靶點(diǎn)較多，說明其在治療糖尿病的治療過程中發(fā)揮主要作用。（見圖2、表2～3）

圖2 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

表2 六味地黃湯有效成分藥物分子及其度值

表3 六味地黃湯治療糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)基因及其度值

3.5 PPI 蛋白相互作網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?利用度值（Degree Centralities，DC）分析之后得到1 402個(gè)凝接節(jié)點(diǎn)（見圖3A），以DC（406-61）進(jìn)行過濾得到170個(gè)節(jié)點(diǎn)（見圖3B），創(chuàng)建子網(wǎng)絡(luò)，再進(jìn)行介度中心數(shù)（Betweenness Centralities，BC）分析，以BC（840-150）進(jìn)行再次過濾處理，創(chuàng)建一個(gè)新的子網(wǎng)絡(luò)后，最終核心網(wǎng)絡(luò)存在43個(gè)節(jié)點(diǎn)。（見圖3C）

圖3 六味地黃湯治療糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（A）與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)（B、C）

3.6 GO富集分析 研究六味地黃湯對(duì)糖尿病的治療作用，以P＜0.05為過濾條件，對(duì)藥物和疾病的靶點(diǎn)基因采取GO富集分析，得到結(jié)果有282個(gè)條目，包括生物學(xué)過程相關(guān)條目243個(gè)、細(xì)胞組分相關(guān)條目20個(gè)、分子功能相關(guān)條目19個(gè)。GO富集分析生物學(xué)過程相關(guān)條目主要有上皮細(xì)胞增殖（epithelial cell proliferation）、調(diào)控上皮細(xì)胞增殖（regulation of epithelial cell proliferation）、類固醇激素反應(yīng)（response to steroid hormone）等；細(xì)胞組分相關(guān)條目主要有頂端等離子體膜（apical plasma membrane）、細(xì)胞的頂端部分（apical part of cell）、橫向等離子體膜（lateral plasma membrane）等；分子功能相關(guān)條目主要有蛋白激酶調(diào)節(jié)活性（protein kinase regulator activity）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）等。篩選出P＜0.05生物學(xué)過程的前20個(gè)條目、細(xì)胞組分的20個(gè)條目、分子功能的19個(gè)條目制作GO富集分析柱狀圖。（見圖4）

圖4 六味地黃湯相關(guān)靶點(diǎn)的GO 富集分析圖

3.7 KEGG富集分析 KEGG富集分析得到37條通路，篩選前20條作出氣泡圖（見圖5A）；KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中共有20條通路、17個(gè)基因；結(jié)果表明基因顯著富集在神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ca2+信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路等通路上（見圖5B）。

圖5 KEGG 富集分析氣泡圖（A）與KEGG 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（B）

3.8 各組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與正常組比較，模型組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，六味地黃湯高劑量組、二甲雙胍組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），六味地黃湯低劑量組小鼠腎臟中p-Akt/Akt表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組小鼠腎臟中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖7 各組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=8）

4 討論

本研究通過對(duì)六味地黃湯治療糖尿病的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，得到六味地黃湯治療糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括雌激素受體α基因（ESR1）、雄激素受體（AR）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、內(nèi)表皮生長因子（EGF）、β2腎上腺素受體（ADRB2）、蛋白激酶B（AKT1）等；通過GO富集分析得到六味地黃湯治療糖尿病關(guān)鍵靶點(diǎn)的相關(guān)功能，主要包括上皮細(xì)胞增殖、調(diào)控上皮細(xì)胞增殖、類固醇激素反應(yīng)、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、激酶調(diào)節(jié)活性等方面；通過KEGG富集分析得到六味地黃湯治療糖尿病的基因顯著富集在神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ca2+信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路等通路上，初步探討了六味地黃湯治療糖尿病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和治療機(jī)制；通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用六味地黃湯對(duì)糖尿病模型小鼠進(jìn)行治療，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，六味地黃湯可升高小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達(dá)水平，為其進(jìn)一步研究應(yīng)用提供參考和方向。

2型糖尿病患者會(huì)伴隨嚴(yán)重的脂代謝異常，雌激素和ESR1結(jié)合之后可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)絕經(jīng)后婦女糖尿病人群進(jìn)行雌激素替代治療，發(fā)現(xiàn)其糖耐量升高、胰島素抵抗降低[16-17]。據(jù)報(bào)道，腫瘤抑制因子P53（TP53）與肥胖癥有關(guān)[18]。ADRB2可以特異性地與內(nèi)源性配體結(jié)合并被激活，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，在脂質(zhì)代謝和能量消耗中發(fā)揮重要作用[19]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于PI3K/AKT信號(hào)通路的核心部位，在調(diào)節(jié)胰島素細(xì)胞的刺激反應(yīng)、增進(jìn)細(xì)胞的生存能力和生長發(fā)育中發(fā)揮著不可替代的作用[20]；研究表明AKT1可在能量代謝通路中發(fā)揮作用[21]。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一可降低血糖的激素，同時(shí)能促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成；PI3KAkt作為胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路，具有調(diào)節(jié)控制機(jī)體中的葡萄糖吸收、糖原降解和合成的作用[22]；增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)可減輕胰島素抵抗[23]。

六味地黃湯中起主要治療效果的中藥是山茱萸和山藥，而六味地黃湯的君藥是熟地黃，二者結(jié)論不統(tǒng)一，出現(xiàn)這種情況的具體原因有待進(jìn)一步探究。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方中的應(yīng)用處在初期階段，只是對(duì)藥物治療疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，具體的治療效果需要在臨床應(yīng)用中方可得到體現(xiàn)。這進(jìn)一步說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥中的應(yīng)用有很大的發(fā)展空間。

六味地黃湯治療糖尿病的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路有關(guān)，可為其進(jìn)一步研究應(yīng)用提供參考，但更深層次的原理還需繼續(xù)探索。