基于現(xiàn)代生物學(xué)探討中藥對腎虛證動物模型生殖功能的影響*

趙均，宋春英，薛美昭，郭興萍

1.山西白求恩醫(yī)院(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山西省生殖科學(xué)研究所，山西 太原 030032；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619

近年來，男性不育癥的發(fā)病率逐年升高，其中以少弱精子癥居多。中醫(yī)藥在防治男性不育癥方面經(jīng)驗豐富，并取得了一定的進(jìn)展[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，主生殖，為先天之本，是生殖之源。腎足，機體發(fā)育就會健壯，生殖功能及其他生命活動就會正常；反之，腎虛，男性的性功能就會降低，精子在發(fā)生發(fā)育過程就會受到影響，甚至可能導(dǎo)致男性不育。因此，腎虛是男性少弱精子癥的根本病機。少弱精子癥的病位在腎、脾、肝，腎虛為本，與濕熱、血瘀、肝郁密切關(guān)聯(lián)，涉及臟腑、氣血、外邪，虛實夾雜[2]。因此，不育癥的病因病機是復(fù)雜的。但腎虛仍然是男性不育癥常見的證型[3]。研究腎虛證型的致病機理是解決少弱精癥患者不育的重要方法之一。臨床以腎陽虧虛、腎陰虧虛和腎精不足最為常見[3]，主要治法為固腎澀精法、滋陰降火法、補腎益氣法、補腎填精法、補腎滋陰法、補腎壯陽法等[4]。

隨著對中醫(yī)藥研究的深入，模擬中醫(yī)相關(guān)證候的動物模型已成為研究中醫(yī)藥治療不育癥作用機制的重要方法。由于腎虛證相關(guān)的疾病種類較多，腎虛證模型是研究較早且應(yīng)用較多的一類動物模型，運用腎虛證動物模型研究其致病機理和相應(yīng)的治療方法也取得了一定的進(jìn)展[5]。應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)揭示機體的生命規(guī)律已成為當(dāng)前研究生命科學(xué)的重要途徑之一。本文主要通過檢索2005—2020年運用現(xiàn)代生物學(xué)的方法分析中藥對3類常見腎虛證動物模型生殖功能的研究進(jìn)展。

1 腎陽虧虛型

腎陽虧虛型動物模型常表現(xiàn)為：皮毛色澤暗淡，弓背，瞇眼，怕冷蜷縮，陰囊皺縮，倦怠乏力，精神萎靡，行動緩慢，進(jìn)食量和飲水量減少，體質(zhì)量下降，小便頻數(shù)，大便稀溏等。常用的造模方法包括腺嘌呤法、氫化可的松法、去勢法、甲巰咪唑法、去甲狀腺法、去腎上腺法、房勞過度法、驚恐傷腎法[6]。其中，腺嘌呤、氫化可的松和房勞過度法為常見的造模方法。

1.1 腺嘌呤法復(fù)制模型研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤具有促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡和抑制生精的作用，被廣泛用于建立腎陽虛型不育模型[7]。芳香化酶編碼基因(cytochrome P19，CYP19)通過調(diào)節(jié)雌激素的合成調(diào)控精子生成，睪丸中的轉(zhuǎn)化生成因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)既可以直接調(diào)節(jié)精子的形成過程，也通過抑制CYP19的表達(dá)影響精子生成[8]。對大鼠進(jìn)行灌胃腺嘌呤建立腎陽虛不育模型發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組大鼠睪丸參與生精過程的CYP19mRNA和芳香化酶P450水平均顯著下降[8]。研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸能顯著提高腎陽虛不育癥模型大鼠精子密度與存活率，增加血清性激素水平，升高大鼠睪丸組織中CYP19mRNA水平，降低TGF-β1mRNA水平，促進(jìn)精子的生成[9-10]。Smads蛋白是TGF-β家族成員細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，可直接或間接影響TGF-β蛋白(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)控精子的生成、發(fā)育及成熟等過程。腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛不育模型大鼠睪丸中參與調(diào)控精子發(fā)生、發(fā)育和成熟過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad1表達(dá)降低且Smad5不表達(dá)，當(dāng)給予溫陽生精湯后，Smad1蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示溫陽生精湯可通過調(diào)節(jié)睪丸Smads表達(dá)，促進(jìn)精子形成，治療雄性不育[11-12]。補腎生精方能夠增加模型大鼠的精液密度，提高精子的存活率及存活力，促進(jìn)下丘腦-垂體分泌促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteinizing hormones，LH)和睪酮(testosterone，T)，改善性腺軸的功能紊亂狀態(tài)，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smads表達(dá)，促進(jìn)精子的生成[13]。

腺嘌呤能夠使B淋巴細(xì)胞瘤-2(b-cell lymphoma 2，Bcl-2)和Bax基因異常表達(dá)，引發(fā)生精障礙，形成弱精癥或無精癥，導(dǎo)致男性不育癥。益精方可升高不育癥大鼠睪丸中凋亡相關(guān)Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)，抑制生精細(xì)胞凋亡[14]。

腺嘌呤還能誘發(fā)氧化應(yīng)激，影響睪丸的內(nèi)分泌功能而造成生殖系統(tǒng)損傷。益腎通絡(luò)方可以修復(fù)腺嘌呤引發(fā)的模型大鼠的氧化應(yīng)激損傷，升高體內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)活性，調(diào)節(jié)血清FSH、T和LH水平，保護(hù)大鼠生殖系統(tǒng)[15]。

血睪屏障能夠為精子的發(fā)生提供穩(wěn)定的微環(huán)境和免疫屏障，確保精子的順利生成。睪丸支持細(xì)胞間的連接蛋白在調(diào)解血睪屏障中發(fā)揮了重要作用。益精方能有效提高腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛模型大鼠睪丸中蛋白激酶A以及抑制素B(inhibin B，INHB)的表達(dá)，調(diào)控睪丸支持細(xì)胞間連接黏附分子及閉合小環(huán)蛋白的表達(dá)，修復(fù)睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白的損傷，恢復(fù)大鼠的生殖能力[16-17]。

1.2 氫化可的松法復(fù)制模型氫化可的松為人工合成的糖皮質(zhì)激素，對下丘腦-垂體-性腺(睪丸)軸具有重要的影響，常用于構(gòu)建腎陽虛型不育癥模型[7]。氫化可的松注射液通過肌肉注射復(fù)制小鼠腎陽虛模型發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠精子質(zhì)量下降，附睪功能性指標(biāo)精子膜甘油-3-磷酸膽堿含量升高，導(dǎo)致不育[18]。菟絲子總黃酮能明顯改善腎陽虛模型小鼠的精子質(zhì)量，促進(jìn)血清T分泌，提高睪丸內(nèi)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)、酸性磷酸酯酶(acid phosphatase，ACP)、SOD和谷胱甘肽水平，降低MDA活性，下調(diào)凋亡相關(guān)基因Fas和Fasl水平[19]，提示菟絲子總黃酮治療腎陽虛小鼠的作用與抗氧化應(yīng)激和抗凋亡有關(guān)。

1.3 房勞過度法復(fù)制模型通過“勞倦過度、房事不節(jié)”的方法成功構(gòu)建腎陽虛小鼠模型發(fā)現(xiàn)，該模型小鼠的生精功能發(fā)生障礙，各級生精細(xì)胞均有不同程度的損傷，抗凋亡基因Bcl-2水平下降，用金匱腎氣丸進(jìn)行治療后可改善模型小鼠的免疫和生精功能[20]。腎氣丸可顯著恢復(fù)腎陽虛小鼠異常的性腺軸激素水平，提高睪丸中SOD和LDH活性，降低MDA、一氧化氮(nitric oxide，NO)含量以及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性[21]。

2 腎陰虧虛型

腎陽虧虛型動物模型常表現(xiàn)為：毛無光澤，眼窩下限，體溫升高，心率加快，多動易驚，煩躁不安，飲水增多，進(jìn)食量減少，體質(zhì)量增長緩慢，形體消瘦，大便干結(jié)等。常用的造模方法有甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)(氫化可的松、醋酸可的松、地塞米松、醋酸潑尼松)、高血壓腎陰虛、過量使用熱性中藥致腎陰虛證模型[22]。其中，甲狀腺激素法和氫化可的松法復(fù)制的模型是研究腎陰虧虛動物模型中最常見的2種。

2.1 甲狀腺激素法復(fù)制模型過量使用甲狀腺激素類藥物可以導(dǎo)致機體功能紊亂，產(chǎn)生多汗、急躁、心率加快等腎陰虛的癥狀，常被用于構(gòu)建腎陰虛型不育模型[22]。酒蒸女貞子對甲狀腺誘導(dǎo)的腎陰虛模型大鼠睪丸的氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護(hù)作用，該模型大鼠睪丸組織中SOD活性顯著下降，MDA含量升高，同時睪丸等臟器指數(shù)明顯下降，而女貞子生品及酒蒸品均能顯著提高模型大鼠的睪丸組織及臟器指數(shù)，升高睪丸組織SOD活性并降低MDA含量[23]。六味地黃湯可顯著促進(jìn)甲狀腺素致腎陰虛型生精障礙大鼠睪丸精子的生成，改善其精子質(zhì)量，升高大鼠血清中FSH、LH、T、NO和NOS水平，對損傷的睪丸曲細(xì)精管具有明顯的修復(fù)作用[24]。

2.2 氫化可的松法復(fù)制模型采用不同劑量的氫化可的松處理可分別用于構(gòu)建腎陽虛和腎陰虛兩類不同的動物模型[25-26]，其中大劑量的外源性氫化可的松可使機體呈現(xiàn)煩躁多動等現(xiàn)象，常被用于建立腎陰虛型不育模型[27]。研究補腎滋陰法對醋酸氫化可的松致腎陰虛型大鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管生精上皮變薄，生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，在透射電鏡下觀察到模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)線粒體變性，且溶酶體增多；二地鱉甲煎給予治療后可顯著改善上述癥狀[28]，提示補腎滋陰藥二地鱉甲煎能拮抗醋酸氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠睪丸病理損傷。

3 腎精不足型

腎精不足型動物模型常表現(xiàn)為：體毛枯疏，弓背蜷縮，反應(yīng)遲鈍，倦怠嗜睡，易受驚嚇，擁擠扎堆，進(jìn)食量和飲水量減少，生長發(fā)育遲緩等。常用的造模方法包括雷公藤灌胃法、腹腔注射環(huán)磷酰胺法、羥基脲灌胃法、房勞加驚恐法、潑尼松灌胃法、腹腔注射地塞米松法、維生素D缺乏法、維甲酸灌胃法[29-34]。其中雷公藤多苷、環(huán)磷酰胺和房勞加驚恐法是研究腎精不足動物模型中最常見的3種造模方法。

3.1 雷公藤法復(fù)制模型長期使用雷公藤可對機體生殖系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的毒性，導(dǎo)致精子減少甚至造成機體不育，常被用來建立腎精不足型動物模型[7，35-37]。左歸丸能夠明顯改善腎精不足型大鼠狀態(tài)，提高睪丸組織臟器系數(shù)、精子濃度、精子存活率及前向運動精子百分率，升高血清FSH、雌二醇(estradiol，E2)、LH、T水平，調(diào)控大鼠睪丸中Bax、Bcl-2、細(xì)胞增殖相關(guān)基因(Ki67)、生精細(xì)胞因子受體(stem cell factor receptor，c-kit)和睪丸干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)精原干細(xì)胞的分裂和增殖，抑制生精細(xì)胞凋亡[38-40]。提示左歸丸對雷公藤多苷致腎精不足動物模型具有明顯的保護(hù)及治療作用。

五子衍宗丸能夠顯著降低腎虛不足模型大鼠血清中FSH水平，提高T、INHB、雄激素結(jié)合蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)水平[41]，也能夠顯著提高睪丸組織中的精子數(shù)量、前向運動精子百分率及精子總活力，增加睪丸組織中波形蛋白、α微觀蛋白的表達(dá)量，提高生精細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原且降低生精細(xì)胞的凋亡率[42]。研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗丸能夠提高大鼠睪丸組織中自噬相關(guān)蛋白(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白-2(lysosome-associated membrane protein-2，LAMP-2)的表達(dá)，增加自噬小體數(shù)目[43]，降低模型大鼠睪丸組織中線粒體呼吸鏈細(xì)胞色素C氧化酶亞基7a2(cytochrome c oxidase subunit 7a2，cox7a2)的mRNA和細(xì)胞外信號傳導(dǎo)調(diào)控激酶(extracellular signal regulated kinase，EPK)磷酸化水平，顯著升高支持細(xì)胞組成蛋白Claudin-11表達(dá)水平[44]。提示五子衍宗丸可通過修復(fù)支持細(xì)胞骨架蛋白，恢復(fù)支持細(xì)胞中的相關(guān)生物標(biāo)志物水平，調(diào)控支持細(xì)胞線粒體自噬、線粒體能量代謝和血睪屏障，抑制生精細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善生精功能。

強精片對不育癥大鼠睪丸中FasL、ABP蛋白及緊密連接蛋白(Occludin)表達(dá)影響的研究發(fā)現(xiàn)，強精片能夠提高Occludin蛋白表達(dá)，降低睪丸組織中FasL和ABP蛋白表達(dá)，修復(fù)睪丸生精微環(huán)境血睪屏障功能，改善生殖功能[45]，提高精液質(zhì)量，升高血清T及連接蛋白(connexin43，Cx43)表達(dá)水平[46]，提示益腎活血利濕中藥強精片可能通過調(diào)節(jié)血清T水平及睪丸中Cx43蛋白表達(dá)改善不育癥大鼠的精液質(zhì)量。

3.2 環(huán)磷酰胺法復(fù)制模型環(huán)磷酰胺可誘導(dǎo)各級生精細(xì)胞發(fā)生凋亡，常被用來建立腎精不足型動物模型[7，47-49]。研究發(fā)現(xiàn)，促育生精方可用于治療環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠不育癥，顯著提高模型組小鼠睪丸組織中精子密度、精子活力，升高睪丸組織中特異性CREM(cAMP-responsive element modulator)激活因子、cAMP(cyclic adenosine monophosphate)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、精子尾部鞭毛特異性鈣通道蛋白(cation channel of sperm，CatSper)及其mRNA的表達(dá)水平，改善小鼠精子質(zhì)量[50-52]。

五子衍宗方可顯著提高小鼠睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)、睪丸內(nèi)各級生殖細(xì)胞數(shù)量以及睪丸中Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)以及凋亡細(xì)胞的數(shù)量，證實五子衍宗方能顯著減少環(huán)磷酰胺致雄性小鼠睪丸生殖細(xì)胞的凋亡[53]。五子衍宗方能通過下調(diào)腫瘤抑制蛋白(p-P53)和γ位磷酸化的組蛋白(γ-H2AX)的表達(dá)水平，顯著減輕環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸細(xì)胞DNA損傷[54]。黃精贊育膠囊能夠通過升高細(xì)胞內(nèi)(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，Pi3k-Akt)信號通路中的PI3K和增強精子運動能力的Catsper1蛋白表達(dá)，提高精子的質(zhì)量[55]。

冬蟲夏草可明顯提升精子密度與活力，降低精子畸形率，提高睪丸中SOD與谷胱甘肽(glutathione peroxidase，GSH-PX)活性并降低MDA含量[56]，提示冬蟲夏草可通過清除活性氧自由基，提高抗氧化能力以緩解環(huán)磷腺苷所致小鼠睪丸生精功能的損害。姜黃素可明顯緩解環(huán)磷酰胺所致小鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量、附睪質(zhì)量、精子數(shù)量的降低，還能顯著降低睪丸組織中MDA含量，升高過氧化氫酶(catalase，CAT)、SOD、GSH和GSH-PX活性[57]，證實姜黃素可通過抑制睪丸氧化損傷，提高相關(guān)抗氧化物水平，改善環(huán)磷酰胺致小鼠的生殖功能損傷。

3.3 房勞加驚恐法復(fù)制模型研究補腎生精湯對房勞模型小鼠生精細(xì)胞的影響時發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，補腎生精湯組可提高小鼠睪丸和附睪質(zhì)量、睪丸精子密度及畸形率，升高血清T水平[58]，提示補腎生精湯能使房勞小鼠生精功能得到改善，提高生殖能力。加味金鎖二仙飲可改善驚恐模型小鼠腎精不足癥狀，升高血清T、FSH、LH含量，升高SOD活性，降低MDA含量，改善睪丸的病理損傷，發(fā)揮其補腎填精的功效[59]。

4 討論

中醫(yī)證候動物模型是研究中藥治療少弱精癥作用機制的重要方法之一。本文總結(jié)了近15年中藥對腎虛證動物模型生殖功能方面的研究，研究人員從組織水平、細(xì)胞水平和分子水平等角度，探究了腎虛證的不育機制及中藥治療腎虛癥的作用機理。其中包括中藥對下丘腦-垂體-睪丸軸和精液常規(guī)指標(biāo)的影響，對睪丸組織結(jié)構(gòu)的改善，以及促進(jìn)睪丸生精功能恢復(fù)等方面。首先，中藥通過改善和調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-睪丸的生殖性腺軸功能，分泌相關(guān)激素(包括LH、FSH、T、E2等)，進(jìn)一步促進(jìn)生精細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞三者間相互作用并產(chǎn)生精子。此外，中藥還可以促進(jìn)腎虛型動物模型睪丸組織中精原干細(xì)胞的分裂和增殖，抑制生精細(xì)胞的凋亡。參與增殖信號通路中的相關(guān)基因(Ki67、SCF、c-kit等)和參與凋亡途徑的相關(guān)基因(Bax、Bcl-2、Fas、Fasl、Caspase-3等)在中藥治療腎虛型動物的過程中也發(fā)揮了重要的作用。氧化應(yīng)激也在中藥修復(fù)腎虛型動物中產(chǎn)生了重要影響，其中，與氧化還原相關(guān)的酶和代謝物包括SOD、CAT、GSH-PX、ACP、LDH、SDH和GSH等。

存在的問題及解決方案：①臨床研究中辨證分型多樣，目前還缺乏公認(rèn)的分型標(biāo)準(zhǔn)。因此采用一些造模方式建立的腎虛證動物模型，其病理特征和相關(guān)的生理生化指標(biāo)可能會難以區(qū)分，不具有典型性。同時，研究還發(fā)現(xiàn)采用同一種造模方式建立的動物模型，在建模的過程中也會出現(xiàn)不同的證型。如采用潑尼松對動物進(jìn)行注射，早期會出現(xiàn)類似“腎陰虛”的特征，而到晚期則會出現(xiàn)類似“腎陽虛”的特點[60]。因此，需要建立規(guī)范、典型及公認(rèn)的與中藥學(xué)相關(guān)的動物模型。②現(xiàn)有的關(guān)于中藥治療的實驗基礎(chǔ)研究大多未進(jìn)行深入的探索，致使其作用機制相對不明確。因此建議分別從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)的不同層面進(jìn)行實驗研究。

綜上所述，腎虛是中醫(yī)理論體系中的重要證候之一，將中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代生物學(xué)分析技術(shù)進(jìn)行有機的結(jié)合，建立相關(guān)的不育癥動物模型，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與病理變化之間的聯(lián)系，是研究中藥治療男性不育癥作用機制的重要手段。雖然目前男性不育癥的病因機理多不明確，且人與動物間的種屬存在較大的差異。但是運用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)手段分析中藥治療對生物體的影響，揭示DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及代謝物的功能及其相關(guān)規(guī)律，對腎虛的病因病機和藥物對腎虛作用機制等方面的探索具有重要的意義。