耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的基因型和同源性分析

賈磊 陸錦琪 馮勤麗 蔡瑩 高雯潔

1 嘉興市第一醫(yī)院感控與公共衛(wèi)生部，嘉興 314001；2 嘉興市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，嘉興341001

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染常見的病原微生物之一，而耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)是引起醫(yī)院感染的一個(gè)重要致病菌，CRKP 感染是引起患者死亡的危險(xiǎn)因素之一[1]。 有關(guān)研究表明患者使用的機(jī)械通氣設(shè)備、留置導(dǎo)尿、動(dòng)靜脈插管、 氣管插管、 床頭桌、 監(jiān)護(hù)儀表面以及輸液泵分離出的CRKP 與患者感染的CRKP 具有同源性[2-3]，但是因果關(guān)系尚不明確。 本研究采用前瞻性的分析，于 2021 年1—8 月對某醫(yī)院內(nèi)患者體內(nèi)和環(huán)境樣本中檢測到的CRKP 進(jìn)行同源性分析，探求二者之間的因果關(guān)系，并檢測了CRKP 的耐藥基因型，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、材料來源

收集 2021 年 1—8 月，在某醫(yī)院 ICU、急診 ICU、神經(jīng)外科和呼吸科就診患者的痰液、血液、尿液、創(chuàng)面等樣本中檢測出的CRKP。 同時(shí)監(jiān)測CRKP 住院患者所在病房中可能交叉?zhèn)鞑^(qū)域的物體表面、醫(yī)療器材、醫(yī)用織物以及醫(yī)務(wù)人員的手等。 物體表面包括門把手、床欄、床頭桌、治療車臺面、呼吸機(jī)面板、監(jiān)護(hù)儀面板、監(jiān)護(hù)使用的相關(guān)導(dǎo)線、輸液泵／微量泵面板、護(hù)理桌面、聽診器、血壓器袖帶、呼吸機(jī)進(jìn)／出氣口、簡易呼吸器和濕化罐等。

二、樣本采集

對CRKP 感染的住院患者周圍環(huán)境進(jìn)行清潔消毒前采樣，采樣類別以物體表面和醫(yī)療器材為主以及患者所在科室工作人員的手指。 患者的臨床樣本為當(dāng)患者發(fā)生感染時(shí)送檢的臨床微生物樣本。 按照《醫(yī)院消毒隔離技術(shù)規(guī)范》要求，使用500 mg/L 的含氯消毒液對地面進(jìn)行終末消毒1 周后，繼續(xù)篩查患者分離出的CRKP。 本研究通過嘉興市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：LS2018-179）。

三、儀器及試劑

Phoenix-100 全自動(dòng)微生物分析儀及配套革蘭陰性菌的鑒定、藥敏卡片購自美國BD 公司。 藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品，脈沖場凝膠電泳（PFGE）及相關(guān)試劑購自美國 Bio Rad 公司。 碳青霉烯酶檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)為購長沙眾捷物技術(shù)有限公司， 檢測結(jié)果與PCR 檢測結(jié)果對比，靈敏度與特異性均為100%。

四、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)采用MIC 法，其中美羅培南的藥敏試驗(yàn)使用紙片擴(kuò)散法。 質(zhì)控菌株采用衛(wèi)生部生物制品鑒定所生產(chǎn)的大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。根據(jù)2019 年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判讀菌株對抗菌藥物的敏感性[4]。

五、耐藥基因型檢測

使用碳青霉烯酶檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)，檢測常見的產(chǎn) KPC、OXA-48、VIM、IMP 和 NDM 等 5 類碳青霉烯酶耐藥酶型。

六、PFGE

按肺炎克雷伯菌PFGE 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行， 用XbaⅠ內(nèi)切酶37 ℃酶切4 h 后上機(jī)電泳19 h，初始轉(zhuǎn)換時(shí)間6 s，終末轉(zhuǎn)換時(shí)間36 s，電壓梯度6 V/cm，夾角:120°線性，起始電流：140 mA，電泳 20 h。 成像后用 BioNumerics 6.6 軟件分析。 根據(jù)相關(guān)研究在解釋PFGE 結(jié)果時(shí)，將具有85%以上相同條帶的菌株認(rèn)為是基因型別相同的菌株[5]。

結(jié) 果

一、一般情況

2021 年 1—8 月，共分離出 40 株 CRKP 菌株(排除重復(fù)分離出的菌株)，其中35 株分離自患者的臨床樣本（27 株為消毒前，8 株為消毒后），5 株分離自重癥醫(yī)學(xué)科和重癥康復(fù)科的環(huán)境和物體表面（均為消毒前），工作人員手上以及清潔消毒后患者周圍環(huán)境中均未檢測出CRKP。

35 株分離自患者的CRKP 臨床樣本分布： 痰液26 株、引流液3 株、創(chuàng)面2 株、血液4 株；重癥醫(yī)學(xué)科25 株、重癥康復(fù)科4 株、神經(jīng)外科 3 株、呼吸科 2 株、肝膽胰外科 1 株。 35 例患者中，男性 21 人，女性 14 人；年齡最大 91 歲，最小 29 歲，中位年齡為71 歲；腦外傷及腦出血13 例，重癥肺炎9 例，惡性腫瘤7例。

5 株分離自環(huán)境的CRKP 中，2 株來自重癥康復(fù)科，分別為吸氧面罩和床頭柜；3 株來自重癥醫(yī)學(xué)科，分別為呼吸機(jī)管路、微泵以及吸痰管接頭。

二、CRKP 耐藥基因型別

40 株 CRKP 的耐藥基因型分別為：KPC 型 36 株，OXA-48 型 3 株，NDM 型 1 株，其中環(huán)境和物體表面分離出的 5 株CRKP 耐藥基因型均為KPC 型。

三、CRKP 的同源性分析及藥物敏感性

對11 株CRKP 藥敏結(jié)果高度一致的菌株進(jìn)行PFGE 同源性分析，結(jié)果見圖1，11 株CRKP 耐藥基因型均為KPC 型。PFGE 分子分型聚類分析顯示，3 株來自消毒前重癥醫(yī)學(xué)科、1 株來自重癥康復(fù)科、5 株來自環(huán)境和物體表面(床頭柜、呼吸機(jī)管路接口、微泵、吸痰管接頭、吸氧面罩)，以上9 株CRKP的條帶相似性為100%。

環(huán)境清潔消毒前，4 株從患者體內(nèi)分離出的CRKP、5 株從環(huán)境中分離出的CRKP，PFGE 分析條帶100%相同。 在常規(guī)的環(huán)境清潔消毒前，雖然采樣時(shí)間不同，但是重癥醫(yī)學(xué)科的3 株來自患者痰液和引流液的CRKP 與重癥康復(fù)科的1株來自患者創(chuàng)面的CRKP， 與周圍的環(huán)境和物體表面檢出的CRKP 具有同源性。

在對重癥醫(yī)學(xué)科環(huán)境和物體表面消毒后， 菌株編號為8和11 的患者體內(nèi)分離出的CRKP，與加強(qiáng)環(huán)境清潔消毒前4株從患者分離出的CRKP、5 株從環(huán)境中分離出的CRKP 的條帶相似性在90%以上，具有高度同源性。

11 株CRKP 的藥敏結(jié)果：除對替加環(huán)素和復(fù)方磺胺甲噁唑敏感外，對其他抗菌藥物均耐藥。

四、CRKP 感染患者的治療和預(yù)后

6 例患者在進(jìn)行微生物培養(yǎng)前均進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)性用藥，后根據(jù)藥敏結(jié)果及時(shí)調(diào)整用藥，5 例患者治愈出院，1 例患者因住院時(shí)重型顱腦損傷而死亡。

討 論

有關(guān)研究表明，CRKP 在環(huán)境中存活時(shí)間較長，表明環(huán)境清潔在預(yù)防 CRKP 院內(nèi)傳播方面具有重要作用[6]。 本次研究發(fā)現(xiàn)，在重癥康復(fù)科病房CRKP 感染患者的吸氧面罩、床頭柜，重癥醫(yī)學(xué)科病房患者的呼吸機(jī)管路、微泵以及吸痰管接頭中均分離出CRKP。 相關(guān)研究顯示，病房內(nèi)的床單位(包括病床、床墊、床欄、床頭柜等)一旦被CRKP 污染，會極大增加下一位患者感染的風(fēng)險(xiǎn)[7]。 本研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，患者4在2021 年2 月份住重癥醫(yī)學(xué)科29 床， 經(jīng)過合理治療出院后， 可能是由于終末消毒不到位， 導(dǎo)致患者1 同樣感染了CRKP。 同時(shí)，當(dāng)患者感染CRKP 后，治療需要進(jìn)行吸痰等操作，導(dǎo)致患者周邊的環(huán)境也會分離出CRKP。 本研究中，患者使用的醫(yī)療器械以及家具均分離出了CRKP， 而且和患者體內(nèi)分離出的CRKP 具有同源性。 因此，應(yīng)加強(qiáng)對患者周圍環(huán)境、床單元清潔消毒工作，這對預(yù)防 CRKP 院內(nèi)傳播方面起著重要作用[6]。 雖然本次研究未從相關(guān)科室的工作人員的手上檢測出CRKP，但仍需引起重視，von Lengerke 等[8]的研究表明，提高手衛(wèi)生依從性，可以有效降低多重耐藥菌的傳播。

本文分離出的40 株CRKP 耐藥基因型以KPC 型為主，占比高達(dá)90%，這和邵春紅研究結(jié)果類似[9]。 11 株藥敏結(jié)果高度一致的CRKP 菌株除對替加環(huán)素和復(fù)方磺胺甲噁唑敏感外，對其他抗菌藥物均耐藥。 相關(guān)研究表明，KPC 耐藥基因型以及不同種類抗菌藥物的使用是影響CRKP 耐藥率的重要因素[10-11]。

另外，本文結(jié)果還顯示，雖然加強(qiáng)了環(huán)境的清潔消毒，但消毒后患者體內(nèi)分離出的2 株CRKP 與消毒前4 株患者體內(nèi)、5 株環(huán)境中分離出的CRKP 條帶相似性仍在90%以上，具有高度的同源性，說明CRKP 可能通過其他途徑傳播，因此，需要采取集束化干預(yù)措施，包括抗菌藥物管理、提高手衛(wèi)生依從性、加強(qiáng)環(huán)境的清潔消毒等，以上措施對減少CRKP 在醫(yī)院內(nèi)的傳播會起到關(guān)鍵作用。

本次研究的局限性為單中心研究， 只能說明本單位的CRKP 耐藥基因型。 另外，本研究使用的是傳統(tǒng)經(jīng)典的PFGE鑒定CRKP 的同源性，存在一定的局限，今后計(jì)劃使用二代基因測序鑒定，提高結(jié)果的精準(zhǔn)度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明賈磊：論文撰寫，數(shù)據(jù)收集；陸錦琪：論文指導(dǎo)，學(xué)術(shù)指導(dǎo)；馮勤麗、蔡瑩：環(huán)境樣本采樣；高雯潔：實(shí)驗(yàn)分析