桔貝合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和優(yōu)化

陳浩 張衛(wèi)蓮 曹蓉蓉 馬鳳玲

（榆林市藥品檢驗所 陜西榆林 719000）

1 前言

桔貝合劑是一種棕褐色的中藥液體口服制劑，主要由7味中藥組成，分別為桔梗、浙貝母、苦杏仁、麥冬、黃芩、枇杷葉、甘草；氣香、味甜、微苦，具有潤肺止咳的療效，對于肺熱咳嗽、咯痰不爽、痰稠色黃等癥狀具有顯著療效。本品被《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二冊收載記錄[1]，標(biāo)準(zhǔn)項目只有性狀、檢查，但標(biāo)準(zhǔn)較為簡單，不利于產(chǎn)品的系統(tǒng)性研究與質(zhì)量控制。本文通過對桔貝合劑的研究，并結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)[2-10]，選用TLC法鑒別制劑中的桔梗、苦杏仁，選用HPLC法測定黃芩中黃芩苷的含量，對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)地研究和探討，以期為提高桔貝合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有效依據(jù)。

2 儀器與試藥

2.1 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent）；色譜數(shù)據(jù)工作站（Agilent open LAB CDS chemstation）；紫外檢測器（VWD）；十萬分之一天平（MS205DU，梅特勒-托利多儀器）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 試藥

黃芩苷對照品（批號：110715-201821）、苦杏仁苷對照品（批號：110820-201808）、桔梗對照藥材（批號：121028-201411）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜級）；超純水；硅膠G板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；桔貝合劑（10 mL/支，批號分別為：190107、190109、190113，江西誠志永豐藥業(yè)有限責(zé)任公司）；其余試劑均為分析純。

3 TLC色譜鑒別

3.1 桔梗

取本品20 ml，加入7%硫酸乙醇-水（1∶3）溶液20 mL；加熱回流3 h，冷卻；加氯仿提取2次，每次使用20 mL；將2次的氯仿溶液合并，再用水洗滌2次，每次使用20 mL，得到的氯仿溶液用1 g無水硫酸鈉進(jìn)行脫水；待氯仿液蒸干，加入1 mL甲醇溶解殘渣，制成供試品溶液。另取桔梗的對照藥材2 g，加入水-7%硫酸乙醇（3∶1）溶液20 mL，采用相同方法制成對照藥材溶液。按處方比例和工藝，取無桔梗的其余藥材制成陰性樣品，采用相同方法制成陰性對照溶液。按照2015年版的《中國藥典》四部TLC法（通則0502）進(jìn)行試驗，取上述3種溶液各6 μL，置于硅膠G薄層板上；展開劑為乙醚-氯仿（1∶2），展開，取出并揮干；噴顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液；在105℃條件下烘至斑點顏色清晰。在日光下觀察，供試品溶液色譜與對照藥材溶液色譜相同的位置上，顯示出相同的斑點和顏色，表明陰性對照溶液沒有干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 桔梗TLC色譜圖

3.2 苦杏仁

取本品20 mL，濃縮至5 mL；加入甲醇10 mL，超聲（180 W，40 kHz）處理30 min；濾過，濾液作為供試品溶液。另取苦杏仁苷對照品5 mg，加入甲醇5 mL溶解，作為對照品溶液。按照處方比例和工藝，取無苦杏仁的其余藥材制成陰性樣品，采用相同方法制成陰性對照溶液。按照2015年版的《中國藥典》四部TLC法（通則0502）試驗，取上述3種溶液各10 μL，置于硅膠G薄層板上；展開劑為乙酸乙酯-甲醇-氯仿-水（40∶22∶15∶10）5～10℃的下層液，展開；取出，并立即噴顯色劑為0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液；在105℃的條件下烘至斑點顏色清晰。在日光下觀察，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相同的位置上，顯示出相同的斑點和顏色，表明陰性對照溶液沒有干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 苦杏仁TLC色譜圖

4 HPLC法測定

4.1 色譜柱

Aglient-5-TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）。分別采用3三種不同的流動相：甲醇-磷酸溶液（45∶55）；甲醇-水-磷酸（47-53-0.2）；甲醇-水-冰醋酸（50∶50∶1）。檢測波長分別為：280 nm、278 nm、277 nm、274 nm、315 nm。流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30℃。

結(jié)果表明，采用波長為280nm，流動相為甲醇-水-磷酸（47-53-0.2）時，峰面積最大，且峰形良好，保留時間合適，基線平穩(wěn)，更適合定量分析，故本文選擇波長280 nm，流動相，甲醇-水-磷酸（47-53-0.2）。

4.2 溶劑的選擇

精密量取供試品液體2 mL，轉(zhuǎn)移置50 mL量瓶中，分別加入稀乙醇、70%乙醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、水溶劑各35 mL；超聲（180 W，40 kHz）處理30 min，放冷；加入溶劑至刻度，搖勻，即得。

結(jié)果表明，用50%甲醇作為溶劑提取時，黃芩苷峰與相鄰峰能夠完全分離，測定峰面積最大，提取最完全，且分離度符合要求。故本文選擇50%甲醇作為提取溶劑。

4.3 處理方法的選擇

精密量取供試品液體2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度；精密量取供試品液體2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入50%甲醇35 mL，超聲5 min，再加入50%甲醇至刻度；精密量取供試品液體2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加50%甲醇35 mL，超聲20 min，再加入50%甲醇至刻度；精密量取供試品液體2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入50%甲醇35 mL，超聲30 min，再加入50%甲醇至刻度；精密量取供試品液體2 mL，轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，先稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，再用50%甲醇補足失去的重量。

結(jié)果表明，采用上述5種提取工藝方法進(jìn)行含量測定，采用50%甲醇超聲處理20 min時，黃芩苷已基本提取完全且操作簡便，故本文選擇桔貝合劑含量的提取方法為超聲（180 W，40 kHz）處理20 min。

4.4 溶液的制備

4.4.1 對照品溶液

精密稱取黃芩苷的對照品（標(biāo)示含量為95.4%）27.94 mg，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解，稀釋至刻度，制成對照品溶液，見圖3（a）。

4.4.2 供試品溶液

取供試品液體2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中；加入50%甲醇35 mL，超聲（180 W，40 kHz）處理20 min，放冷；加50%甲醇至刻度，搖勻，制得供試品溶液。見圖3（b）。

4.4.3 陰性對照溶液

按照桔貝合劑的制備工藝，制備無黃芩的陰性樣品，與供試品溶液的方法處理相同，制得陰性對照溶液，見圖3（c）。

圖3 HPLC色譜圖

5 方法學(xué)考察

5.1 線性關(guān)系考察

取“4.4.1”中配制的對照品溶液作為對照品初液，逐級稀釋成每1ml含106.62、53.31、26.65、13.33、6.66 μg的對照品梯度溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定出峰面積。以濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為Y=36.961X-21.309（r=0.999 9）。試驗結(jié)果顯示，黃芩苷的質(zhì)量濃度在6.66～106.62 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

5.2 精密度試驗

取上述同一濃度的對照品溶液，精密量取10 μL；注入液相色譜儀，測定出峰面積；重復(fù)進(jìn)樣6次，測得黃芩苷的色譜峰面積RSD為0.15%（n=6），表明儀器的精密度良好。

5.3 重復(fù)性試液

取6份樣品（批號：190113），同供試品溶液方法制備，進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法計算供試品含量，測得供試品中黃芩苷的平均含量為1.747 3 mg/mL，RSD=0.29%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

5.4 穩(wěn)定性

取供試品溶液（批號：190113），在相同色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，測得供試品溶液中的黃芩苷色譜峰面積RSD為0.05%（n=6）。結(jié)果顯示，供試品溶液在12 h內(nèi)能夠保持一定的穩(wěn)定性。

5.5 加樣回收率

精密量取1 mL樣品（批號：190113），；加入濃度為2 665.476 μg/mL黃芩苷對照品溶液0.65 mL，按照上述供試品溶液的制備方法，平行制備6份；按照上述色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率，得出平均回收率為98.56%，RSD=0.47%（n=6），結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實驗結(jié)果

5.6 樣品含量測定

取桔貝合劑3批，按“4.4.2”中的方法制備供試品溶液，按照“4.1”中的色譜條件進(jìn)行測定。3批桔貝合劑測得黃芩苷含量分別為1.918 4、1.885 2、1.747 3 mg/mL（n=3）。

6 討論

在桔梗、苦杏仁的TCL鑒別中，本文通過改進(jìn)中國藥典2020年版一部[2]的提取方法和展開條件，得到斑點清晰、無雜質(zhì)干擾、重現(xiàn)性好的薄層色譜圖，即陰性對照證實了該方法的可信度。

若炮制或保存黃芩不規(guī)范，可使黃芩苷元中的鄰三酚羥基被氧化，黃芩苷遭到破壞，質(zhì)量降低，生成醌類衍生物的顏色由黃色變?yōu)榫G色[3-4]。因此，在桔貝合劑中，黃芩苷的含量是影響其質(zhì)量的重要指標(biāo)。

黃芩苷成分是相對不穩(wěn)定的化合物，遇到光或熱時，容易分解[5]，通過處理方法“4.3”可以驗證，加熱回流1 h時，測得黃芩苷的峰面積最小，因此在供試品前處理時應(yīng)縮短受熱時間，避免破壞黃芩苷的成分，選用超聲處理20 min即可完全提取。因本品中的藥品成分較為復(fù)雜，使用乙醇、甲醇提取時，黃芩苷峰與雜質(zhì)的分離不夠理想，選用50%的甲醇作為溶劑時，分離度＞1.5，且測得峰面積最大，符合HPLC實驗條件，故本文將50%的甲醇作為溶劑，超聲處理20 min，確定為供試品溶液的制備方法，并將對照品溶液和供試品液放置于棕色瓶中。

在采用HPLC法測定黃芩苷含量的相關(guān)研究中，對黃芩苷的測定波長有280、278、277、274、315 nm，本文對黃芩苷上述5種波長的紫外吸收進(jìn)行了測驗。結(jié)果顯示，黃芩苷在280 nm處靈敏度和吸收度較高，且色譜峰最滿意，故本文選擇280 nm作為檢測波長。

綜上所述，本文建立了TCL鑒別桔貝合劑中桔梗和苦杏仁、HPLC測定桔貝合劑中黃芩苷含量的方法，該方法操作簡便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性和分離度符合要求，通過多次試驗，表明該方法專屬性強，具有可行性，能夠用于桔貝合劑的質(zhì)量控制。