光譜滴定法在食品鈣分析中的應(yīng)用研究

呂萍萍 汪海波 關(guān)朝亮 何浩 宋喜臣 宋清超 張珗 桑琳 王飛

（1.綏芬河海關(guān)綜合技術(shù)中心 黑龍江綏芬河 157399；2.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心）

1 前言

鈣是人體必需的元素，是構(gòu)成骨骼和牙齒的重要成分[1]，人體對鈣的攝入主要通過食物和水，因此食品中鈣含量的測定十分重要。當前，對食品中的鈣進行測定的方法有很多，主要分為化學(xué)法和儀器法，常見方法有EDTA滴定法[2-3]、高錳酸鉀滴定法[4]、分光光度法[5-6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[2-3]、離子色譜法[3]、火焰原子吸收法[2-3]、X射線熒光光譜法[3]、電感耦合等離子發(fā)射光譜法[2-3]、離子選擇性電極濃度直讀法[3]等。其中，EDTA滴定法因其技術(shù)成熟、成本低廉被廣泛應(yīng)用。

EDTA滴定法屬于人工感官滴定，滴定終點需要用人眼對顏色的變化進行主觀判斷，存在色評價條件難以統(tǒng)一、對終點顏色的文字描述難以理解為感覺的顏色、終點顏色無法量值溯源等問題，給結(jié)果的判定帶來諸多困擾。而且在實際的滴定過程中，滴定終點的顏色突變并不明顯，對檢測人員的技術(shù)和經(jīng)驗要求較高，容易產(chǎn)生誤差。

可見光光譜滴定技術(shù)（Visible Spectral Titration Technology，VSTT）是2018年面世的新技術(shù)，通過化學(xué)反應(yīng)過程中發(fā)生的光譜變化進行物質(zhì)結(jié)構(gòu)表征[7]，同時對滴定參數(shù)進行同步記錄，實現(xiàn)滴定終點的量值溯源，可以有效實現(xiàn)滴定過程中顏色的數(shù)值化、圖形化，避免顏色變化不明顯、不同人員感官差異等因素所產(chǎn)生的顏色判斷誤差，其檢出限更低。VSTT在食品中鈣分析領(lǐng)域的應(yīng)用尚未見報道，本文對光譜滴定法在食品中鈣含量測定方面的應(yīng)用進行驗證，以期為相關(guān)人員提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

市售胡蘿卜、葡萄。

2.2 儀器與試劑

光譜滴定儀（SX-Z-3.3，秦皇島水熊科技有限公司）；電子天平（XP205，瑞士梅特勒公司）；電熱板（HT300，中國廣州分析測試中心）；恒溫干燥箱（M53，德國賓德）；滴定管（25 mL）。

碳酸鈣（99.99%，上海麥克林生化科技有限公司）；鹽酸（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硝酸（優(yōu)級純，德國默克公司）；高氯酸（優(yōu)級純，德國默克公司）；氧化鑭（優(yōu)級純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氫氧化鉀（≥85%，美國阿法埃莎化學(xué)試劑）；硫化鈉（分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所）；乙二酸四乙酸二鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸鈉（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；鈣羧酸指示劑（優(yōu)級純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2.3 方法

2.3.1 鈣的光譜滴定原理

在滴定過程中，不同離子成分的改變會引起被測物結(jié)構(gòu)的改變，同步使吸收光譜發(fā)生顏色變化，該變化點為國標的滴定終點。VSTT[7]用色變曲線參數(shù)同步描述顏色的變化軌跡，用數(shù)字化、圖形化的曲線標識顏色的變化過程，曲線上的突變峰與吸收光譜具有對應(yīng)關(guān)系。

2.3.2 光譜滴定儀條件

光譜范圍：380 nm～780 nm，△λ5 nm；測量周期：100 ms；積分時間：100 ms；光程：10.0 mm；滴定速率：0.167 ml/min；攪拌速度：300 r/min，靴型反應(yīng)器：180 mL。

2.3.3 光譜滴定方法

滴定度（T）的測定：在靴型反應(yīng)器中依次加入：3.00 mL鈣標準儲備液、約80 mL去離子水、1滴濃度為10 g/L的硫化鈉溶液、0.1 mL濃度為0.05 mol/L的檸檬酸鈉溶液、5 mL濃度為3.75 mol/L的氫氧化鉀溶液、3滴濃度為1g/L的鈣羧酸指示劑，以約0.001 mol/L的EDTA溶液滴定。當選定的色變曲線出現(xiàn)峰值時，對應(yīng)的加入試劑的體積為滴定終點值。計算每毫升EDTA溶液相當于鈣的毫克數(shù)，即滴定度（T）[2]。公式（1）：

式中：Cca—鈣標準儲備液濃度；Vca—鈣標準儲備液使用體積；VEDTA—滴定鈣消耗的EDTA體積。

樣品的測定[2]：樣品消解后，定容至25 ml，分別吸取1.00 mL試樣消化液及空白液，置于靴型反應(yīng)器中，以下同滴定度（T）的測定。公式（2）：

式中：X—樣品中鈣的含量；T—EDTA對鈣的滴定度；V1—滴定樣品消耗的EDTA體積；V0—滴定空白消耗的EDTA體積；V2—樣品定容體積；V3—滴定取樣體積。

2.3.4 感官滴定方法[2]

滴定度（T）的測定：吸取0.50 mL鈣標準儲備液，置于10 mL試管中，依次加入：1滴10 g/L硫化鈉溶液、0.1 mL的0.05 moL/L檸檬酸鈉溶液、1.5 mL的1.25 moL/L氫氧化鉀溶液、3滴1 g/L羧酸指示劑，立即以約0.001 moL/L的EDTA溶液滴定，目視至溶液由紫紅色變藍色為滴定終點，記錄所消耗的EDTA溶液的體積[2]，代入公式（1）進行計算。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對2種方法的測定結(jié)果進行配對樣本t檢驗分析，推論出差異發(fā)生的概率P值（即sig值），比較2種方法有無差異，驗證所得結(jié)論的統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鈣的光譜滴定終點確認

鈣的光譜滴定過程中，CIE1976（L*a*b*）均勻彩色空間參數(shù)值的明度指數(shù)L*值、紅-綠色品指數(shù)a*值、黃-藍色品指數(shù)b*值，均發(fā)生了相應(yīng)改變，滴定終點時，各數(shù)值的變化明顯減小，其變化軌跡見圖1、圖2、圖3。

圖1 鈣的光譜滴定CIE1976（L*a*b*）曲線V-L*

圖2 鈣的光譜滴定CIE1976（L*a*b*）曲線V-a*b*

圖3 CIE 1976（L*a*b*）彩色均勻空間示意圖[7]

從圖中可以看出，L*值變化不大，在x軸上方，說明溶液的明暗度無明顯變化；L*值曲線不平滑，有干擾峰，可能是由于在滴定過程中產(chǎn)生少量沉淀，影響了透光度。a*值明顯減小，由x軸上方下降至x軸下方，說明溶液顏色由紅色向藍綠色轉(zhuǎn)變；在接近終點時變化趨于平緩，曲線平滑，無干擾峰。b*值由x軸附近下降至x軸下方，說明溶液顏色由淡藍色變?yōu)樗{色；在接近終點時變化趨于平緩，曲線平滑，無干擾峰。試驗溶液變化為混合色，即溶液由紅色和淡藍色的混合色紫紅色，轉(zhuǎn)變?yōu)樗{綠色和藍色的混合色藍色。由此可見，光譜滴定顏色的測定數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)感官滴定人工判斷顏色的變化相符。

本文采用VSTT的參數(shù)△a*3/△V3峰值做為滴定終點[7]，更接近a*值和b*值的共同變色終點。以加入滴定劑的體積（V）作為橫坐標，以光譜滴定參數(shù)△a*3/△V3作為縱坐標，繪制△a*3/△V3-V滴定曲線，曲線上的最大峰值即為滴定終點，見圖4。

圖4 鈣的光譜滴定CIE1976（L*a*b*）曲線△a*3/△V3-V

3.2 滴定度（T）的測定結(jié)果比對

化學(xué)反應(yīng)方程式EDTA與鈣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的摩爾配比為1：1，即理論上滴定1 moL鈣需消耗1 moL EDTA。本文配制的鈣標準儲備液濃度為103.04 mg/L（鈣的摩爾濃度為40.08 g/moL），相當于0.002 580 moL/L，滴定用EDTA標定濃度為0.001 068 moL/L，理論上滴定0.50 mL鈣需要消耗1.21 mL EDTA溶液可到達滴定終點，滴定3.00 mL鈣則需要消耗7.25 mL EDTA溶液可到達滴定終點，理論滴定度（T）為0.042 6 mg/mL。

在相同條件下，2名研究人員分別利用感官滴定法和光譜滴定法測定EDTA對鈣的滴定度，2種方法測定的數(shù)據(jù)比對詳見表1。

表1 鈣的滴定度（T）測定結(jié)果

從表1可以看出：1.2名研究人員用感官滴定測定鈣的滴定度（T）結(jié)果均值分別為0.046 1、0.045 3，存在差異；2名研究人員用光譜滴定法測定鈣的滴定度（T）結(jié)果均值均為0.041 9，無差異。2.與感官滴定法比較，光譜滴定法測定鈣的滴定度（T）值為0.042 1更接近理論值0.042 6。3.與感官滴定法相比，光譜滴定法的精密度更好。

對2名研究人員分別利用感官滴定法和光譜滴定法檢測的結(jié)果進行配對樣本t檢驗，詳見表2。

表2 鈣的滴定度t檢驗

t檢驗結(jié)果顯示，同一人員用不同方法測定時，檢測結(jié)果均具有顯著性差異（P＜0.05）；不同人員用相同方法測定時，結(jié)果均無顯著性差異（P＞0.05）；不同人員用光譜滴定法測定結(jié)果的差異性小于感官滴定法（P1.000＞P0.267）。

以上數(shù)據(jù)說明，在測定鈣的滴定度（T）時，光譜滴定法的測定結(jié)果優(yōu)于感官滴定法，感官滴定法的操作過程對結(jié)果值的影響更大，這是由于感官滴定依賴人眼主觀判斷，而人眼對顏色的感應(yīng)是不一致的。光譜滴定法對顏色的判斷依據(jù)客觀的參數(shù)計算，其判定條件更穩(wěn)定。可見光譜滴定法的優(yōu)勢明顯，由該法代替人工滴定法測定鈣的滴定度具有可行性。

3.3 樣品的測定結(jié)果比對

在相同的前處理條件下，利用感官滴定法和光譜滴定法測定樣品中鈣的含量，同時進行樣品加標回收率試驗，驗證2種方法的可靠性，詳見表3、表4。

表3 樣品中鈣含量的測定結(jié)果及t檢驗

表4 回收率的測定結(jié)果

由表3和表4可知，2種方法測定樣品中鈣含量結(jié)果的精密度均符合GB 5009.92-2016的要求（≤10%）[2]；2種方法測定樣品中鈣含量的結(jié)果均無顯著差異（P＞0.05）；感官滴定法的加標回收率為96.7%～105.1%，光譜滴定法的加標回收率為92.6%～99.7%，基本符合GB/T 27404-2008中的技術(shù)要求（被測組分含量＞100 mg/kg時，回收率范圍為95%～105%）[8]，表明2種方法均準確、可靠。

3.4 光譜滴定法測定鈣的檢出限

本次測定重復(fù)11次空白試驗[9]，測定結(jié)果按公式（2）計算為樣品中的鈣含量，結(jié)果見表5，并按公式（3）計算方法檢出限。

表5 光譜滴定法測定鈣含量的檢出限（n=11）

式中：MDL—方法檢出限；n—樣品的平行測定次數(shù)；t—自由度為n-1，置信度為99%時的t分布值（單側(cè)）；S—n次平行測定的標準偏差[9]。

本次測定t（10，0.99）值為2.764，以此計算得到，本方法的檢出限為25.3 mg/kg，最大差異值為28.8，在允許的差異范圍40.7±12.7之內(nèi)，符合HJ 168—2020標準中“檢出限可允許的差異范圍應(yīng)在‘空白試驗測定值的均值估計檢出限的1/2’以內(nèi)”的要求[9-10]。光譜滴定法測定食品中鈣的檢出限（25.3 mg/kg）小于國標GB 5009.92中EDTA滴定法的檢出限（100 mg/kg）。

4 結(jié)論

可見光光譜滴定技術(shù)（VSTT）是由我國學(xué)者于2018年首次提出的滴定分析理論，實現(xiàn)了有色滴定分析的數(shù)字化、圖形化和自動化，是滴定分析領(lǐng)域的新突破。目前，光譜滴定法的應(yīng)用研究還處于空白階段，本文首次利用光譜滴定法測定食品中的鈣，通過精密度、準確性、檢出限等指標驗證了方法的可行性，證明了光譜滴定可代替感官滴定的可操作性，為VSTT的應(yīng)用研究提供了有價值的參考，VSTT的進一步發(fā)展或?qū)⒊蔀榻鉀Q化學(xué)研究、檢驗檢測等行業(yè)問題的新技術(shù)手段。