神經軸突導向因子Netrins及其受體在惡性腫瘤中的研究進展

高星 葉甲舟 盧露 李永強 林燕 梁嶸

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1化療一科，2肝膽胰外科

Netrins是一類自分泌蛋白和膜結合蛋白，通過與不同類型的受體結合，在軸突的導向和神經細胞的遷移、分化和凋亡等發(fā)揮吸引和排斥雙重功能。當Netrins僅與結直腸癌缺失基因（deleted in colorectal carcinomal gene，DCC gene）受體結合時可介導軸突吸引作用，即傳遞吸引性信號，誘導軸突朝向Netrins高濃度的區(qū)域生長；而當Netrins單獨與UNC5同源物（UNC5 homolog，UNC5H）受體結合時可介導短時程的排斥作用，誘導軸突朝向遠離Netrins方向生長。當DCC受體與UNC5H受體共同存在時主要介導長時程排斥作用［1-2］。研究還發(fā)現(xiàn)，在大鼠大腦中動脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）中過表達Netrins1（NTN1）后可刺激JNK1/c-Jun信號通路的激活，誘導腦缺血后突觸的形成與軸突再生，進而促進神經功能的恢復，提示Netrins對神經損傷具有一定的修復作用［3］。

除了在上述神經系統(tǒng)發(fā)育中的作用，Netrins還參與調節(jié)炎癥以及心血管、腎臟和腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展。隨著研究的不斷深入，以Netrins為切入點探索腫瘤的分子機制研究取得了一定進展，并受到廣大科研學者的青睞。目前研究證實，Netrins在人類多種惡性腫瘤中異常表達，且其表達水平與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及惡性程度密切相關。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一種多基因參與的復雜過程，涉及細胞的惡化、凋亡、遷移以及微環(huán)境的變化等。因此，研究Netrins在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用具有重要意義。本文就Netrins在調節(jié)各種腫瘤細胞生物活性等方面的作用及機制作一綜述。

1 Netrins蛋白家族分類及結構特性

Netrins家族由ISHII等［4］于1992年首次發(fā)現(xiàn)，可在神經前體細胞、內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、腎小管細胞和腫瘤細胞中表達，屬于分泌蛋白或膜結合蛋白，在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中可作為趨化性因子，介導神經細胞和軸突的遷移。在哺乳動物中，Netrins家族目前已發(fā)現(xiàn)6個成員，包括4種分泌蛋白NTN1，Netrin-3（NTN3），Netrin-4（NTN4）和 Netrin-5（NTN5）以及2種糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定的膜蛋白 Netrin-G1（NTNG1）和 Netrin-G2（NTNG2）［5］。Netrin-2（NTN2）雖然是NTN3的直系同源物，但是僅存在于蠕蟲和魚類中［6］。NTN1和NTN3的N末端與層黏連蛋白γ鏈具有同源性，NTN4的N末端則與層黏連蛋白β鏈具有同源性。此外，NTN1、NTN3、NTN4的其他結構均由3個EGF樣重復序列（V-1、V-2和V-3）的層黏連蛋白V結構域以及1個帶正電的C末端域（NTR/C345C）組成。而NTN5缺少層黏連蛋白的同源性N末端，僅由層黏連蛋白V結構域和C345C結構域組成［6］。NTNG1/NTNG2的N末端與層黏連蛋白γ和β鏈均具有同源性，但與層黏連蛋白γ鏈同源性最強，其余部分由上述層黏連蛋白V結構域和一個C末端組成。與分泌型Netrins蛋白不同，Netrin-G蛋白的C端序列（稱為域C′）是疏水的，并以GPI脂質接頭結尾，可將蛋白質連接到細胞質膜的細胞外表面［7］。鑒于Netrins結構的復雜性與多樣性，Netrins的受體可通過與其不同部位相結合，從而具有多重生物學功能，如細胞遷移、血管生成、免疫炎癥和腫瘤發(fā)生等。

2 Netrins受體

2.1 分泌型Netrins蛋白受體

迄今為止，文獻報道哺乳動物中與分泌型Netrins蛋白結合的主要受體包括DCC、neogenin（NEO1）、UNC5H、唐氏綜合癥細胞黏附分子（down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM）、腺苷A2b受體以及整合素（integrin）［8］。其中，UNC5H是Netrins受體中最大的家族，由UNC5A、UNC5B、UNC5C和 UNC5D組成。

2.2 膜結合型Netrins蛋白受體

Netrin-G膜結合蛋白不與上述的分泌型Netrins蛋白受體相互作用，而是與Netrin-G受體（NGL，又稱為LRRC4）結合來調節(jié)神經元之間的相互作用。其中，NGL1選擇性與NTNG1結合，NGL2也僅與NTNG2相互作用［9］。NGL3均不與NTNG1和NTNG2結合，而是通過和跨膜受體酪氨酸磷酸酶相互作用來促進谷氨酸能的突觸形成［10］。目前，所有已知的Netrins受體中除了A2b和整合素，均為單次Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，Ig superfamily）成員，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內區(qū)3個功能區(qū)組成。

Netrins受體可以執(zhí)行2個獨立的信號通路。當Netrins配體存在時，Netrins可通過與其受體結合激活經典的信號通路，提高細胞的存活率，有助于細胞存活、遷移和分化等。在Netrins配體缺乏的情況下，受體并不處于失活狀態(tài)，而是啟動下游的促凋亡信號通路，誘導細胞凋亡［11］。

在正常細胞中，Netrins配體含量較少而受體含量較多。而在腫瘤細胞中，Netrins配體表達水平上調，受體表達減少，配體與受體結合調控癌細胞存活以及分化，并抑制受體啟動凋亡程序。其中，細胞凋亡紊亂是腫瘤形成的重要機制，如果細胞凋亡受到抑制，細胞死亡減少，細胞數(shù)目就會不斷增加，表現(xiàn)為細胞呈增殖積聚，而這是腫瘤發(fā)生的重要基礎。因此，研究Netrins及其受體相互作用在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制及其調控機制對腫瘤治療具有重要意義。

3 Netrins及其受體在腫瘤中的作用

現(xiàn)有研究表明，Netrins作為潛在的癌基因或抑癌基因，調控多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展，并具有診斷和評估預后價值，其作用機制是錯綜復雜的生物學過程，受到眾多腫瘤因子及信號通路調節(jié)（圖1）。

圖1 Netrins及其受體在腫瘤中的信號通路圖Fig.1 Signaling pathway of Netrins and its receptors in tumors

3.1 Netrins與神經母細胞瘤

神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）患者可分為5個階段，即1、2、3、4和4S階段［12］，DELLOYE-BOURGEOIS等［13］在兒童第4階段的NB組織中發(fā)現(xiàn)NTN1表達上調，且NTN1的表達水平與第4階段患者的總生存期呈負相關。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)沉默NB細胞中NTN1的表達，不僅抑制了腫瘤轉移，還誘導了繼發(fā)部位轉移病灶的消退。近年來，JIANG等［12］在NB細胞和組織中同樣檢測到NTN3的表達，并且NTN3在NB患者第4階段中表達最高，與患者的總生存時間呈負相關；進一步提取ZHANG等［14］已公布的498例NB患者的數(shù)據(jù)進行驗證，同樣證實了NTN3高表達是NB預后不良的標志。因此認為，NTN1和NTN3對NB細胞存活和腫瘤的發(fā)生具有重要作用。

研究還發(fā)現(xiàn)，Netrins參與NB發(fā)生的這一過程中受到腫瘤明星分子及信號通路的調節(jié)。DELLOYEBOURGEOIS等［13］在NB細胞中敲低NTN1的表達，發(fā)現(xiàn)UNC5H/DAPK信號通路被激活，細胞凋亡的數(shù)目增加，同時抑制了裸鼠體內腫瘤細胞的擴散和轉移。MYCN被認為是影響患者生存的基因之一，與癌癥侵襲性相關。隨后，JIANG等［12］進一步研究發(fā)現(xiàn)在MYCN擴增的NB患者中，NTN3表達升高，NB患者預后較差；而沉默MYCN后，NTN3表達則顯著降低。在無MYCN擴增的患者中，NTN3則不具備預后預測能力。此外，NTN3啟動子基因座中還存在MYCN的結合位點，提示NTN3是MYCN的靶基因。因此，深入研究并揭示Netrins及其受體在NB中的分子生物學機制，可能為NB的靶向治療提供新的方向。

3.2 Netrins與膠質母細胞瘤

膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是中樞神經系統(tǒng)中最常見、最具侵略性的腦惡性腫瘤［15］。有研究報道，在GBM患者的腫瘤組織中NTN1呈高表達，且其表達水平與Ki-67、腫瘤分級、腫瘤惡性程度呈正相關，提示NTN1在GBM診斷及預后評估中具有一定的應用前景［16］。HU等［17］對TCGA數(shù)據(jù)庫中的425例GBM患者數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)NTN4在GBM患者的腫瘤組織中呈低表達，且NTN4低表達預示患者預后較差。

替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是目前治療GBM的一線化療藥物，通過觸發(fā)DNA損傷誘導GBM細胞凋亡和衰老，從而發(fā)揮作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)，NTN4可與整聯(lián)蛋白 β4（integrin β4，ITGB4）共同作用，誘導PI3K-AKT-mTOR信號通路的激活，刺激AKT和mTOR磷酸化水平增加，進而保護細胞免于TMZ誘導的細胞衰老，提高GBM細胞對TMZ的耐藥性［17，19］。LI等［20］進一步的GBM細胞測序結果發(fā)現(xiàn)，NTN4與EGFR表達呈正相關，與使用TMZ治療的GBM患者預后呈負相關。而用EGF刺激GBM細胞后發(fā)現(xiàn)，NTN4的表達上調，ERK、AKT、Src和mTOR磷酸化水平升高，導致GBM細胞中的DNA損傷減少［20］。因此，EGF/EGFR調節(jié)了NTN4的表達，靶向EGFR/NTN4軸的組合方法在GBM治療中可能是有效的干預策略。此外，NTN1還可通過激活NTN1/NEO1/FAK/Intergrin β1和NTN1/UNC5B/NEO1/Gsk3α/Gsk3β兩條信號通路調節(jié)c-Myc表達，從而參與對GBM新生血管形成過程的控制，進而促進GBM細胞的增殖、侵襲和遷移［21］?？傮w來說，Netrins在GBM細胞中的復雜功能由不同受體和多種信號通路介導，因此闡明其關鍵分子機制，可能為GBM的靶向治療提供有效靶點。

3.3 Netrins與乳腺癌

乳腺癌（breast cancer，BC）是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一［22］。WISCHHUSEN等［23］使用USMI對NTN1差異表達的裸鼠模型進行檢測，發(fā)現(xiàn)NTN1高表達裸鼠的USMI信號更強，而NTN1低表達裸鼠的USMI信號減弱。因此，NTN1為BC的診斷和基因治療提供了新思路，可能成為BC患者分層診斷的輔助診斷方法。此外，LARRIEU-LAHARGUE等［24］通過裸鼠模型發(fā)現(xiàn)過表達NTN4促進了乳腺癌腫瘤細胞內信號轉導分子AKT、ERK和S6的磷酸化，誘導了肺部腫瘤轉移灶明顯增多及腫瘤血管生成，進而加速了小鼠的死亡，提示NTN4在BC中扮演癌基因的角色。隨后，又有研究發(fā)現(xiàn)過表達NTN4可誘導EMT相關蛋白N-cadherin和vimentin表達下調，進而減弱BC細胞的遷移和侵襲能力［25］，說明NTN4在BC中亦是抑癌因子。由此可見，在同種腫瘤的發(fā)展過程中，NTN4可能發(fā)揮不同的調控作用。

在乳腺癌細胞中Netrins依賴性受體對腫瘤細胞的凋亡也具有調控作用。DCC的第5個纖連蛋白Ⅲ型結構域DCC-5Fbn，可通過NTN1觸發(fā)受體多聚化的能力，進而影響NTN1的活性和抗凋亡作用。FITA-MANT等［26］將 DCC-5Fbn 添加到人乳腺癌T47D和SKBR7細胞中發(fā)現(xiàn)細胞無顯著變化；而將DCC-5Fbn注射到BALB/C小鼠中，小鼠顯示出肺轉移的腫瘤顯著減少，提示NTN1可自分泌表達，當抑制DCC/NTN1或UNC5H2/NTN1的多聚化能力后，賦予了轉移性BC腫瘤細胞存活的選擇性優(yōu)勢。總體來說，未結合Netrins配體的促凋亡活性受體已被認為是一種消除腫瘤細胞的機制，失去其依賴性受體的促凋亡活性將有利于腫瘤細胞的存活，并且可以通過至少2種機制來實現(xiàn)：⑴降低受體水平；⑵抑制下游促凋亡信號通路的激活。以上研究表明，Netrins及其受體在BC的發(fā)生和發(fā)展過程中起協(xié)同作用。

3.4 Netrins與胃癌

胃癌（gastric cancer，GC）是消化系統(tǒng)最高發(fā)的癌癥之一，近年來學者們不斷探索標志物對胃癌診斷及預后的價值。CHEN等［27］研究顯示，在GC組織中NTN1蛋白的表達與Ki-67、浸潤深度、淋巴轉移和遠處轉移呈正相關。進一步敲低GC細胞中NTN1的表達，發(fā)現(xiàn)GC細胞的侵襲和遷移能力降低，裸鼠成瘤能力削弱［28］。此外，LV等［29］發(fā)現(xiàn)在GC患者的腫瘤組織和血清中NTN4也呈高表達，且與病理分期的嚴重程度呈正相關，與患者的OS呈負相關。因此，NTN1和NTN4可能是GC患者的腫瘤標志物。

Netrins受體在GC不同時期的表達水平也具有明顯差異性。在早期胃癌中，DCC和UNC5C基因均發(fā)生異常的甲基化現(xiàn)象導致自身的基因轉錄水平升高，而在晚期胃癌中，這種現(xiàn)象又逐漸消失，并且發(fā)現(xiàn)NTN1水平會進一步升高［30-31］。研究還發(fā)現(xiàn)，NTN1和NTN4可通過結合其受體NEO1，刺激Jak/Stat、PI3K/AKT或ERK/MAPK等信號通路的激活，進而促進體內外GC細胞的生長和轉移［29，32］。以上結果提示，NTN1和NTN4在GC發(fā)生和發(fā)展中作為一種新型腫瘤誘導劑發(fā)揮作用。此外，Netrins通過其受體NEO1調節(jié)GC細胞增殖和侵襲的關鍵機制還為GC的治療提供了新的切入點。

3.5 Netrins與胰腺癌

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）是消化系統(tǒng)常見的腫瘤，惡性程度極高。研究顯示在早期（Ⅰ/Ⅱ期）胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者的腫瘤組織中，NTN1低表達且與低分化PDAC患者的預后不良呈正相關［33］。在胰腺癌細胞系PANC-1和CFPAC-1中過表達NTN1后，Mdm2表達水平上調，p53蛋白泛素化增強，表達量下降，導致p21、p27表達升高，Cyclin D1表達下降，促進了PAAD細胞的體外增殖［34］。提示NTN1可作為PAAD的腫瘤標志物，并通過調節(jié)Mdm2和p53信號通路，促進PAAD的發(fā)生、發(fā)展。

Netrins在泛癌的生信研究中，PAAD患者血液中NTN4的表達較高而NTNG2的表達較低，且NTN4高表達和NTNG2低表達的PAAD患者預后均較差［5］。隨后，F(xiàn)RANCESCONE等［35］通過實驗證實，NTNG1在PDAC組織中呈高表達，其表達水平與生存時間呈負相關。敲低NTNG1的表達，發(fā)現(xiàn)裸鼠體內的成瘤能力減弱。此外，過表達NTNG1還可增強低營養(yǎng)條件下PDAC細胞的存活能力，減少了自然殺傷細胞誘導的死亡；同時激活成纖維細胞中AKT/4E-BP1和p38/FRA1信號通路，從而產生免疫抑制作用，進而促進PDAC 的進展［35］。以上研究提示，Netrins可作為PAAD新的治療靶標，具有潛在的臨床應用價值。

3.6 Netrins與結直腸癌

近年來,學者們不斷探索標志物在結直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者復發(fā)和預后中的價值。LI等［36］在CRC受試者的血清中發(fā)現(xiàn)，NTN1呈高表達且NTN1高表達的晚期腺瘤患者進展為CRC的風險更高。此外，EVENO等［37］研究證實，NTN4過表達降低了結直腸肺轉移及其相關的淋巴結受累的風險，減少腹水的形成及術后的復發(fā)和轉移概率。該研究結果表明，NTN4可能是CRC及主要部位轉移瘤的治療靶標，具有臨床應用潛力。隨后，SHO等［38］通過生信分析發(fā)現(xiàn)，在CRC患者中NTNG1存在高甲基化突變的現(xiàn)象，且其EGF結構域的EGF-3（V3）位點處的突變頻率最頻繁。與未突變組相比，NTNG1突變組的患者存在高復發(fā)風險且預后更差。因此，在CRC中檢測Netrins的表達水平有助于評估CRC患者的預后。

與GC類似，UNC5C的失活主要發(fā)生在結直腸癌形成的早期階段，而DCC缺失則主要發(fā)生在CRC晚期［39］。在DCC缺陷型CRC細胞中，NTN1激活了cAMP/PKA和Rho/ROK信號通路，細胞的侵襲能力增強；而在野生型（DCC過表達）CRC細胞中，NTN1與DCC相互作用，細胞凋亡數(shù)量增多，侵襲和遷移能力減弱［40］。其機制可能是DCC主要調控細胞周期和凋亡途徑相關基因的表達，而Netrins則對與細胞表面信號傳導和細胞黏附、運動和細胞外基質相關的基因表現(xiàn)出更大的選擇性影響。此外，NTN1與DCC和UNC5B直接結合，還可激活Hippo信號通路促進轉錄共激活因子（yes-associated protein，YAP）去磷酸化，導致YAP泛素化和降解減少，細胞核中YAP蓄積增加，進而促進CRC細胞的增殖和遷移［41］。上述研究從不同的角度提示，Netrins及其受體相互作用，調控CRC細胞的增殖和凋亡。

3.7 Netrins與肺癌

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最主要的病理類型。DELLOYE-BOURGEOIS等［42］對 92例NSCLC（45例腺癌和47例鱗狀細胞癌）患者的臨床樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，NTN1在這兩種肺癌中均呈高表達，且NTN1表達水平與NSCLC細胞的浸潤和轉移能力呈正相關，而與預后呈負相關。此外，在小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）組織中還檢測到NTN3呈高表達；敲低NTN3的表達可減弱裸鼠的成瘤能力［12］。HAO等［5］基于數(shù)據(jù)挖掘和深層生物學信息分析發(fā)現(xiàn)，NTNG1在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中差異表達，肺腺癌中NTNG1的低表達和肺鱗狀細胞癌中NTNG1的高表達均與較差的生存率相關，表明NTNG1也參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。隨后，有研究［43-44］證實，NTN1過表達可誘導NSCLC細胞EMT的發(fā)生，細胞侵襲、遷移及血管生成擬態(tài)（VM）的能力增強；而敲低NTN1則達到相反的效果。此外，NTN1還可促進PI3K/AKT和ERK信號通路的激活。用拮抗劑LY294002或U0126阻斷上述信號通路后，能逆轉NTN1對肺癌細胞上述惡性表型的促進作用。總的來說，目前的研究結果突出了Netrins在缺氧條件下在NSCLC發(fā)展中的新作用，并為使用Netrins作為治療靶點提供了進一步的證據(jù)，有望作為一種針對NSCLC治療有前途的新藥物。

3.8 Netrins與其他腫瘤

除了以上腫瘤外，還在膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌和腎細胞癌的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)NTN1呈高表達而UNC5B呈低表達［45-48］。在黑色素瘤細胞中敲低NTN1后誘導了UNC5B的表達增加，細胞的遷移和侵襲能力減弱［48］。在肝癌細胞中，NTN1與UNC5B結合可誘導YAP信號通路的激活，從而介導EMT的發(fā)生，進而促進肝癌細胞的侵襲和腫瘤血管的生成［47，49］。此外，在缺氧條件下敲低前列腺癌細胞中NTN1的表達后，抑制YAP的激活，細胞侵襲和遷移能力減弱，阻礙了EMT的發(fā)生［50］。但是，目前NTN4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用仍然存在爭議。如也有研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中NTN4呈低表達，敲低NTN4表達后宮頸癌細胞的增殖和遷移能力增強［51-52］。然而，在成纖維肉瘤細胞中NTN4呈高表達，且體內外研究結果表明NTN4有抑制成纖維肉瘤細胞增殖和促進遷移、侵襲的作用，且此作用可能受NEO1的介導［53］。綜上所述，NTN4在調節(jié)腫瘤細胞惡性生長中的作用值得進一步研究。

4 小結與展望

Netrins是目前研究的一種熱點蛋白，該蛋白能在神經遷移導向中發(fā)揮重要作用。作為一種重要的腫瘤參與基因，Netrins在很多惡性腫瘤細胞中均呈高表達，有望作為腫瘤診斷、治療監(jiān)測及預后判斷標志物。分子靶向治療是近年隨著基礎研究不斷進展而發(fā)展起來的治療領域。Netrins在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關鍵調節(jié)作用，尤其是抗凋亡和促血管生成作用，這使Netrins可能成為腫瘤治療的一個重要靶點。進一步研究Netrins在腫瘤細胞中的調控機制，發(fā)現(xiàn)Netrins可與其受體結合并通過相關信號傳導通路調控腫瘤的增殖、遷移能力及腫瘤血管的形成，為研制抗腫瘤新藥提供了可能性。

綜上，Netrins可能是一種新的腫瘤標志物，并可能成為腫瘤治療有前景的新靶點，但是由于Netrins調控機制和惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的復雜性，仍需要進一步的基礎和臨床研究來闡明Netrins在惡性腫瘤中的作用和機制。相信隨著對Netrins的深入研究，未來將進一步明確其作用機制，有望為腫瘤生物治療提供新的策略。