非編碼RNA在腫瘤中對EGFR及相關信號通路的作用和機制

聶世豪 劉浩 盧瑗瑗

作者單位：710032 西安 1空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院學員二大隊五隊；2空軍軍醫(yī)大學腫瘤生物學國家重點實驗室，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心

人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）屬于ErbB受體家族成員，通過調控下游多種信號通路，參與調節(jié)細胞的基本生命過程，如細胞增殖、遷移、生存和代謝等。在作用方式上，EGFR可以通過調控激活酪氨酸激酶活性，導致下游多種信號通路（如RAS/ERK、PI3K/AKT、SRC和STAT等）的激活。研究表明，EGFR及其相關信號通路在腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等惡性生物學過程中發(fā)揮重要作用［1］。人類基因組轉錄出大量的RNA，但只有不到2%的RNA被翻譯成蛋白質，不具有蛋白翻譯能力的RNA統(tǒng)稱為非編碼RNA。非編碼RNA依據功能可以分為管家RNA（如tRNA、rRNA等）和調控RNA，其中調控RNA又可以分為長度小于200 nt的小非編碼RNA（如miRNA、snoRNA、siRNA、snRNA、piRNA等）和長度大于200 nt的長鏈非編碼RNA（long non-codingRNA，lncRNA）。此外，還有一種特殊的非編碼RNA——環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。非編碼RNA最開始被認為是轉錄“噪聲”，并不具有重要的功能，但是近年研究中發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在生物體的生長發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的調控作用［2］。非編碼RNA可通過選擇性剪切、減少mRNA的降解和減弱蛋白的內吞降解過程等方式調控EGFR的轉錄、翻譯和降解過程，進而升高EGFR的表達水平，從而影響腫瘤細胞的惡性生物學過程［3］。其中l(wèi)ncRNA和circRNA能夠通過發(fā)揮蛋白質支架、調控剪接、滾環(huán)翻譯等功能，直接參與調控EGFR轉錄和翻譯過程，或作為miRNA海綿影響其他RNA間接調控EGFR信號通路，從而參與調控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［4-5］。因此，進一步探索調控EGFR及相關通路的關鍵非編碼RNA并闡明其作用機制仍有巨大研究前景。本綜述主要歸納腫瘤異常激活的EGFR及相關通路中l(wèi)ncRNA和circRNA的作用機制（圖1），以期為制定新型抗腫瘤治療策略提供參考依據。

圖1 lncRNA和circRNA對EGFR的作用機制模式圖Fig.1 Pattern diagram of lncRNA and circRNA action mechanism on EGFR

1 LncRNA在腫瘤中對EGFR及相關信號通路的作用機制

LncRNA在腫瘤中對EGFR及相關信號通路表現(xiàn)出多種作用機制，主要包括作為miRNA海綿發(fā)揮間接調控作用［6-8］，對EGFR轉錄發(fā)揮選擇性剪切作用［9-10］，轉錄后調節(jié)EGFR mRNA的穩(wěn)定性和翻譯后影響EGFR蛋白質分子穩(wěn)定性［11-15］，具體作用機制見表1。

表1 LncRNA對EGFR的調控機制Tab.1 Regulation mechanism of lncRNA on EGFR

1.1 LncRNA作為miRNA海綿調控EGFR及相關信號通路

LncRNA可作為miRNA海綿發(fā)揮調控作用。miRNAs是單鏈?。?8～24 nt）非編碼RNA分子，主要與靶基因的3′非翻譯區(qū)（3′un-translated region，3′UTR）序列互補發(fā)揮調節(jié)作用。miR-7-5p可直接作用于EGFR mRNA 3′UTR，導致EGFR mRNA表達降低［16］。在非小細胞肺癌中，LINC00240可作為海綿吸附miR-7-5p，從而誘導EGFR過表達，促進非小細胞癌細胞侵襲和遷移［6］。在非小細胞肺癌對吉非替尼的耐藥機制研究［7］中發(fā)現(xiàn)LINC00460在耐藥患者中表達量顯著升高，其可促進非小細胞肺癌的侵襲、生長和對吉非替尼的靶向治療耐藥；進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-769-5p可與EGFR mRNA的3′UTR特異性結合，導致EGFR mRNA表達降低，而LINC00460可發(fā)揮海綿吸附作用吸附miR-769-5p，促進EGFR蛋白過表達，從而增加非小細胞肺癌細胞對吉非替尼化療藥物的耐藥性。同樣，在一項關于胃癌進展的機制研究中發(fā)現(xiàn)，CASC9通過海綿吸附miR-370，升高其靶基因EGFR的表達，進而激活下游ERK/AKT信號通路，促進胃癌細胞的增殖［8］。因此，lncRNA可作為miRNA海綿吸附與EGFR結合的miRNA，進而調控EGFR的表達水平，激活相關信號通路，導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，該機制可能為制定新型抗腫瘤治療策略提供重要依據。

1.2 LncRNA在轉錄及轉錄后水平上調控EGFR及相關信號通路

在RNA的調節(jié)方面，lncRNA對EGFR及相關信號通路的調控方式主要包括作為蛋白質支架對EGFR的轉錄發(fā)揮選擇性剪切作用和轉錄后與EGFR mRNA結合調節(jié)其穩(wěn)定性。

真核細胞在轉錄過程中可以通過選擇性剪切作用將單個基因剪切成編碼多種蛋白質的RNA［17-18］，而lncRNA可作為蛋白質支架募集相關可變剪切因子，改變EGFR轉錄時的可變剪切模式。目前已知EGFR轉錄本可通過選擇性剪切作用產生4種亞型（A～D），這4種亞型對酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的敏感性不同。TAN等［9］在頭頸部鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)了1個位于EGFR外顯子20上的同義突變EGFR-Q787Q（SNP ID，rs10251977；c.2361G＞A）對吉非替尼反應異常，并且發(fā)現(xiàn)攜帶G/G和A/A兩種不同基因型的頭頸部鱗狀細胞癌細胞系通過調控lncRNA EGFR-AS1的穩(wěn)定性來影響EGFR亞型的差異表達。同時發(fā)現(xiàn)該SNP位點還位于EGFR基因座的反義非編碼轉錄本lncRNA EGFR-AS1中，利用單核苷酸編輯技術替換EGFR-AS1的轉錄本中的核苷酸可以逆轉G/G基因型細胞系對EGFR TKI的耐藥性；進一步研究發(fā)現(xiàn)降低EGFR-AS1的表達水平可以導致EGFR亞型A和D的差異性剪切，升高EGFR亞型D的表達水平可增加腫瘤對EGFR TKI的敏感性。還有研究［10］發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細胞癌中EGFR基因座反義非編碼轉錄本EGFR-AS1的遺傳變異rs10251977（G＞A）可調節(jié)EGFR亞型A和D的表達。與正常組織相比，EGFR-AS1在口腔鱗狀細胞癌組織中表達上調；進一步研究發(fā)現(xiàn)其可以誘導EGFR亞型A和D的差異性剪切，且EGFR亞型A表達與EGFR-AS1表達呈正相關；生物學信息學分析表明可變剪切標記H3K36me3的富集和包含在EGFR外顯子15a和15b周圍的內含子polyA位點有助于跳過外顯子15b，并且EGFR-AS1可能作為rs10251977位點的蛋白質支架，募集與多聚嘧啶區(qū)結合蛋白（polypyrimdine tract binding protein 1，PTBP1）相關的可變剪切因子，導致15b的外顯子跳躍，促進對TKI不敏感的EGFR亞型A的表達，導致腫瘤發(fā)生TKI耐藥［10］。

LncRNA也在EGFR轉錄后階段發(fā)揮調控作用，lncRNA可與mRNA的部分堿基配對，促進其衰變并抑制其翻譯，調控蛋白質的合成［19-20］。LncRNA可與EGFR mRNA結合，調節(jié)mRNA穩(wěn)定性，進而影響EGFR蛋白的翻譯過程，從而直接影響EGFR蛋白的表達。例如，lncRNA EGFR-AS1在胃癌細胞增殖過程中發(fā)揮促進作用，其在胃癌細胞中表達上調，可通過促進EGFR下游的PI3K/AKT信號通路促進胃癌細胞增殖，主要作用是維持EGFR mRNA的穩(wěn)定性［11］。EGFR-AS1在膀胱癌中也通過類似的機制促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。EGFR-AS1與膀胱癌患者的預后不良密切相關，其與EGFR的表達呈高度正相關，敲除EGFR-AS1后EGFR mRNA表達水平降低；機制研究發(fā)現(xiàn)EGFR-AS1可直接結合EGFR mRNA并增加其穩(wěn)定性，進而促進EGFR mRNA的表達，可能調節(jié)免疫相關信號通路傳導，促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲能力［12］。

因此，lncRNA可以作為蛋白質支架或直接結合mRNA，參與EGFR的轉錄和轉錄后的過程，影響EGFR的表達，進而導致TKI耐藥的發(fā)生和免疫信號通路的改變，該機制可能對腫瘤耐藥和免疫治療策略提供重要依據。

1.3 LncRNA與蛋白相互作用調控EGFR及相關信號通路

LncRNA可以與EGFR蛋白相互作用調控EGFR的降解。在腫瘤中，lncRNA可以阻斷EGFR發(fā)揮作用后的泛素化降解過程，導致EGFR信號通路持續(xù)激活，促進腫瘤的增殖、侵襲、轉移等。LncRNA還可以與EGFR蛋白的胞內結構域（氨基酸1001-1052）直接特異性結合，增強并維持EGFR酪氨酸位點（主要是Tyr1405）的磷酸化，啟動下游的信號通路。在肝細胞癌中調節(jié)性T細胞（Treg）能對腫瘤相關免疫微環(huán)境起到抑制作用，lnc-EGFR通過刺激Treg的分化抑制細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）活性，促進腫瘤的免疫抑制［13］。進一步機制研究表明，lnc-EGFR的R1區(qū)域可能與EGFR的氨基酸序列直接結合，在EGF刺激后可以增強并維持EGFR在酪氨酸Tyr1045、Tyr1068和Tyr1173位點的磷酸化，阻止E3泛素連接酶c-CBL與其結合，導致泛素化過程被阻斷，增強EGFR的穩(wěn)定性，使其下游EGFR/RAS/MEK/AP1和AP-1/NFAT1信號通路過度激活，同時AP-1/NF-AT1作為EGFR和lnc-EGFR的轉錄因子又可誘導它們的表達，EGFR的顯著表達阻斷了CTL的增殖，削弱了CD8+T細胞抗腫瘤作用，最終促進肝細胞癌的免疫抑制［13］。在胃癌細胞中，LINC01485表達水平與EGFR表達水平呈正相關，LINC01485可與c-CBL競爭結合EGFR蛋白上的Tyr1045磷酸化位點，增強EGFR的磷酸化，干擾c-CBL的連接和后續(xù)EGFR蛋白降解，并激活下游的AKT信號通路，促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲［14］。

此外，lncRNA還可以與泛素化過程中的相關蛋白質結合，影響EGFR蛋白的降解過程。有研究［15］發(fā)現(xiàn)lncRNA DUXAP9-206在非小細胞肺癌中過表達并增強了細胞的遷移、增殖和侵襲能力；進一步的機制研究表明，細胞質中的DUXAP9-206通過與E3泛素連接酶Cbl-b直接相互作用，阻斷Cbl-b和EGFR的結合，減少EGFR蛋白的降解，導致下游ERK/AKT信號通路激活，從而促進非小細胞肺癌細胞的惡性生物學行為。LncRNA對泛素化過程的阻斷，增強了EGFR蛋白的表達，激活了下游ERK/AKT信號通路，最終促進腫瘤的增殖、遷移等，該機制可能對腫瘤的分子靶向治療有重要意義。

2 CircRNA在腫瘤中對EGFR及相關信號通路的作用機制

研究表明，circRNA主要通過充當RNA海綿吸附其他非編碼RNA發(fā)揮間接調控作用，其中與miRNA的相互作用最為常見［21］。在食管鱗狀細胞癌的機制研究［22］中發(fā)現(xiàn)，circRNA作為miRNA海綿調控EGFR的機制，miR-1299可以直接結合EGFR mRNA的3′UTR，抑制EGFR的表達，進而抑制其下游的AKT-mTOR信號通路激活，促進食管鱗狀細胞癌細胞由饑餓或雷帕霉素誘導的自噬，而過表達circRNA ciRS-7后，ciRS-7可以吸附結合miR-1299，靶向EGFR-AKT-mTOR信號通路，從而抑制自噬過程。

既往研究認為circRNA主要通過充當miRNA海綿或蛋白質支架發(fā)揮作用。但也有研究表明circRNA可以借助無限開放閱讀框（infinite open reading frame，iORF）發(fā)生翻譯［23］，直接和EGFR蛋白相結合，減弱EGFR蛋白的內吞和降解。在一項關于膠質母細胞瘤的研究［24］中發(fā)現(xiàn)相比于鄰近正常腦組織，膠質母細胞瘤組織中的circ-EGFR和EGFR mRNA表達水平均呈高表達，并且circ-EGFR高表達提示預后不良。同時機制研究表明，circ-EGFR可以在體內借助iORF滾動翻譯和程序化-1核糖體移碼（-1 programmed ribosomal frameshifting，-1PRF）誘導框外終止密碼子（stop codon，OSC）翻譯重復的氨基酸序列，進而形成滾動翻譯EGFR（rolling-translated EGFR，rtEGFR），rtEGFR可以直接和膜上的EGFR蛋白胞外結構域Ⅳ（主要是1545、1556、1562和1592）結合，顯著阻礙EGFR的內吞和泛素化降解，導致ERK/AKT等下游通路激活，增強膠質母細胞瘤的致瘤性。因此，circRNA借助miRNA海綿作用和iORF翻譯作用，可以間接調控EGFR的表達和直接結合EGFR蛋白，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這為證實circRNA在腫瘤治療中的作用提供了研究依據。

3 總結與展望

EGFR及其下游信號通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究揭示了EGFR與lncRNA和circRNA之間的密切相關，lncRNA和circRNA通過復雜的調控機制參與調控EGFR及相關通路，成為了腫瘤中的關鍵調控分子。已有的報道發(fā)現(xiàn)lncRNA和circRNA在EGFR的轉錄、翻譯、降解等方面發(fā)揮著重要的作用，EGFR相關非編碼RNA的研究可能是未來腫瘤分子標志物和靶向治療的重要方向，而針對相關非編碼RNA開發(fā)相應的治療策略研究可能為腫瘤靶向治療提供新的思路。