三疣梭子蟹P-gp蛋白在氟苯尼考代謝中的功能研究

徐 垚，邵慧鑫，高保全，李 健，蔡月鳳，任憲云

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實驗室／江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇連云港 222005；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實驗室，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實驗室-海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東青島 266237；4.水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306）

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我國北部省份產(chǎn)量最高的一種海產(chǎn)食用蟹類［1］，據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計［2］，2020年我國三疣梭子蟹的養(yǎng)殖面積有206.71 km2，產(chǎn)量達(dá)10.089 5萬t。然而，隨著三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，也出現(xiàn)養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化、水體中病原大量滋生、病害頻發(fā)等問題，給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙其持續(xù)、健康發(fā)展。近年來，三疣梭子蟹在人工育苗-養(yǎng)成-商品蟹出池的各個時期均有病害發(fā)生，嚴(yán)重時死亡率高達(dá)80%以上，其中危害較嚴(yán)重的是細(xì)菌性疾病和寄生蟲?。?-4］。目前，水產(chǎn)藥物因其療效顯著、生產(chǎn)使用簡便、成本低等特點(diǎn)成為水產(chǎn)動物病害防治的主要手段之一。我國作為水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，抗菌藥物使用量占全球抗菌藥物使用量的1／4［5］。

氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)LR）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常用的抗菌藥物之一，為一種氯霉素的含氟抗菌類似物［6］，具有廣譜性、易吸收、用藥后體內(nèi)分布廣泛且低殘留等藥理學(xué)特性，可與細(xì)菌70S核糖體的50S亞基緊密結(jié)合［7］，有效抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成來發(fā)揮殺滅作用，被廣泛用于預(yù)防或治療由弧菌引起的感染［8］。在海水養(yǎng)殖環(huán)境中，F(xiàn)LR的主要來源包括養(yǎng)殖過程中的直接使用和隨地表徑流匯入兩類［9］。據(jù)監(jiān)測，我國近岸海域中FLR的含量可達(dá)42 ng·L-1［10］。在實際養(yǎng)殖過程中，存在不合理用藥甚至濫用藥物現(xiàn)象。進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)境的抗菌藥物會誘發(fā)養(yǎng)殖生物本身的條件致病菌；養(yǎng)殖水環(huán)境中的微生物和養(yǎng)殖沉積物中的微生物產(chǎn)生耐藥性；FLR還會在養(yǎng)殖對象體內(nèi)殘留，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)，如引起氧化應(yīng)激［11］、抑制機(jī)體的新陳代謝和生長過程［12］、擾亂機(jī)體行為和免疫反應(yīng)［13］，以及改變相關(guān)代謝通路的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)等［14-16］，最終破壞養(yǎng)殖生態(tài)平衡［17］。同時，長期或高劑量的使用抗菌藥物還會影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生理機(jī)能，并引發(fā)一系列水產(chǎn)養(yǎng)殖動物食品安全問題［18］。因此，解析養(yǎng)殖動物對藥物的代謝特征，優(yōu)化漁藥的使用方案和消解路徑，盡量減少藥物在機(jī)體內(nèi)的殘留，從而降低漁藥對水環(huán)境和人類健康的潛在危害，對我國海水養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

腺苷三磷酸結(jié)合盒（adenosine triphosphatebinding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，參與磷脂、固醇、膽汁酸、肽類及各類藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。P-糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠在多藥抗性腫瘤細(xì)胞系中過度表達(dá)［19］。在人類癌細(xì)胞中，P-gp蛋白過度表達(dá)能夠逆濃度梯度將藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使人類癌細(xì)胞對藥物的耐藥性增強(qiáng)［20］；但同時，作為環(huán)境毒物的外排泵，P-gp蛋白通過和ATP結(jié)合后水解產(chǎn)生的能量，將外源性環(huán)境毒物排至胞外。據(jù)網(wǎng)站https：／／go.drugbank.com統(tǒng)計，目前已知的轉(zhuǎn)運(yùn)底物已經(jīng)超過350種。研究表明，藥物在生物體內(nèi)的代謝過程可分為3大階段，即Ⅰ相反應(yīng)、Ⅱ相反應(yīng)和Ⅲ相代謝。其中Ⅲ相代謝是由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的ABCB、ABCC、ABCG等藥物代謝相關(guān)蛋白將Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出體外的過程［21］。目前，胡鯤 等［22］發(fā) 現(xiàn)，P-gp蛋 白 在 尼 羅 羅 非 魚（Oreochromis niloticus）體內(nèi)參與恩諾沙星的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝過程；于旋等［23］發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹ABCG蛋白參與氟苯尼考的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝過程，提供了一種從分子水平揭示水產(chǎn)動物體內(nèi)藥物代謝的思路。另外，P-gp蛋白的外排功能可被多種化合物誘導(dǎo)或抑制［24-25］，誘導(dǎo)劑處理可上調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)運(yùn)活力，從而減少胞內(nèi)外源性有害物質(zhì)累積，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用［26］；而維拉帕米（verapamil，VER）、環(huán)孢素A（cyclosporin A）、長春新堿（vincristine）等作為Pgp蛋白的抑制劑，可以通過破壞ATP的水解、競爭結(jié)合位點(diǎn)等方式來抑制P-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能［27-33］。于旋等［23］通過有無注射ABCG蛋白特異性抑制劑（FTC）對三疣梭子蟹組織中FLR累積及消除的變化，進(jìn)一步證明三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對FLR的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

為研究三疣梭子蟹P-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，本研究首次克隆Ptabcb1基因并分析其結(jié)構(gòu)特征和細(xì)胞亞定位；采用肌肉注射不同濃度的FLR以及聯(lián)合注射VER和40 mg·kg-1FLR給藥的方法，研究FLR處理下PtP-gp蛋白外排活性的響應(yīng)變化，旨在為進(jìn)一步了解P-gp蛋白介導(dǎo)甲殼類動物解毒的分子防御機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用三疣梭子蟹采自山東濰坊昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。三疣梭子蟹的養(yǎng)殖水泥池面積為30 m3（4.0 m×5.0 m×1.5 m），養(yǎng)殖密度為每池30只，水深為（35.0±0.5）m，水溫為（25.0±0.5）℃，溶解氧為（5.5±0.2）mg·L-1，鹽度31，pH 8.2。選取三疣梭子蟹體質(zhì)量為（32.66±6.27）g的健康個體，養(yǎng)殖池暫養(yǎng)一周，日換水量為總池水的1／3，定時投喂新鮮餌料，投喂量為蟹體質(zhì)量的1／10。通過對三疣梭子蟹的尾足檢查，選擇處于蛻皮間期的個體進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2 PtP-gp蛋白編碼基因Ptabcb1的cDNA全長擴(kuò)增與生物信息學(xué)分析

通過查找自建三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組文庫（SRA ID：7632672）中Ptabcb1基因的序列信息，對獲得的Ptabcb1基因的部分序列進(jìn)行PCR驗證后，再進(jìn) 行5＇-和3＇-cDNA末 端 快 速 擴(kuò) 增（rapidamplification of cDNA ends，RACE），以 獲 取Ptabcb1基因的全長cDNA序列。RACE擴(kuò)增條件為：94℃，預(yù)變性3 min；94℃，變性30 s，68℃，退火30 s，72℃，延伸3 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72℃下延伸10 min，12℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，切膠回收后，與PMD18-T載體（寶生物，大連）連接克隆后，送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行菌液測序。實驗中所有使用的引物均由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，具體序列信息見表1。

利用TMpred軟件［34］和SMART軟件［35-36］進(jìn)行蛋白信號肽預(yù)測。使用Clustal Omega軟件對三疣梭子蟹和其他物種的P-gp蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，并用MEGA 6.0軟件以鄰接法（neighbour-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，10 000次Bootstrap重復(fù)檢驗進(jìn)化樹的置信度。

1.3 Ptabcb1基因的組織特異性表達(dá)和熒光原位雜交分析

采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測三疣梭子蟹Ptabcb1基因在鰓、肝胰腺、肌肉、心臟、胃、腸和血淋巴組織中的相對表達(dá)量。取30～50 mg新鮮組織樣品，按照Trizol一步法提取總RNA，按照PrimeScriptTMRT Reagent試劑盒（含有g(shù)DNA去除劑）（Perfect Real Time）（寶生物，大連）說明進(jìn)行cDNA模板的制備。按照ChamQTMSYBR?Color qPCRMaster Mix試劑盒說明書進(jìn)行實驗，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法確定相對表達(dá)量，所用熒光定量引物的擴(kuò)增效率均在1.8～2.2之間，序列詳見表1。

根據(jù)Ptabcb1基因的保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計RNA熒光探針Ptabcb1-ISH（表1），由上海Generay公司合成。用冷凍切片機(jī)（THERMO，美國）將三疣梭子蟹的肝胰腺切成8μm的組織切片。將組織切片在25℃條件下靜置10 min風(fēng)干待用，之后放入4% PFA-10×PBS（pH 7.2）中固定10 min。將組織切片在1×PBS（pH 7.2）中洗滌2次后，在0.2% Triton 100-1×PBS中浸泡30min。用稀釋后的探針Ptabcb1-ISH（1μm）在25℃的耐光容器中孵育2 h，用1×PBS（pH7.2）沖洗3次，每次沖洗5min，并用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，CAS號：28718-90-3）（Beyotime，上海）對細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后，在載玻片上添加抗熒光淬滅封片液（Beyotime，上海）。用雙光子激光共聚焦顯微鏡（LSM710 NLO，德國）觀察組織切片，分別用Zen 2009 Light Edition軟件（Carl Zeiss，德國）和Photoshop CS5.0軟件（Adobe，美國）輸出和分析熒光圖像。

表1 實驗中所用引物序列Tab.1 Sequence of primers used in this study

1.4 FLR和VER注射對Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活力影響

實驗用FLR原粉購于德邦制藥公司（CAS號：73231-34-2，含量98%），PtP-gp蛋白的特異性抑制劑VER購于sigma公司（CAS號：152-11-4）。參照GIACOMINI等［37］的方法，將FLR原粉溶于鹽溶液，鹽溶液成分包含NaCl（468.0 mM）、KCl（11.5 mM）、CaCl2（11.0 mM）、MgSO4（18.0 mM）、2.0 NaHCO3、HEPES（10.0 mM），pH為7.4。

采用肌肉注射的方式，對三疣梭子蟹分別注射20 mg·kg-1、40 mg·kg-1和80 mg·kg-1濃度的FLR溶液。將上述劑量的FLR溶液用25號無菌注射器注射到三疣梭子蟹第四步足與體壁關(guān)節(jié)膜處的肌肉中，注射劑量為1 mL·kg-1。同時，在40mg·kg-1的FLR注射試驗組中，使用Pgp蛋白抑制劑VER探究PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，于注射FLR前1 h，將10μM劑量的VER鹽溶液注射到三疣梭子蟹體內(nèi)。注射后，分別于0、1、3、6、12、24、48 h和72 h取樣，每組設(shè)3個平行，每個平行組取6個蟹，選取處于蛻皮間期的個體，取出血淋巴、肝胰腺、鰓和肌肉組織，用4℃生理鹽水洗滌后，各組織分成兩等份，在液氮中快速冷凍，-80℃保存，分別用于FLR含量測定和總RNA提取。

采用FANG等［38］的方法進(jìn)行組織中FLR的提取和分析。取適量各組織樣品，解凍后稱重，充分研磨。加入2 mL乙酸乙酯后，震蕩2 min，5 000 r·min-1離心10 min后取上清，重復(fù)上述步驟兩次對殘渣再提取。將上清液移至干凈的離心管中，混合上清液用渦流蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥。將蒸發(fā)器中殘留物溶解在1 mL流動相和1 mL正己烷的液體混合物中，充分溶解后轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中。5 000×g離心5 min后，用0.22μm一次性針頭式過濾器過濾底層液體，然后進(jìn)行高效液相色譜分析。采用Agilent Tc-C18色譜柱（5 mm×250 mm×5μm），用A：乙腈和B：磷酸鹽（pH 3.42）為溶劑梯度洗脫。梯度為：82% A／18% B，持續(xù)20 min，柱溫30℃，流速0.8 mL·min-1，熒光檢測（激發(fā)波長278 nm，發(fā)射波長460 nm），進(jìn)樣量：20μL。

P-gp蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性的定義如下：

式中，CFLR為40 mg·kg-1FLR肌注在三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺、鰓和肌肉中的FLR含量。CFLR+VER為抑制劑VER聯(lián)合40 mg·kg-1FLR肌注在三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺、鰓和肌肉中的FLR含量。

將各處理組的新鮮組織樣品參照1.3方法制備成cDNA模板，采用qRT-PCR方法檢測Ptabcb1基因的相對表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以3組獨(dú)立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），利用Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異顯著，確定對照組與試驗組個體之間的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtP-gp蛋白基因的全長cDNA序列與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過RACE克隆獲得PtP-gp蛋白編碼基因的cDNA序列，命名為Ptabcb1，該基因cDNA序列長度為4 942 bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）為3 522 bp，共編碼1 173個氨基酸，命名為PtP-gp蛋白，預(yù)測分子量為127.96 kDa（圖1）。Ptabcb1基因序列已提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫（GenBank ID：KY487995）。

采用Clustal Omega多序列比對（ClustalW 2.1）分析表明，PtP-gp蛋白與人（Homo sapiens）、褐家鼠（Mus musculus）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）的同源蛋白P-gp的相似度分別為51.83%、51.31%、45.29%和73.46%（圖1）。對PtP-gp蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行TMpred［34］預(yù)測和SMART［35-36］預(yù)測，PtP-gp蛋白包含兩個典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，14個跨膜螺旋，以及保守的Walker A區(qū)、Q-loop環(huán)、ABC信號肽、Walker B區(qū)、D-loop環(huán)和H-loop環(huán)（圖2）。

圖1 物種P-gp同源蛋白氨基酸序列比對分析Fig.1 M ultiple sequence alignment analysis of P-gp homologous proteins from five species

圖2 PtP-gp蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.2 Prediction ofmembrane spanning domains of P-gp homologous proteins from P.trituberculatus

采用NJ法對PtP-gp蛋白和NCBI數(shù)據(jù)庫中20個物種的同源蛋白P-gp的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，PtP-gp蛋白與脊尾白蝦P-gp蛋白聚為一支（BP＝100），節(jié)肢動物門物種聚為一大支（BP＝97），為單系群；軟體動物門物種進(jìn)化地位多樣，分布于進(jìn)化樹的基部；魚類兩物種聚為一支（BP＝100），脊椎動物聚為一大支（BP＝100），位于進(jìn)化樹的最頂層（圖3）。

圖3 基于21個物種的P-gp同源蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on P-gp am ino acid sequences from 21 species

2.2 Ptabcb1基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

Ptabcb1基因在三疣梭子蟹各組織中均有表達(dá)，在心臟組織中表達(dá)量最低，在肝胰腺和腸組織中表達(dá)量相對較高，分別為心臟組織中表達(dá)量的7.49倍和5.89倍，Ptabcb1基因在肌肉和血淋巴組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與心臟相近（3.65倍和2.12倍）（圖4）。

圖4 Ptabcb1基因在三疣梭子蟹不同組織中的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of Ptabcb1 gene in different tissues of P.trituberculatus

2.3 Ptabcb1基因在三疣梭子蟹肝胰腺中的原位雜交

采用熒光原位雜交法檢測Ptabcb1基因在三疣梭子蟹的肝胰腺組織中的主要表達(dá)位點(diǎn)，結(jié)果如圖5所示。DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色，熒光素異硫氰酸酯異構(gòu)體（FITC）標(biāo)記mRNA為綠色。綠色熒光主要分布在肝胰腺的細(xì)胞質(zhì)中，說明Ptabcb1基因的特異性熒光探針（綠色熒光）多與肝胰腺的細(xì)胞質(zhì)發(fā)生雜交，表明PtP-gp蛋白主要在肝胰腺的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

圖5 Ptabcb1基因在三疣梭子蟹肝胰腺組織中的原位雜交Fig.5 In situ m RNA hybridization（ISH）of Ptabcb1 gene in P.trituberculatus hepatopancreas

2.4 PtP-gp蛋白在三疣梭子蟹中的累積／外排實驗

由表2可知，給藥注射后的1～24 h期間內(nèi)，與單獨(dú)注射40 mg·kg-1FLR處理組相比，10 μM的VER與40 mg·kg-1的FLR聯(lián)合給藥處理組中，三疣梭子蟹血淋巴、肌肉和鰓組織中FLR的含量顯著增加（表2）；24 h之后，各組織中FLR含量逐漸下降；在給藥后48～72 h期間，各組織中的FLR含量接近單獨(dú)注射40 mg·kg-1的FLR處理組水平。

表2 單獨(dú)和聯(lián)合給藥處理后FLR在三疣梭子蟹組織中的含量對比Tab.2 Concentration of florfenicol in P.trituberculatus tissues after single and combined adm inistration

由表3可知，各濃度FLR給藥注射后，能夠顯著抑制三疣梭子蟹血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓組織中PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活力。在血淋巴和肌肉組織中的PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活力變化趨勢相近，注射FLR初期（1～3 h），PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活力顯著降低（P＜0.05），之后抑制作用隨時間延長逐漸變小，48 h后抑制作用消失（P＞0.05）；在肝胰腺組織中，F(xiàn)LR注射對PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活力的抑制作用稍滯后，在注射后3～12 h期間抑制作用最大（P＜0.05），24 h后抑制作用隨時間延長逐漸變小，72 h后抑制作用消失（P＞0.05）；FLR注射對三疣梭子蟹鰓組織中PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活力影響相對較小，僅在注射后的6～12 h內(nèi)存在顯著抑制作用（P＜0.05），其他時間內(nèi)均無顯著影響（P＞0.05）。

表3 三疣梭子蟹各組織中PtP-gp蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性Tab.3 PtP-gp activities in P.trituberculatus tissues

2.5 不同濃度FLR注射對三疣梭子蟹Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

不同濃度FLR注射后，能夠顯著影響三疣梭子蟹肝胰腺、鰓和肌肉組織中的Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，肌肉組織中的誘導(dǎo)作用較強(qiáng)烈，均呈現(xiàn)時間-劑量效應(yīng)（圖6）。80 mg·kg-1的FLR注射1 h后，各組織中Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（P＜0.05），3～12 h期間維持相對較高的誘導(dǎo)作用，12 h后誘導(dǎo)作用顯著降低，實驗結(jié)束時（72 h）各組織中Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄水平仍顯著高于對照組水平（P＜0.05）。40 mg·kg-1的FLR注射能夠立即（1 h內(nèi)）引起肝胰腺和肌肉組織中Ptabcb1基因的上調(diào)表達(dá)；鰓組織中誘導(dǎo)作用稍滯后（3 h），在注射后3～12 h內(nèi)誘導(dǎo)作用較高，12 h后逐漸減小，48 h后恢復(fù)到對照組水平，誘導(dǎo)作用消失；注射后1～24 h內(nèi)肌肉組織中Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)被誘導(dǎo)最顯著，實驗結(jié)束時（72 h）肌肉組織中Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄水平仍顯著高于對照組水平（P＜0.05）。20 mg·kg-1的FLR注射后，能夠引起三疣梭子蟹肝胰腺組織中Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄水平在短時間內(nèi)（3～6 h）上調(diào)表達(dá)（P＜0.05），然后恢復(fù)到對照組水平；在鰓組織中誘導(dǎo)作用持續(xù)時間略長（3～24 h）（P＜0.05）；肌肉組織在整個實驗周期內(nèi)能夠持續(xù)顯著誘導(dǎo)Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（P＜0.05）。

圖6 不同濃度FLR對三疣梭子蟹組織中Ptabcb1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Fig.6 Effect of different concentrations of florfenicol on expression levels of Ptabcb1 in P.trituberculatus tissues

2.6 FLR與VER聯(lián)合注射給藥對三疣梭子蟹Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

FLR與VER聯(lián)合注射給藥對三疣梭子蟹組織中Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響如圖7所示。與單獨(dú)注射10μM的VER或40 mg·kg-1的FLR相比，VER和FLR聯(lián)合注射給藥能夠顯著增加Ptabcb1基因在肝胰腺組織中的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)作用（P＜0.05），3～24 h期間誘導(dǎo)作用較大。而在鰓組織和肌肉組織中，分別在FLR注射后1～3 h和6～12 h期間能夠顯著抑制FLR對Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)作用（P＜0.05）。實驗周期內(nèi)，10μM的VER單獨(dú)注射均未顯著影響三疣梭子蟹各組織中Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平（P＞0.05）。

圖7 FLR和VER單獨(dú)和聯(lián)合注射給藥對三疣梭子蟹組織中Ptabcb1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Fig.7 Effect of single and combined florfenicol and verapam il adm inistration on expression levels of Ptabcb1 in P.trituberculatus tissues

3 討論

在甲殼動物中，關(guān)于abcb1基因的研究是比較少的，目前發(fā)現(xiàn)并克隆該基因的物種只有斑節(jié)對蝦（Penaeusmonodon）（NC_051420.1）、鵝頸藤壺（Pollicipes pollicipes）（NW_023596225.1）、大型蚤（Daphnia magna）（NC_046174.1）和鮭魚虱（Lepeophtheirus salmonis）（NC_052131.1）。本研究首次克隆獲得三疣梭子蟹的Ptabcb1基因序列，其ORF為3 522 bp，共編碼1 173個氨基酸，具有2個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding domains，NBDs）和2個跨膜結(jié)構(gòu)域（membrane spanning domains，MSDs），其中NBD結(jié)構(gòu)域的組成為Walker A區(qū)、Q-loop環(huán)、ABC信號肽、Walker B區(qū)、D-loop環(huán)和H-loop環(huán)，符合ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征［39-40］，推測這些保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑tP-gp蛋白在跨膜傳遞底物時的能量獲取和特異性識別轉(zhuǎn)運(yùn)底物中必不可少［41］。同時ABC信號肽是ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的特征標(biāo)簽序列，存在于Walker A區(qū)和Walker B區(qū)之間，PtP-gp蛋白的ABC信號肽序列相對保守，為［411MSGGQKQRVAIARAL425］和 ［1074LSGGQKQRVAIARAL1088］，與脊尾白蝦的P-gp同源蛋白序列相比，ABC信號肽序列高度保守，推測該結(jié)構(gòu)域與ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能發(fā)揮有重要作用［42］。多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹Ptabcb1編碼的蛋白氨基酸與甲殼動物中的脊尾白蝦同源性最高，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中也與脊尾白蝦聚為一支（BP＝100），親緣關(guān)系最近，因而表明Ptabcb1基因為ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因。目前，SHUKLE等［43］發(fā)現(xiàn)，ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有的保守跨膜結(jié)構(gòu)域，與其宿主植物內(nèi)源性或外源性有毒底物的代謝和解毒有關(guān)，同時LUCKENBACH等［40］在關(guān)于ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)、蛋白定位和功能的研究中，也證實ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在加州貽貝（Mytilus californianus）鰓組織中作為一道生理屏障，可以清除異源物質(zhì)，抵抗外源物的侵犯。根據(jù)Ptabcb1基因序列和結(jié)構(gòu)的生物學(xué)分析，推測PtP-gp蛋白可能具有與其他物種的同源蛋白相同或相似的外排作用。

研究表明，各種化合物暴露均會引起P-gp蛋白活性或相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化［44］。多 環(huán) 芳 烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）、多 氯 聯(lián) 苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）和多溴聯(lián)苯醚（poly brominated diphenyl ethers，PBDEs）等持久性有機(jī)污染物暴露，能夠顯著改變魚類、軟體動物和甲殼動物體內(nèi)P-gp蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。FRANZELLITTI等［44］研究了氟西?。╢luoxetine）對貽貝（Mytilus edulis）P-gp蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)30 ng·L-1和300 ng·L-1的氟西汀處理后，貽貝P-gp蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著下調(diào)。在本研究中，對三疣梭子蟹注射不同濃度的FLR后，其Ptabcb1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)被顯著誘導(dǎo)，表明FLR為Ptabcb1基因的潛在轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑，在對魚類、軟體動物和其他甲殼動物的外源污染物毒理響應(yīng)研究中，也得到類似結(jié)果［45-47］。迄今為止，P-gp蛋白的底物、抑制劑和誘導(dǎo)劑已被廣泛應(yīng)用于各種外源污染物毒理學(xué)研究中［48］，如異源性生物制劑、重金屬和油脂分散劑等，均會上調(diào)P-gp蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［49］。而VER是P-gp蛋白的一種外排活性抑制劑［44］。對多種水生無脊椎動物如海洋貽貝的研究發(fā)現(xiàn)，外源污染物和P-gp蛋白抑制劑聯(lián)合處理會導(dǎo)致P-gp蛋白底物即外源污染物積累成倍增加［44］。在本研究中，F(xiàn)LR與VER聯(lián)合注射以劑量依賴性顯著抑制了PtP-gp蛋白活性，導(dǎo)致VER注射處理組三疣梭子蟹體內(nèi)FLR含量升高，此現(xiàn)象是由于抑制劑VER與PtP-gp蛋白的特異性結(jié)合，使得FLR與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合受阻，因而FLR難以排出體外而累積。實驗結(jié)果初步證實了PtP-gp蛋白對FLR具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性，轉(zhuǎn)運(yùn)活力的大小與組織中FLR的累積量相對應(yīng)，表明在FLR的細(xì)胞解毒過程中發(fā)揮著重要作用。另外，Ptabcb1基因在三疣梭子蟹各組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果顯示，該基因在三疣梭子蟹的肝胰腺組織中高表達(dá)。肝胰腺是三疣梭子蟹解毒代謝的最主要的器官，Ptabcb1在肝胰腺中的高表達(dá)進(jìn)一步也說明了PtP-gp蛋白在三疣梭子蟹肝胰腺組織可以作為機(jī)體抵御外源污染物的第一道防線，能夠直接將底物或其代謝終產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外［50］。