植物乳桿菌L3對(duì)發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)的影響

孔 婧，李夢(mèng)洋，權(quán) 鑫，齊富玲，靳宏宇，孫慶申*

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2.黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

傳統(tǒng)發(fā)酵乳通常以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵劑對(duì)鮮奶發(fā)酵，所得產(chǎn)品含有豐富蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)備受歡迎[1]。益生菌與發(fā)酵劑聯(lián)合發(fā)酵可在保持發(fā)酵乳良好風(fēng)味基礎(chǔ)上提高其功能性。因此，將傳統(tǒng)發(fā)酵劑以外乳酸菌應(yīng)用于發(fā)酵乳中，在保證發(fā)酵乳良好風(fēng)味品質(zhì)基礎(chǔ)上，可與市售發(fā)酵劑協(xié)同作用，使發(fā)酵乳具有更多功能特性，進(jìn)一步提高發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)[2]。

在提高發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)相關(guān)研究中，Makki等研究乳糖氧化酶作為生物防腐劑在乳制品中應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)乳糖氧化酶在有殘留乳糖和低pH的乳制品中對(duì)常見(jiàn)腐敗菌具有顯著抑菌效果[3]。Belguesmia等從原料乳中分離出一株Lactobacillus harbinensisK.V9.3.1NP，驗(yàn)證該菌株離心上清液中有機(jī)酸對(duì)漢遜德巴利酵母、擴(kuò)展青霉、婁地青霉等真菌抑菌性[4]。Delavenne等研究表明乳酸菌抑菌性是菌株代謝產(chǎn)生的肽、有機(jī)酸以及衍生物協(xié)同作用，在發(fā)酵乳中添加天然具有抑菌性能益生菌或其代謝產(chǎn)物是今后食品防腐、延長(zhǎng)貨架期新的研究方向[5]。

植物乳桿菌是可以產(chǎn)多種益生物質(zhì)的乳酸菌，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵。植物乳桿菌可通過(guò)代謝產(chǎn)生多種產(chǎn)物，如有機(jī)酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫、雙乙酰、抗菌肽等抑制病原菌生長(zhǎng)[6]，分泌胞外的多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[7]。目前，植物乳桿菌已應(yīng)用于酸奶、泡菜、發(fā)酵乳制品及其他發(fā)酵食品中，可提高食品風(fēng)味，改善食品品質(zhì)、延長(zhǎng)食品保質(zhì)期[8-9]。因此，具有益生功能性的植物乳桿菌在食品開(kāi)發(fā)中備受關(guān)注。

乳制品（包括發(fā)酵乳制品如奶酪和酸奶）的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)季節(jié)、市場(chǎng)上流通時(shí)間、冷藏能力不足等因素均導(dǎo)致酸奶污染，特別是真菌污染，安全性令人擔(dān)憂[10]。利用植物乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素特性[11]，將其投入鮮奶，與發(fā)酵劑聯(lián)合作用，是解決上述問(wèn)題良好途徑。乳酸菌是一類對(duì)宿主有益的微生物，可調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持機(jī)體健康，被應(yīng)用于各類發(fā)酵食品中，如酸奶、羊棲菜漿等[12]。本課題組前期從市售保存期較長(zhǎng)的酸菜中分離得到一株細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為植物乳桿菌，NCBI序列號(hào)為MT781360。經(jīng)驗(yàn)證，該菌所產(chǎn)細(xì)菌素性能穩(wěn)定，具有廣譜抑菌性能[13]。本文旨在將植物乳桿菌L3作為協(xié)同發(fā)酵劑，研究其與市售發(fā)酵劑聯(lián)合使用對(duì)發(fā)酵乳貯藏品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用原材料（伊利全脂滅菌純牛奶、白砂糖）均購(gòu)自哈爾濱市（學(xué)府路）中央紅超市。

植物乳桿菌L3（L.plantarumL3）是從長(zhǎng)期貯藏的酸菜中分離得到的一株植物乳桿菌。

市售發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）來(lái)源于法國(guó)丹尼斯克883型。

1.2 方法

1.2.1 L.plantarum L3菌株活化及擴(kuò)培

將冷凍保藏的L.plantarumL3無(wú)菌接種于滅菌MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。重復(fù)3次，吸取2 mL活化L.plantarumL3培養(yǎng)液加入40 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行第一次擴(kuò)培。再將第一次擴(kuò)培后菌液40 mL全部加入800 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行第二次擴(kuò)培。

1.2.2 發(fā)酵乳制備

將全脂滅菌純牛奶、7%（g·mL-1）白砂糖混合均質(zhì)，85℃條件下巴氏殺菌15 min，再將其冷卻至42～45℃，將L.plantarumL3與市售發(fā)酵劑按照1∶1混合，投入鮮奶中發(fā)酵（以下簡(jiǎn)稱CLFM組），分別以L.plantarumL3單獨(dú)發(fā)酵（以下簡(jiǎn)稱LFM組）和市售發(fā)酵劑單獨(dú)發(fā)酵（以下簡(jiǎn)稱CFM）鮮奶作為對(duì)照，接種量均為108cfu·mL-1，42℃下發(fā)酵，發(fā)酵完成后將發(fā)酵乳置于4℃冰箱內(nèi)后熟并貯藏。

1.2.3 L.plantarum L3對(duì)發(fā)酵乳成品營(yíng)養(yǎng)成分的影響

蛋白質(zhì)測(cè)定：參照GB 5009.5-2016中凱氏定氮法測(cè)定[14]。

脂肪測(cè)定：參照GB 5009.6-2016中索氏抽提法測(cè)定[15]。

灰分測(cè)定：參照GB 5009.4-2016測(cè)定[16]。

總固形物測(cè)定：將培養(yǎng)皿烘至恒重，記質(zhì)量為m1，取一定量發(fā)酵乳樣品于培養(yǎng)皿中，記質(zhì)量為m2，放入烘箱將其烘干至恒重，記質(zhì)量為m3。

多糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法測(cè)定。

1.2.4 L.plantarum L3對(duì)發(fā)酵乳貯藏期間品質(zhì)影響

分別測(cè)定第0、7、14和21天發(fā)酵乳。

酸度測(cè)定：稱取不同組發(fā)酵乳樣品10 g，記質(zhì)量M，20 mL蒸餾水稀釋樣品，滴加酚酞作為指示劑搖勻，0.1 mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至溶液變?yōu)槲⒓t色，30 s內(nèi)不變色，記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積V，計(jì)算樣品酸度。試樣中酸度數(shù)值采用以下公式計(jì)算，以吉爾涅爾度（°T）表示，記為X。每組樣品取3個(gè)平行樣作測(cè)定。

式中，X-試樣酸度（°T）；C-氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（mol·L-1）；V-滴定時(shí)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；M-試樣質(zhì)量（g）；0.1-氫氧化鈉（mol·L-1）。

持水力測(cè)定：取10 g不同組發(fā)酵樣品（W1），于4℃下以955×g離心10 min，棄掉上清液，記錄此時(shí)發(fā)酵乳質(zhì)量（W2），每組樣品取3個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定。持水力（WHC）按照以下公式計(jì)算：

質(zhì)構(gòu)測(cè)定：利用TA-XT EXPRESS物性測(cè)試儀測(cè)定發(fā)酵乳硬度、膠黏性、彈性、內(nèi)聚性和回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)性能。具體參數(shù)如下：探頭選用P/36R；設(shè)定測(cè)試距離為15.0 mm；測(cè)定前、測(cè)定時(shí)和測(cè)定后探頭速度分別為5.0、2.5、2.0 mm·s-1；測(cè)定時(shí)間為5.00 s，感應(yīng)力為5.0 g。每組樣品取3個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定。

pH測(cè)定：分別在發(fā)酵乳后熟12 h之后，取貯藏第0、7、14和21天發(fā)酵乳，通過(guò)pH計(jì)測(cè)定，每組樣品同時(shí)測(cè)定3組平行。

活菌數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.35-2016[17]中涂板計(jì)數(shù)法，分別在不同組發(fā)酵乳后熟12 h后，取貯藏第0、7、14和21天發(fā)酵乳，測(cè)定其活菌數(shù)，每組樣品同時(shí)測(cè)定3組平行。研究不同組發(fā)酵乳貯藏期間活菌數(shù)變化情況。

感官評(píng)定：參照發(fā)酵乳食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010[18]感官要求，利用模糊數(shù)學(xué)法作感官評(píng)定。選取10人組成感官評(píng)價(jià)小組，10位品評(píng)員由3名男性和7名女性組成，年齡在22～25歲之間，在評(píng)價(jià)前，對(duì)評(píng)定組成員進(jìn)行評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)，確保評(píng)價(jià)結(jié)果客觀及一致性，增強(qiáng)評(píng)價(jià)一致性，以發(fā)酵乳氣味、組織狀態(tài)、色澤等為評(píng)定指標(biāo)，采用10分打分法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.5 發(fā)酵乳貯藏期間霉變情況測(cè)定

分別在不同組發(fā)酵乳后熟12 h后，將發(fā)酵乳開(kāi)蓋貯藏在室溫環(huán)境下，觀察貯藏第0、7和14天發(fā)酵乳霉變情況，與相同時(shí)間在4℃封蓋貯藏發(fā)酵乳對(duì)比，分析L.plantarumL3對(duì)發(fā)酵乳貯藏期間霉變程度的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行制圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳品質(zhì)評(píng)價(jià)

2.1.1 發(fā)酵乳酸度和持水力測(cè)定

根據(jù)圖1A可知，CLFM和CFM在4 h同時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，酸度分別為（71.33±1.60）°T和（73.17±1.26）°T，LFM在9 h才達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，酸度達(dá)（70.33±2.02）°T。以上結(jié)果表明，L.plantarumL3在CLFM牛乳中不延長(zhǎng)其發(fā)酵完成時(shí)間，兩組發(fā)酵劑均在4 h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，且4 h時(shí)酸度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由圖1B可以看出，CLFM持水力為78.09%±0.84%；CFM持水力為75.16%±1.04%；LFM持水力為79.55±1.72%，CLFM與LFM持水力無(wú)顯著差異，均顯著高于CFM（P＜0.05）。

圖1 植物乳桿菌L3、市售發(fā)酵劑以及二者協(xié)同發(fā)酵乳酸度（A）以及持水力（B）變化Fig.1 Changes of acidity(A)and water holding capacity(B)LFM,CFM and CLFM

2.1.2 L.plantarum L3對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的影響

由表1可知，CLFM和LFM發(fā)酵乳硬度、膠黏性、回復(fù)性均高于CFM，說(shuō)明添加L.plantarumL3作為發(fā)酵劑可提高發(fā)酵乳硬度、膠黏性和回復(fù)性，均與CFM質(zhì)構(gòu)特性存在顯著差異性（P＜0.05）。

表1 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性分析Table 1 Textural characteristics analysis of different fermented milks

2.1.3 L.plantarum L3對(duì)發(fā)酵乳感官的影響

如圖2A可知，協(xié)同發(fā)酵組和單獨(dú)發(fā)酵組發(fā)酵乳外觀無(wú)明顯差異，色澤光亮、乳白色，較少或無(wú)明顯乳清析出。表明L.plantarumL3作為發(fā)酵劑不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳感官造成不利影響。

通過(guò)感官小組10分制打分法以及模糊數(shù)學(xué)法計(jì)算得到如圖2B發(fā)酵乳感官得分結(jié)果，可知3組發(fā)酵乳得分均在6.5分以上，協(xié)同發(fā)酵組和市售發(fā)酵組得分均在7分以上且兩者無(wú)顯著差異，高于LFM得分，具有顯著差異（P＜0.05）。

圖2 發(fā)酵乳成品（A）及其感官得分（B）Fig.2 Fermented milk products(A)and their sensory score(B)

2.1.4 L.plantarum L3對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的影響

圖3A表明3種發(fā)酵乳組內(nèi)差異不明顯，不同發(fā)酵乳產(chǎn)品之間存在一定差異。由圖3B可知，3組發(fā)酵乳氣味在W1C（芳香成分，苯類）、W3C（芳香成分、氨類靈敏）、W5C（短鏈烷烴芳香成分靈敏）、W1W（對(duì)硫化物靈敏）中差異小；CLFM發(fā)酵乳在W2W（芳香成分，對(duì)有機(jī)硫化物靈敏）較其他兩組發(fā)酵乳更加突出；LFM發(fā)酵乳在W1S（對(duì)甲基類靈敏）和W2S（對(duì)醇，醛酮靈敏）相較其他兩組發(fā)酵乳更突出。

圖3 電子鼻評(píng)價(jià)發(fā)酵乳PCA分析（A）其雷達(dá)圖（B）Fig.3 Evaluation of fermented milk by E-nose PCA(A)and its radar chart(B)

傳感器名稱對(duì)應(yīng)性能描述：W1C（芳香成分，苯類），W5S（靈敏度大，對(duì)氮氧化合物很靈敏），W3C（芳香成分、氨類靈敏），W6S（對(duì)氫化物有選擇性），W5C（短鏈烷烴芳香成分靈敏），W1S（對(duì)甲基類靈敏），W1W（對(duì)硫化物靈敏），W2S（對(duì)醇，醛酮靈敏），W2W（芳香成分，對(duì)有機(jī)硫化物靈敏），W3S（對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴靈敏）。

2.2 發(fā)酵乳基礎(chǔ)成分分析

2.2.1 L.plantarum L3對(duì)發(fā)酵乳營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

由表2可知，3組發(fā)酵乳蛋白質(zhì)含量均高于國(guó)標(biāo)要求2.3 g·100 g-1，脂肪含量也均符合國(guó)標(biāo)要求2.5 g·100 g-1以上。3組發(fā)酵乳不同指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，各組發(fā)酵乳不同指標(biāo)間均無(wú)顯著差異。

表2 發(fā)酵乳成分含量分析Table 2 Fermented milk composition content analysis

以上結(jié)果表明，3組發(fā)酵乳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，不同發(fā)酵劑組間無(wú)顯著差異，說(shuō)明L.plantarumL3作為發(fā)酵劑使用時(shí)不會(huì)對(duì)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量造成不良影響，可用于發(fā)酵。

2.2.2L.plantarum L3對(duì)發(fā)酵乳多糖含量的影響

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=16.264x-0.0009，R2=0.9983，線性關(guān)系良好，依據(jù)該方程計(jì)算多糖含量，各發(fā)酵乳在發(fā)酵前后多糖含量見(jiàn)圖4A，通過(guò)計(jì)算可得出發(fā)酵前3組發(fā)酵乳多糖含量分別為（425.15±12.30）、（369.87±7.76）和（442.23±11.18）μg·mL-1；發(fā)酵后多糖含量分別為（718.60±16.02）、（429.20±11.69）和（746.99±5.59）μg·mL-1；發(fā)酵前后3組發(fā)酵乳多糖含量分別升高（293.45±8.55）、（59.33±7.75）和（304.79±8.25）μg·mL-1，明顯看出有L.plantarumL3參與發(fā)酵的發(fā)酵乳多糖顯著增加，其中LFM最高，與3組發(fā)酵乳持水力、質(zhì)構(gòu)結(jié)果一致，表明添加L.plantarumL3可改善發(fā)酵乳品質(zhì)與其產(chǎn)胞外多糖有關(guān)。

2.3 發(fā)酵乳貯藏期間品質(zhì)變化

2.3.1 貯藏期發(fā)酵乳pH變化

由圖4B可知，在21 d貯藏期內(nèi)各組發(fā)酵乳pH均呈緩慢降低趨勢(shì)，協(xié)同發(fā)酵組、CFM、LFM

pH分別由最初（4.62±0.03）、（4.67±0.04）和（4.34±0.06）下降至（4.23±0.01）、（4.22±0.02）和（4.12±0.01），3組發(fā)酵乳在貯藏期內(nèi)pH分別下降（0.39±0.02）、（0.45±0.02）和（0.23±0.07）。

2.3.2 貯藏期發(fā)酵乳酸度的變化

由圖4C可知，貯藏期間CLFM、CFM、LFM酸度分別由最初（73.40±4.19）、（75.00±0.50）、（79.83±1.60）°T升高至（96.50±1.00）、（101.17±3.75）、（105.17±1.61）°T。

2.3.3 貯藏期發(fā)酵乳持水力變化

由圖4D可知，在第0天時(shí)3組發(fā)酵乳持水力分別為79.35%±1.45%、79.22%±1.34%、80.75%±1.25%，第7天時(shí)3組發(fā)酵乳持水力分別為73.01%±0.75%、71.84%±1.04%、73.35%±1.31%，可看出前7 d LFM持水力最高，CLFM次之，CFM最低，但并無(wú)顯著差異（P＞0.05）；第14天時(shí)3組發(fā)酵乳持水力分別為76.11%±0.76%、72.54%±0.89%、75.34%±0.33%，L.plantarumL3參與發(fā)酵兩組持水力均高于CFM，且差異顯著；第21天時(shí)3組發(fā)酵乳持水力分別為74.96%±1.02%、71.23%±2.11%、71.71%±0.51%，可見(jiàn)，CLFM持水力均顯著高于其他兩組（P＜0.05）。TPA模式（2次咀嚼）測(cè)定發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)是通過(guò)模擬人類咀嚼食物測(cè)定樣品的質(zhì)構(gòu)特性。由圖4E見(jiàn)，在21 d貯藏期3組發(fā)酵乳的硬度變化趨勢(shì)相同，在21 d貯藏期內(nèi)CLFM和LFM硬度均比CFM高，可能與L.plantarumL3可產(chǎn)胞外多糖有關(guān)，胞外多糖與蛋白質(zhì)基質(zhì)間發(fā)生靜電相互作用，形成更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致發(fā)酵乳硬度升高。以上結(jié)果表明添加L.plantarumL3作為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，可提高發(fā)酵乳硬度。

2.3.4 貯藏期發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)變化

由圖4F可見(jiàn)，CLFM和LFM膠黏性均高于CFM，3組發(fā)酵乳在21 d內(nèi)變化規(guī)律呈現(xiàn)一致，但變化程度不同，可能與該結(jié)果的L.plantarumL3產(chǎn)胞外多糖有關(guān)，發(fā)酵乳膠黏性得以提高。由圖4G可知，LFM彈性在21 d內(nèi)呈緩慢下降趨勢(shì)，相比其他兩組整體彈性較小。

2.3.5 貯藏期發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化

由圖4H可知，3組發(fā)酵乳在21 d貯藏期內(nèi)活菌數(shù)均高于國(guó)標(biāo)要求，均在107cfu·mL-1以上，但貯藏期間活菌數(shù)整體呈下降趨勢(shì)。在第0天時(shí)，CLFM活菌數(shù)菌高于其他兩組，但無(wú)顯著差異；7 d后CLFM活菌數(shù)較低于CFM但高于LFM；14 d時(shí)CLFM活菌數(shù)為7.55±0.11 lg（cfu·mL-1）略低于CFM活菌數(shù)7.8±0.13 lg（cfu·mL-1），無(wú)顯著差異；14 d后其活菌數(shù)下降速度明顯低于CFM，CLFM和CFM活菌數(shù)相差較小；21 d貯藏期內(nèi)，LFM的發(fā)酵乳活菌數(shù)均低于其他兩組，但仍在7 lg（cfu·mL-1）以上。

2.4 貯藏期發(fā)酵多糖含量的變化

由圖4I可知，在21 d的貯藏期內(nèi)3組發(fā)酵乳多糖含量均升高，在第0天3組發(fā)酵乳多糖含量分別為（718.60±16.02）、（429.20±11.69）和（746.99±5.58）μg·mL-1，CLFM和LFM無(wú)顯著性差異，與CFM差異顯著（P＜0.05）；貯藏21 d之后3組發(fā)酵乳多糖含量分別為（1 849.13±13.14）、（1 210.65±21.33）和（2 048.58±16.26）μg·mL-1。

圖4 發(fā)酵乳發(fā)酵前后多糖含量及其貯藏期間品質(zhì)變化Fig.4 Changes of polysaccharide content in fermented milk before and after fermentation and quality during storage

2.5 發(fā)酵乳貯藏期間霉變情況變化

由圖5A可知，3組發(fā)酵乳在室溫（20±5）℃開(kāi)蓋貯藏時(shí)，發(fā)生不同程度腐敗變質(zhì)。第7天時(shí)僅市售發(fā)酵劑出現(xiàn)明顯腐敗變質(zhì)，發(fā)酵乳表面存在明顯青色和發(fā)黃霉菌菌落，發(fā)酵乳乳清析明顯，該組發(fā)酵乳品質(zhì)明顯變差；第14天時(shí)3組發(fā)酵乳均產(chǎn)生不同程度變質(zhì)，CFM腐敗變質(zhì)最為嚴(yán)重，3個(gè)平行樣品均發(fā)生明顯腐敗變質(zhì)，CLFM 3個(gè)平行樣品出現(xiàn)不同程度腐敗變質(zhì)，較CFM明顯腐敗程度低，LFM 3個(gè)平行樣品均無(wú)明顯腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，僅一個(gè)樣品存在霉菌菌落。

發(fā)酵乳室溫（20±5）℃封蓋貯藏21 d期間，僅CFM發(fā)酵乳發(fā)黃且存在青色霉菌菌落現(xiàn)象，其他兩組無(wú)明顯霉變情況（見(jiàn)圖5B）。為保證發(fā)酵乳品質(zhì)最佳，一般在4℃下貯藏和運(yùn)輸，酵母菌最適生長(zhǎng)溫度為20～30℃，大多數(shù)霉菌最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃。由圖5C可知，21 d貯藏期內(nèi)3組發(fā)酵乳均無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)霉變情況。為排除偶然性，將市售發(fā)酵劑中霉變最嚴(yán)重的發(fā)酵乳原液回接到新鮮牛乳中，通過(guò)不同發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，觀察在室溫（20±5）℃開(kāi)封蓋貯藏14 d內(nèi)霉變情況佐證L.plantarumL3對(duì)抑制發(fā)酵乳腐敗變質(zhì)的準(zhǔn)確性。

圖5 發(fā)酵乳室溫開(kāi)蓋貯藏（A）、室溫封蓋貯藏（B）、4℃封蓋貯藏（C）期間霉變情況變化Fig.5 Changes of mildew during open storage of fermented milk at room temperature(A),sealed storage at room temperature(B),and sealed storage at 4℃(C)

由圖6可見(jiàn)，3組不同發(fā)酵劑組發(fā)酵乳在14 d內(nèi)霉變情況，第7天時(shí)CFM出現(xiàn)明顯霉菌菌落，其他兩組未觀察到明顯霉菌菌落，且CFM出現(xiàn)菌落與回接樣品出現(xiàn)菌落類似；在第14天，3組發(fā)酵乳均出現(xiàn)與回接樣品類似的霉菌菌落，但3組發(fā)酵乳霉變程度不同，CFM 3個(gè)平行樣霉變情況較重，其次是CLFM，最后是LFM，驗(yàn)證L.plantarumL3確實(shí)有抑制發(fā)酵乳腐敗變質(zhì)的性能，且效果明顯。

圖6 霉變發(fā)酵乳回接到鮮奶中，再用不同發(fā)酵劑發(fā)酵后酸奶在貯藏14 d期間質(zhì)量變化Fig.6 Changes of quality of yogurt during storage for 14 days after the mildewed fermented milk was returned to fresh milk and then fermented with different starter agents

3 討論

貯藏期間發(fā)酵乳pH和酸度變化可反映發(fā)酵乳后酸化程度。CLFM和LFM pH下降幅度均低于CFM pH下降幅度，故采用L.plantarumL3協(xié)同市售發(fā)酵劑發(fā)酵乳可降低后酸化現(xiàn)象。發(fā)酵結(jié)束時(shí)及貯藏期間pH均與市售發(fā)酵劑無(wú)顯著差異。許女等研究發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌MA2的酸奶后酸化程度顯著降低[19]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，添加L.plantarumL3發(fā)酵乳在貯藏期間pH下降幅度較CFM小，CLFM和LFM酸度上升幅度較CFM慢，以上結(jié)果表明L.plantarumL3作為發(fā)酵劑可延緩發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象。根據(jù)國(guó)標(biāo)要求，發(fā)酵乳酸度需達(dá)到70°T以上，因此，本試驗(yàn)發(fā)酵乳發(fā)酵終點(diǎn)以酸度達(dá)到70°T為標(biāo)準(zhǔn)。Xue等研究表明，發(fā)酵乳凝乳時(shí)間與發(fā)酵菌株產(chǎn)酸能力以及產(chǎn)酸速率有關(guān)[20]。L.plantarumL3作為發(fā)酵劑單獨(dú)發(fā)酵時(shí)發(fā)酵終點(diǎn)比其他兩組晚，說(shuō)明保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮主要作用。

本研究中，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，添加L.plantarumL3作為協(xié)同發(fā)酵劑不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳感官造成不利影響，但L.plantarumL3單獨(dú)發(fā)酵，因其pH低，口感過(guò)酸，導(dǎo)致該組發(fā)酵乳整體感官評(píng)分低于其他兩組，因此L.plantarumL3可作為協(xié)同發(fā)酵劑參與發(fā)酵，單獨(dú)作為發(fā)酵劑發(fā)酵效果相較市售發(fā)酵劑并不理想。電子鼻傳感器檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度可反映出發(fā)酵乳中揮發(fā)性物質(zhì)濃度差異[21]。本試驗(yàn)中，添加L.plantarumL3的發(fā)酵乳中甲基類、醇類、醛酮類等氣味成分增加，改善發(fā)酵乳風(fēng)味。王麗萍等研究表明不同發(fā)酵劑產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物影響產(chǎn)品的風(fēng)味，與本試驗(yàn)結(jié)果一致[22]。出現(xiàn)以上結(jié)果可能因發(fā)酵劑菌株改變，導(dǎo)致菌株共生關(guān)系發(fā)生改變，從而代謝產(chǎn)物（揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)）種類和含量發(fā)生變化[23]。

持水力是評(píng)價(jià)發(fā)酵乳品質(zhì)重要指標(biāo)，發(fā)酵乳持水力隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，L.plantarumL3作為協(xié)同發(fā)酵劑可提高發(fā)酵乳持水力，尤其是在貯藏期后期效果顯著；L.plantarumL3作為發(fā)酵劑單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，雖然在14 d前持水力均高于CFM，但在21 d時(shí)，持水力相較其他兩組下降多（下降3.63%）。Casarotti等研究表明，益生菌產(chǎn)胞外多糖可提高發(fā)酵乳持水力[25]，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)L.plantarumL3協(xié)同發(fā)酵時(shí)可提高發(fā)酵乳持水力，在第14天和第21天時(shí)L.plantarumL3參與發(fā)酵的兩組持水力均高于CFM，這可能與L.plantarumL3產(chǎn)胞外多糖有關(guān)，Xu等研究發(fā)現(xiàn)胞外多糖導(dǎo)致發(fā)酵乳持水力升高[26]。

研究發(fā)現(xiàn)持水力隨pH降低而減小，這是因pH降低引起酸乳凝膠中蛋白質(zhì)形成網(wǎng)絡(luò)重新排列，導(dǎo)致粒子-粒子連接數(shù)量增加，凝膠收縮，乳清析出，發(fā)酵乳持水力降低[25]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳持水力隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低，在貯藏末期，LFM的pH相對(duì)其他兩組最低，其持水力比其他兩組低，CLFM和LFM發(fā)酵乳硬度、膠黏性、回復(fù)性與CFM組相比均有所提高。王鑫磊等研究發(fā)現(xiàn)，添加馬乳酒樣乳桿菌ZW3可顯著提高發(fā)酵乳膠黏性、咀嚼性、內(nèi)聚性和恢復(fù)性，與本研究結(jié)果相似[27]。以上結(jié)果表明，添加L.plantarumL3作為協(xié)同發(fā)酵劑可明顯改善發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)性能，使發(fā)酵乳具有更好穩(wěn)定性。

發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)是發(fā)酵乳品質(zhì)評(píng)價(jià)關(guān)鍵指標(biāo)，可反映發(fā)酵乳內(nèi)部組織狀態(tài)。CLFM彈性在21 d內(nèi)呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，第21天時(shí)彈性最低，說(shuō)明發(fā)酵乳最初彈性較高，但在貯藏期后期彈性降低快，分析原因可能與L.plantarumL3協(xié)同發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生胞外多糖有關(guān)，產(chǎn)生胞外多糖使其發(fā)酵乳組織狀態(tài)穩(wěn)定。CFM發(fā)酵乳在第0天和第21天時(shí)彈性高，在第7天和第14天彈性與LFM相似，此過(guò)程說(shuō)明CFM在21 d的貯藏期內(nèi)發(fā)酵乳組織結(jié)構(gòu)由最初穩(wěn)定性差到穩(wěn)定性變好再到變差，貯藏期后期穩(wěn)定性相較其他兩組更差。Lang等研究表明，添加植物乳桿菌A3可提高酸奶感官品質(zhì)，與本試驗(yàn)結(jié)果相似，添加L.plantarumL3參與發(fā)酵可降低發(fā)酵乳彈性，使發(fā)酵乳具有更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[23]。乳酸菌代謝產(chǎn)生EPS可使發(fā)酵乳質(zhì)地均勻細(xì)膩、口感細(xì)滑、減少乳清析出，目前已成為發(fā)酵乳制品中新型添加劑，Hu等研究發(fā)酵乳在貯藏期內(nèi)多糖含量變化可解釋發(fā)酵乳貯藏期間部分品質(zhì)變化[28]。

發(fā)酵乳貯藏第7天到第21天內(nèi)LFM多糖含量最高，其次是CLFM，最后是CFM，且差異顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果與持水力、質(zhì)構(gòu)等結(jié)果一致，說(shuō)明L.plantarumL3在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可產(chǎn)生胞外多糖，可提高發(fā)酵乳持水力、質(zhì)構(gòu)特性等，改善發(fā)酵乳品質(zhì)。

綜合質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果，添加L.plantarumL3進(jìn)行發(fā)酵，可提高發(fā)酵乳硬度、膠黏性，降低發(fā)酵乳彈性，發(fā)酵乳品質(zhì)更穩(wěn)定，可延緩發(fā)酵乳貨架期。

4 結(jié)論

CLFM和CFM在4 h同時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，LFM在9 h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)；L.plantarumL3協(xié)同發(fā)酵可提高發(fā)酵乳持水力、質(zhì)構(gòu)性能、多糖含量、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，使發(fā)酵乳具有更穩(wěn)定組織狀態(tài)，不會(huì)對(duì)發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)產(chǎn)生負(fù)面影響，可改善發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象，延長(zhǎng)發(fā)酵乳貨架期。L.plantarumL3可增強(qiáng)發(fā)酵乳對(duì)病原菌的抑制，有效抑制發(fā)酵乳中腐敗變質(zhì)。綜上所述，L.plantarumL3作為協(xié)同發(fā)酵劑，發(fā)酵乳獲得更好的感官、營(yíng)養(yǎng)和貯藏品質(zhì)。