水中菌落總數(shù)3種檢測方法的比較

曹新塏，張 琦，尹寶國，張寶華，張雨晨

(北京市自來水集團有限責任公司水質(zhì)監(jiān)測中心，北京 100012)

菌落總數(shù)作為評價水質(zhì)優(yōu)劣的衛(wèi)生指示標準指標，是微生物檢測的重要參數(shù)之一?，F(xiàn)階段國內(nèi)常用的水中菌落總數(shù)檢測方法為傳統(tǒng)平皿計數(shù)法，該方法所使用的營養(yǎng)瓊脂平板不能滿足厭氧菌等特殊細菌的生理需求，導致部分細菌難以繁殖生長[1]。且在整體試驗過程中不僅前處理操作繁瑣，易引入外來污染與人為誤差，同時對實驗室無菌環(huán)境及試驗人員技術(shù)能力要求較高，部分實驗室檢測能力難以達到要求，不適用于實驗室的日常檢測。

酶底物法(SimPlate法)培養(yǎng)基底物可與微生物特異性酶反應生成藍色熒光的物質(zhì)，培養(yǎng)后統(tǒng)計分析得到最終菌落總數(shù)[2-3]。美國環(huán)保署(EPA)于2002年將SimPlate法納入EPA 9215E中，表明飲用水及地表水可以使用其檢測菌落總數(shù)[4]；廣東省地方標準《水中菌落總數(shù)復合酶底物檢測方法》(DB 44/T 1163—2013)[5]于2013年將SimPlate法引入國內(nèi)；國家城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)武漢監(jiān)測站于2019年采用定量盤法檢測水中菌落總數(shù)，該方法的試驗原理與SimPlate法基本一致，其檢測結(jié)果與平皿計數(shù)法相比也沒有顯著的統(tǒng)計學差異[6]；《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—XXXX)(2022年征求意見稿)[7]中也表明，可以使用SimPlate法檢測生活飲用水及水源水的菌落總數(shù)。與平皿計數(shù)法相比，SimPlate法無需配制培養(yǎng)基，采用SimPlate法，不稀釋的情況下1 mL水樣可以檢測738 MPN/mL的菌落總數(shù)，減少了培養(yǎng)基配制及樣品稀釋的誤差，且不需要嚴格的無菌環(huán)境，更適用于檢測水中菌落總數(shù)較高的樣品。

EasyDisc法是對平皿計數(shù)法的革新，于2021年研發(fā)成功，目前還處于試用階段。2022年，孫杰[8]采用EasyDisc法檢測水中菌落總數(shù)，其檢測結(jié)果與平皿計數(shù)法相比沒有顯著的統(tǒng)計學差異。EasyDisc法的PCA培養(yǎng)基脫水固定于47 mm的平皿底部，無需配制，微生物生長的代謝產(chǎn)物與PCA培養(yǎng)基中的顯色物質(zhì)反應生成藍色菌落，便于人工計數(shù)。與平皿計數(shù)法相比，EasyDisc法減少了配制培養(yǎng)基等試驗步驟，試驗操作簡便，生成的藍色菌落便于計數(shù)，顯著降低了外來污染和人為誤差。

本文采用酶底物法、EasyDisc法和平皿計數(shù)法3種方法檢測NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品和實際樣品，并將檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析[9-10]。

1 試驗部分

1.1 試驗設(shè)備

SimPlate法培養(yǎng)基、84孔分配盤、EasyDisc法培養(yǎng)基、NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品、無菌緩沖液、無菌取樣瓶等耗材購自愛德士公司；平皿計數(shù)法使用的營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；試驗使用經(jīng)計量部門校準合格的國產(chǎn)隔水式恒溫生物培養(yǎng)箱，溫控精度為±0.5 ℃。

1.2 試驗步驟

1.2.1 高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品制備

從-10 ℃ 以下的冰柜中取出NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品，常溫狀態(tài)下平衡15 min后，轉(zhuǎn)移至100 mL無菌緩沖液中，水平搖勻，制備成高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品。待樣品完全溶解后，需在30 min內(nèi)完成檢測。

1.2.2 低濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品制備

將1.2.1小節(jié)的高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品充分混勻后，吸取10 mL轉(zhuǎn)移至100 mL無菌取樣瓶中，用無菌水稀釋至刻度線，制備成低濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品。

1.2.3 實際樣品采集

采集北京地區(qū)出廠水、濾池出水及水源水各10組實際水樣，采集過程參照《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集與保存》(GB/T 5750.2—2006)[11]中樣品采集及保存要求，并在4 h內(nèi)完成檢測。

1.2.4 SimPlate法測定水中菌落總數(shù)

量取1 mL待測樣品及9 mL無菌水加入SimPlate法培養(yǎng)基中，充分混勻，轉(zhuǎn)移至84孔分配盤中，水平旋轉(zhuǎn)分配盤使待測樣品均勻分配于每個樣品孔中，多余液體由盤內(nèi)海綿吸收，倒置放入36 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在366 nm紫外燈下統(tǒng)計藍色熒光孔數(shù)，對照MPN表查詢菌落總數(shù)檢測結(jié)果。

1.2.5 EasyDisc法測定水中菌落總數(shù)

量取1 mL待測樣品加入EasyDisc法平皿中，水平混勻，使樣品均勻分布于EasyDisc法平皿中，常溫下靜置20 min，使樣品與培養(yǎng)基充分接觸，正置放入36 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計菌落總數(shù)檢測結(jié)果。

1.2.6 平皿計數(shù)法測定水中菌落總數(shù)

平皿計數(shù)法試驗過程參照《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)[12]中1.1小節(jié)平皿計數(shù)法進行檢測。

2 試驗結(jié)果分析

2.1 高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品檢測結(jié)果分析

將同一高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品以3種方法平行檢測10次。其檢測結(jié)果表明，3種方法檢測結(jié)果的合格率均為100%。為進一步評價3種方法的準確性和穩(wěn)定性，計算10組檢測結(jié)果與真值的相對誤差及檢測結(jié)果的相對標準偏差，可得RSD(平皿計數(shù)法)=9.63%，RSD(SimPlate法)=5.69%，RSD(EasyDisc法)=6.07%，如表1、圖1所示。結(jié)果表明，SimPlate法與EasyDisc法檢測結(jié)果與真值的相對誤差及相對標準偏差均小于平皿計數(shù)法。由此可知，SimPlate法與EasyDisc法檢測高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品時的準確性及穩(wěn)定性優(yōu)于平皿計數(shù)法。

表1 3種方法檢測高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的檢測結(jié)果Tab.1 Detection Results of High Concentration NSI Total Number of Colonies QC Samples by Three Methods

圖1 3種方法檢測高濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品檢測結(jié)果的相對標準偏差Fig.1 Relative Standard Deviation of High Concentration NSI Total Number of Colonies QC Samples by Three Methods

2.2 低濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品檢測結(jié)果分析

為驗證3種方法檢測低濃度樣品的準確性及穩(wěn)定性，分別以3種方法平行檢測同一低濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品10次，最終檢測結(jié)果為檢測結(jié)果×稀釋倍數(shù)。其最終檢測結(jié)果表明，3種方法檢測結(jié)果的合格率均為100%。為進一步評價3種方法檢測低濃度樣品的準確性及穩(wěn)定性，計算10組檢測結(jié)果與真值的相對誤差及檢測結(jié)果的相對標準偏差，可得RSD(平皿計數(shù)法)=12.37%，RSD(SimPlate法)=8.13%，RSD(EasyDisc法)=8.72%，如表2、圖2所示。結(jié)果表明，檢測低濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品時，SimPlate法與EasyDisc法檢測結(jié)果與真值的相對誤差及相對標準偏差均小于平皿計數(shù)法，其準確性及穩(wěn)定性仍優(yōu)于平皿計數(shù)法。

表2 3種方法檢測低濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的檢測結(jié)果Tab.2 Detection Results of Low Concentration NSI Total Number of Colonies QC Samples by Three Methods

圖2 3種方法檢測低濃度NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品檢測結(jié)果的相對標準偏差Fig.2 Relative Standard Deviation of Low Concentration NSI Total Number of Colonies QC Samples by Three Methods

2.3 實際樣品檢測結(jié)果分析

選取北京地區(qū)出廠水、濾池出水及水源水各10組，分別以3種方法檢測選取的30組實際樣品。其中樣品序號21～30為水源水樣品，稀釋10倍后進行檢測，最終檢測結(jié)果=檢測結(jié)果×稀釋倍數(shù)，3種方法的檢測結(jié)果如表3所示。為進一步探究3種方法在檢測實際樣品時是否存在差異性，將3種方法檢測結(jié)果做對數(shù)處理滿足正態(tài)分布后，運用軟件SPSS 軟件進行t檢驗分析，結(jié)果如表4所示。平皿計數(shù)法與SimPlate法、EasyDisc法的泊松相關(guān)系數(shù)分別為0.945、0.981，屬極強相關(guān)性；t檢驗結(jié)果分別為P=0.366(>0.05)、P=0.798(>0.05)，表明平皿計數(shù)法與SimPlate法、EasyDisc法的檢測結(jié)果高度一致，無統(tǒng)計學差異?？烧J為3種方法均可有效檢測水中菌落總數(shù)。

表3 北京地區(qū)實際樣品的3種方法檢測結(jié)果Tab.3 Detection Results of Actual Samples in Beijing by Three Methods

表4 3種方法實際樣品檢測結(jié)果的t檢驗Tab.4 t-Test of Results of Actual Sample by Three Methods

2.4 陰性樣品檢測結(jié)果分析

各選取3組滅菌生理鹽水、無菌純水和無菌緩沖液，在非無菌環(huán)境下分別以3種方法進行檢測，其檢測結(jié)果如表5所示。在非無菌環(huán)境下，平皿計數(shù)法檢測陰性樣品時部分陰性樣品有菌落檢出；SimPlate法和EasyDisc法檢測陰性樣品時所有陰性樣品均未檢出。由此表明，SimPlate法和EasyDisc法可以在非無菌條件下進行試驗，降低了水中菌落總數(shù)檢測項目對實驗室無菌環(huán)境的要求。

表5 陰性樣品的3種方法檢測結(jié)果Tab.5 Detection Results of Negative Samples by Three Methods

3 討論

3.1 NSI菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品檢測結(jié)果分析

檢測20組高濃度和低濃度質(zhì)控樣品時，平皿計數(shù)法共有12組檢測結(jié)果相對誤差不低于10%，大于SimPlate法及EasyDisc法。造成此類結(jié)果的原因是平皿計數(shù)法配制培養(yǎng)基的操作步驟(稱量、溶解、調(diào)節(jié)pH、高壓滅菌、保存及復溶等)過于繁瑣，易引入外來污染，且營養(yǎng)瓊脂生成的菌落顏色較淺，不易觀察，易造成人為計數(shù)誤差；而SimPlate法及EasyDisc法無需配制培養(yǎng)基，特制的培養(yǎng)基與細菌代謝產(chǎn)物發(fā)生反應，生成易觀察的反應產(chǎn)物，減少了外來污染，降低了試驗及人為誤差。

平皿計數(shù)法、SimPlate法及EasyDisc法在檢測高濃度和低濃度質(zhì)控樣品時其檢測結(jié)果與真值相對誤差的標準偏差分別為9.27%、5.75%及5.86%和11.64%、8.30%及8.21%。由上述計算結(jié)果可知SimPlate法和EasyDisc法檢測結(jié)果的真值相對誤差相較于平皿計數(shù)法的真值相對誤差更小，表明SimPlate酶底物法和EasyDisc法的檢測結(jié)果更接近真值，準確度更高，性能更加穩(wěn)定，更適用于水中菌落總數(shù)的檢測。

3.2 實際樣品及陰性樣品檢測

對于出廠水、濾池出水及水源水等實際樣品，SimPlate法及EasyDisc法與平皿計數(shù)法的泊松相關(guān)系數(shù)分別為0.945和0.981，表明兩種檢測方法皆與平皿計數(shù)法具有極強相關(guān)性；同時t檢驗結(jié)果分別為P=0.366(>0.05)、P=0.798(>0.05)，也表明SimPlate法及EasyDisc法與平皿計數(shù)法的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學差異，均可有效檢測水中菌落總數(shù)。在非無菌環(huán)境下SimPlate法和EasyDisc法檢測陰性樣品時陰性樣品均未檢出，表明SimPlate法和EasyDisc法無需在專業(yè)無菌室環(huán)境操作，既滿足實驗室對水中菌落總數(shù)的檢測需求，也降低了實驗室維護無菌環(huán)境的成本。

3.3 SimPlate法和EasyDisc法優(yōu)缺點

SimPlate法和EasyDisc法特異性培養(yǎng)基可與細菌發(fā)生相關(guān)反應，使SimPlate法和EasyDisc法假陰性概率大幅下降。相較于平皿計數(shù)法，SimPlate法結(jié)果判讀方式更簡單，不受菌落蔓延等意外因素的影響，適用于水源水的菌落總數(shù)檢測；而EasyDisc法的47 mm平皿減少占用培養(yǎng)箱空間，適用于大批量樣品及應急樣品的菌落總數(shù)檢測。但EasyDisc法計數(shù)值是0～300 CFU/mL，不太適宜用于原水檢測，當菌落數(shù)較大時，容易發(fā)生菌落蔓延的情況，SimPlate法的操作步驟相對復雜，不利于大批量使用，且兩種方法價格相比平皿法價格較貴。

4 結(jié)論

(1)常用檢測水中菌落總數(shù)的傳統(tǒng)平皿計數(shù)法具有一定的局限性，如配制培養(yǎng)基操作繁瑣、對整體實驗室的無菌環(huán)境及人員能力要求較高等。而SimPlate法和EasyDisc法無需配制培養(yǎng)基，試驗操作過程簡便，更適合實驗室日常檢測。

(2)實驗室使用SimPlate法和EasyDisc法檢測水中菌落總數(shù)，其高濃度與低濃度定量質(zhì)控樣品的檢測結(jié)果準確性及穩(wěn)定性均優(yōu)于傳統(tǒng)的平皿計數(shù)法，實際樣品的檢測結(jié)果與平皿計數(shù)法具有極強相關(guān)性，無統(tǒng)計學差異，檢測結(jié)果準確可靠。

(3)陰性樣品的檢測結(jié)果表明，SimPlate法和EasyDisc法無需在專業(yè)的無菌環(huán)境下操作，降低了實驗室維護無菌室的成本，適用范圍更廣，滿足實驗室對水中菌落總數(shù)的檢測需求。