重樓黃酮的提取工藝及其抗氧化功效驗(yàn)證

張正旭，褚佳豪，周云冬，吳迪，李學(xué)濤，彭效明，李翠清，居瑞軍

（1.北京石油化工學(xué)院，北京 100000；2.云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

重樓為云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖[1]，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效[2]，對(duì)治療跌打損傷有獨(dú)特療效[3]，是多種中成藥的主要原料之一[4-6]。重樓主要含有甾體皂苷、黃酮、多糖、植物脫皮激素和脂肪酸類等活性成分[7-8]。其中，黃酮化合物具有抗炎、殺菌、抗氧化和抗腫瘤等作用[9-11]。

黃酮類化合物是植物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，主要貯藏在葉片之中，是藥用植物的主要活性成分之一，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、消除炎癥、降低血壓、抗衰老等生理活性[12-15]，是制備功能性食品和開發(fā)高效、低毒天然藥物的重要原材料。黃酮一般難溶于水，易溶于乙醇、正丁醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。常見(jiàn)的提取方法有有機(jī)溶劑萃取法、甲醇提取法、堿法及超臨界流體（CO2）萃取法[16-17]。有機(jī)溶劑萃取雖然操作方便，提取率高，但得到的精制物中容易混入較多雜質(zhì)，后續(xù)分離困難；堿法提取雜質(zhì)較少，提取物純度高，但提取率較低；超臨界流體萃取需要在高壓的環(huán)境下進(jìn)行，對(duì)設(shè)備的要求高，提取成本大；甲醇提取法具有提取設(shè)備要求簡(jiǎn)單、產(chǎn)物雜質(zhì)少、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，但甲醇具有揮發(fā)性和毒性[18]。因此，本研究采用乙醇-水溶液作為溶劑，對(duì)重樓中黃酮類化合物進(jìn)行提取，并采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，隨后利用大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，以上樣量、徑高比、洗脫液濃度為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選最佳純化精制工藝，并對(duì)取得的精制物進(jìn)行抗炎功效驗(yàn)證，希望為重樓加工以及黃酮相關(guān)制品的制備工藝提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 UV2600型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SCIENTZ-10型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；DF-101T型集熱式加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器廠）；Centrifuge 5418 R型冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；HBS-1096A型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 藥物與試劑 重樓（產(chǎn)地云南，云南白藥健康產(chǎn)品有限公司）；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：512E031）、硝酸鋁-九水合物、CCK-8、ABTS二銨鹽、Na2EDTA、連苯三酚、K[Fe(CN)6]（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；亞硝酸鈉（分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠）；AB-8、D101、H103、SP825、HP-20大孔吸附樹脂（滄州華眾環(huán)?？萍加邢薰荆籉eSO4·7H2O、K2S2O8、三氯乙酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水楊酸（北京索萊寶科技有限公司）；Tris（批號(hào)：409F051，北京索萊寶科技有限公司）；抗壞血酸（批號(hào)：CAN5456，富士フイルム和光純薬株式會(huì)社）；DPPH[批號(hào)：1898-66-4，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]。

2 方法

2.1 蘆丁線性關(guān)系考察 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，以純化水定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2 mL到具塞試管中，加入70%乙醇水溶液1 mL，再加入5% NaNO2溶液0.3mL，搖勻靜置6min，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10% NaOH溶液3.0 mL，搖勻靜置15 min，配制得到不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)線性是否良好。

2.2 重樓黃酮樣品的含量測(cè)定 取20 g重樓藥材，在常溫下粉碎，過(guò)10目篩。用60%乙醇按料液比為1∶10進(jìn)行回流提取2次，提取時(shí)間為100 min，收集濾液為含黃酮的浸提液。濾液經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥得重樓黃酮樣品D1，取適量重樓黃酮樣品以60%乙醇水溶液溶解定容至100 mL，通過(guò)上述方法測(cè)定其黃酮含量。

2.3 單因素試驗(yàn) 根據(jù)“2.2”項(xiàng)下重樓黃酮的提取條件，固定料液比1∶10，提取時(shí)間100 min，考察乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%對(duì)重樓黃酮提取率的影響；固定乙醇濃度為60%，料液比1∶10，考察提取時(shí)間80、90、100、110、120 min對(duì)重樓黃酮提取率的影響；固定乙醇濃度為60%，提取時(shí)間100 min，考察料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶11、1∶12對(duì)重樓黃酮提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選定提取次數(shù)為2次，選用考察因數(shù)分別為乙醇濃度（X1）、提取時(shí)間（X2）、料液比（X3）。采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以重樓總黃酮含量（Y）為因變量，優(yōu)化提取工藝。因素值及水平值見(jiàn)表1。

表1 重樓黃酮提取的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素和水平

2.5 靜態(tài)吸附與解吸附 分別取10 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的AB-8、D101、H103、SP825、HP-20大孔樹脂裝入250 mL的錐形瓶中，再加入濃度為0.175 mg/mL重樓黃酮D1粗提液100 mL，以25 ℃恒溫振蕩24 h，待樹脂充分吸附粗提液后，過(guò)濾，測(cè)定濾液重樓總黃酮的含量，計(jì)算樹脂的吸附量。

將上述吸附飽和的大孔樹脂裝入250 mL錐形瓶中，加入95%乙醇100 mL，25 ℃恒溫振蕩24 h充分解析后，過(guò)濾，測(cè)定濾液的重樓黃酮的含量，計(jì)算解析率。根據(jù)吸附率和解析率確定最適合的大孔樹脂。

2.6 靜態(tài)吸附曲線的繪制 分別取10 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的D101大孔樹脂裝入250 mL的錐形瓶中，再加入濃度為0.08 mg/mL的重樓黃酮D1粗提液100 mL，25 ℃恒溫水浴，200次/h振蕩。每隔一段時(shí)間取樣，進(jìn)行吸光度檢測(cè)，求得黃酮濃度，進(jìn)而計(jì)算樹脂吸附量。樹脂進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

2.7 黃酮精制樣品的制備 根據(jù)上述篩選的最佳樹脂D101進(jìn)行濕法裝柱，將重樓黃酮D1粗提液配制成50 mg/mL，靜態(tài)吸附3 h，然后分別用20%乙醇（2 BV）、40%乙醇（2 BV）及60%乙醇（4 BV）進(jìn)行洗脫，收集洗脫液進(jìn)行減壓濃縮進(jìn)行凍干，依次標(biāo)注D2、D3和D4，取適量依次測(cè)量其含量。

2.8 重樓黃酮的抗氧化功效驗(yàn)證

2.8.1 DPPH自由基清除能力檢測(cè) 取200 μL的待測(cè)液與等體積的2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻（A1管）；取等體積的水與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻（A2管）；取等體積的無(wú)水乙醇與待測(cè)液混勻（A3管）；反應(yīng)30 min后，在520 nm下測(cè)A1、A2和A3管的吸光度值，按照下面公式計(jì)算各樣品的自由基清除率。稱量0.10 g VC粉末，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配，作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次。

清除率=[(A2+A3)-A1]/A2×100%

2.8.2 OH自由基清除能力檢測(cè) 準(zhǔn)確量取0.166 8 g FeSO4粉末，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。取25 μL的30%H2O2，加40.85 mL蒸餾水稀釋混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。準(zhǔn)確稱量0.041 4 g水楊酸粉末，用無(wú)水乙醇定容到50 mL容量瓶中。稱量0.10 gVC粉末，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配，作為陽(yáng)性對(duì)照。按照表3的方案加入各種試劑，然后在520 nm處測(cè)定吸光度值，按照下面公式計(jì)算各樣品的清除率。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次。（見(jiàn)表2）

表2 OH 自由基清除能力反應(yīng)體系

清除率=[（A-C）-（B-D）]/（A-C）×100%

2.8.3 ABTS自由基的清除能力檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取ABTS二銨鹽60 mg，加蒸餾水16 mL溶解，準(zhǔn)確稱取K2S2O810.8 mg，加蒸餾水16 mL溶解，將等體積的ABTS與K2S2O8溶液混合，室溫避光放置12 h，得ABTS備用液。ABTS備用液加10倍量的蒸餾水稀釋，得ABTS檢測(cè)液。取30 μL的待測(cè)液與300 μL的ABTS檢測(cè)液混勻（A1管），取30 μL蒸餾水與300 μL的ABTS檢測(cè)液混勻（A2管），取30 μL待測(cè)液與300 μL的蒸餾水混勻（A3管），各組混勻后，室溫靜置6 min，在405 nm下測(cè)A1、A2和A3管的吸光度值，按照下面公式計(jì)算各樣品的自由基清除率。稱量0.10 g VC粉末，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配，作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次。

清除率=[(A2+A3)-A1]/A2×100%

2.8.4 對(duì)Fe3＋的還原能力檢測(cè) 取200 μL待測(cè)液，分別加入等體積的磷酸鹽緩沖液（pH值=6.6）及1%K[Fe(CN)6]，混勻后于50 ℃的電熱恒溫水浴鍋中放20 min。急速冷卻，取出后向各管加入200μL的10%三氯乙酸，混勻后，3 500 r/min離心10 min。取上層清液200 μL，依次加入200 μL蒸餾水和50 μL的0.1%FeCl3，混勻，作為待測(cè)組分。在630 nm處測(cè)定吸光度值（A）。A越大，則樣品的還原力越大。稱量0.20 g VC粉末，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配，作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次。

3 結(jié)果

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)定重樓中總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定的一系列濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度值，將數(shù)據(jù)擬合。方程為：Y=12.126X-0.022 2，R2=0.999 3。表示線性較好，可用于試驗(yàn)操作。（見(jiàn)圖1）

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度 隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取量呈先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)重樓黃酮含量達(dá)到最大值時(shí)乙醇濃度為60%，故選取60%乙醇作為提取溶劑。（見(jiàn)圖2）

圖2 乙醇濃度對(duì)重樓黃酮提取效果的影響

3.2.2 提取時(shí)間 重樓黃酮含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為100 min時(shí)，重樓黃酮含量達(dá)到最大值。這可能由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，重樓總黃酮在提取溶劑中被不斷溶出，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其他雜質(zhì)也會(huì)隨之明顯增加，使得重樓黃酮含量下降。因此，選取提取時(shí)間為100min。（見(jiàn)圖3）

圖3 提取時(shí)間對(duì)重樓黃酮提取效果的影響

3.2.3 料液比 在較低料液比時(shí)重樓黃酮含量比較低，隨著料液比的不斷增加，重樓黃酮的含量也在不斷增加。當(dāng)料液比達(dá)到1∶10時(shí)，隨著料液比的不斷增加，重樓黃酮含量逐漸趨于穩(wěn)定。出于時(shí)間、人力資源等因素考慮，選取料液比為1∶10。（見(jiàn)圖4）

圖4 料液比對(duì)重樓黃酮提取效果的影響

3.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果 重樓黃酮的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，模型的方差分析見(jiàn)表4，各交互因素響應(yīng)曲面及相應(yīng)的等高線圖見(jiàn)圖5～7。利用軟件對(duì)重樓黃酮含量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到重樓黃酮含量和乙醇濃度（X1）、提取時(shí)間（X2）和料液比（X3）3三個(gè)自變量之間的模型。回歸方程為：Y=1.06+0.13X1+0.12X2+10.045X3-7.000E-003X1X2+7.000E-003X1X2+7.250E-003X1X2-0.25X12-0.26X22-0.21X32。經(jīng)過(guò)響應(yīng)面的工藝優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝條件為，提取乙醇濃度65.03%，提取時(shí)間104.75 min，料液比1∶10.23。為了方便實(shí)施操作，選取提取乙醇濃度65%，提取時(shí)間105 min，料液比1∶10為最佳提取工藝條件。

表3 重樓黃酮響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 重樓黃酮方差分析結(jié)果

圖5 實(shí)驗(yàn)因素X1和X2 對(duì)結(jié)果Y 影響的響應(yīng)圖與等高線圖

圖6 實(shí)驗(yàn)因素X1和X3 對(duì)結(jié)果Y 影響的響應(yīng)圖與等高線圖

圖7 實(shí)驗(yàn)因素X2和X3 對(duì)結(jié)果Y 影響的響應(yīng)圖與等高線圖

3.4 最佳樹脂的選擇 取質(zhì)量濃度為0.175 mg/mL重樓黃酮D1提取液100 mL,進(jìn)行大孔樹脂吸附試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示大孔樹脂吸附率由高到低依次為AB-8、D101、SP825、HP-20、H103，數(shù)據(jù)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而大孔樹脂解析率由高到低依次為HP-20、D101、SP825、H103、AB-8，數(shù)據(jù)間的差異較為明顯。以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：雖然HP-20解析率相對(duì)優(yōu)于D101，但究其原因是吸附量小于D101，導(dǎo)致解析率高于D101，解析量低于D101，綜合比較純化效果可知D101純化效果最好。（見(jiàn)表5）

表5 5 種大孔樹脂對(duì)重樓黃酮的吸附解析效果

3.5 靜態(tài)吸附曲線 重樓黃酮靜態(tài)吸附曲線見(jiàn)圖8。在3 h內(nèi)，D101大孔吸附樹脂對(duì)重樓黃酮的吸附量隨時(shí)間的增加而增加，在3 h后吸附趨于平衡狀態(tài)，即3 h就可達(dá)到重樓黃酮靜態(tài)吸附平衡，且最大吸附量為2.2 mg/g。

圖8 大孔樹脂吸附重樓黃酮吸附量隨時(shí)間的變化關(guān)系圖

3.6 黃酮精制樣品的制備 用不同濃度的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集不同洗脫段溶液進(jìn)行減壓濃縮、冷凍干燥，依次標(biāo)注為D2、D3和D4，凍干后稱質(zhì)量并測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同組分重樓黃酮的含量信息表

3.7 重樓黃酮抗氧化功效驗(yàn)證結(jié)果分析

3.7.1 DPPH自由基清除能力檢測(cè)結(jié)果 重樓黃酮D1～D4組分都有一定的DPPH自由基清除作用。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率分別為（81.94±7.39）%、（32.49±6.08）%、（60.38±2.84）%、（55.49±0.91）%。由于重樓黃酮D2和D3與DPPH反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在520 nm處有吸收，導(dǎo)致其自由基清除結(jié)果不明顯。但結(jié)合到實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象，可知DPPH自由基清除能力大小為：重樓黃酮D2＞重樓黃酮D3＞重樓黃酮D1＞重樓黃酮D4。（見(jiàn)圖9）

圖9 重樓黃酮不同組分對(duì)DPPH 自由基清除能力比較

3.7.2 OH自由基清除能力檢測(cè)結(jié)果 重樓黃酮D1～D4組分都具有一定的OH自由基清除作用。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，OH自由基的清除率分別為（39.11±1.67）%、（74.02±3.78）%、（57.53±3.08）%、（29.31±1.40）%?？芍煌M分對(duì)OH自由基清除能力大小為：重樓黃酮D2＞重樓黃酮D3＞重樓黃酮D1＞重樓黃酮D4。（見(jiàn)圖10）

圖10 重樓黃酮不同組分對(duì)OH 自由基清除能力比較

3.7.3 ABTS自由基的清除能力檢測(cè)結(jié)果 重樓黃酮D1～D4組分都具有一定的ABST自由基清除作用。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，ABTS自由基的清除率分別為（57.95±3.69）%、（100.89±0.56）%、（106.32±0.71）%、（73.88±0.94）%。可知不同組分重樓黃酮組分對(duì)ABST自由基清除能力大小為：重樓黃酮D3＞重樓黃酮D2＞重樓黃酮D4＞重樓黃酮D1。（見(jiàn)圖11）

圖11 重樓黃酮不同組分對(duì)ABTS 自由基清除能力比較

3.7.4 對(duì)Fe3＋的還原能力檢測(cè)結(jié)果 重樓黃酮D1～D4都具有一定的Fe3＋的還原能力作用。在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)的吸光度分別為（0.30±0.04）、（0.40±0.01）、（0.35±0.01）、（0.24±0.00）?？芍煌M分對(duì)Fe3＋的還原能力大小為：重樓黃酮D2＞重樓黃酮D3＞重樓黃酮D1＞重樓黃酮D4。（見(jiàn)圖12）

圖12 重樓黃酮不同組分對(duì)Fe3＋的還原能力比較

綜上，功效驗(yàn)證結(jié)果表明不同提取物之間的抗氧化效果為：重樓黃酮D2（20%乙醇洗脫）＞重樓黃酮D3（40%乙醇洗脫）＞重樓黃酮D1粗提物＞重樓黃酮D4（60%乙醇洗脫）。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，可得重樓黃酮的最優(yōu)提取工藝為提取乙醇濃度65%，提取時(shí)間105 min，料液比1∶10。利用該條件可提取得到重樓黃酮粗提物D1。重樓黃酮精制工藝的探索，篩選了5種大孔吸附樹脂，得到D101樹脂更有利于重樓黃酮的提取。利用20%乙醇、40%乙醇及60%乙醇對(duì)重樓黃酮粗提物D1在大孔樹脂D101上進(jìn)行洗脫，最終獲得不同組分精制物D2～D4。對(duì)D1～D4的抗氧化功效進(jìn)行研究，包括對(duì)DPPH、OH、ABTS自由基清除能力及對(duì)Fe3+還原能力的試驗(yàn)，可以得到重樓黃酮D2組分（20%乙醇洗脫）。重樓黃酮組分D2組分，有非常好的抗氧化能力。其次為重樓黃酮D3（40%乙醇洗脫），活性均高于重樓黃酮粗提物D1。表明重樓黃酮中具體抗氧化活性的有效部分可能在20%和40%乙醇洗脫組分中。重樓的大孔吸附樹脂20%、40%乙醇洗脫部分富集到的黃酮為抗氧化主要活性部位，這些結(jié)果為重樓黃酮作為功能原料或藥物的開發(fā)提供參考。