雷公藤甲素通過STAT3/PD-L1通路介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

汪潔，楊彩鳳，吳亞凡，趙濤

（1.保定市第二中心醫(yī)院，河北 保定 072750；2.石家莊市第一醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

子宮內(nèi)膜癌源于子宮內(nèi)膜上皮性惡性腫瘤，是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。目前子宮內(nèi)膜癌常規(guī)治療主要是以手術(shù)為主，輔助以放療、化療、激素替代治療等綜合療法[1]。早期患者經(jīng)手術(shù)治療后大多預(yù)后良好，死亡率較低，而癌癥晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤患者，術(shù)后放療、化療或激素替代治療等方法只能暫時控制，且有一定的副作用，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[2]。據(jù)統(tǒng)計，10年內(nèi)死于子宮內(nèi)膜癌的女性所占比例已經(jīng)增加到22%，因此迫切需要研究出新的治療方法及藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時降低對機(jī)體的毒副反應(yīng)，以提高患者的生存率及生存質(zhì)量[3]。雷公藤是衛(wèi)茅科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒之功效[4]。雷公藤甲素是雷公藤主要的有效成分，對多種癌癥細(xì)胞具有抑制作用，其抗腫瘤作用主要與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干預(yù)細(xì)胞周期和抑制腫瘤新生血管形成等因素有關(guān)[5]。因此，本研究主要探討雷公藤甲素如何通過誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞系 人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑 雷公藤甲素（批號：111567，純度≥98%，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；胎牛血清（批號：F2442）、噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑（批號：M2128）、DMEM-F12培養(yǎng)基（批號：D6421）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（批號：D2650）均購自美國Sigma公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium Iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1052，碧云天生物技術(shù)有限公司）；STAT3激活劑RO8191（批號：691868-88-9，美國MedChemeExpress）；兔抗人磷酸化組蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γH2AX）單克隆抗體（批號：ab229914）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）單克隆抗體（批號：ab68153）、p-STAT3單克隆抗體（批號：ab267373）、程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）單克隆抗體（批號：ab205921）、干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor 1，IRF-1）單克隆抗體（批號：ab243895）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（批號：ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 FACSCalibu流式細(xì)胞儀系統(tǒng)（美國BD公司）；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；DHP-9402恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DYCZ-20H電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；LSM900激光共聚焦顯微鏡（北京普瑞賽司儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取常規(guī)凍存復(fù)蘇的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞，接種于體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化傳代，選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.2 分組及藥物處理 用DMSO溶解雷公藤甲素和RO8191，配制成0.1 mmol/L的雷公藤甲素母液和RO8191母液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；實驗時用DMEM-F12培養(yǎng)基稀釋雷公藤甲素母液，使培養(yǎng)基中雷公藤甲素濃度為40 nmol/L，DMSO最終濃度＜0.1%。將對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞分為對照組（DMSO）、雷公藤甲素組（40 nmol/L雷公藤甲素）、激活劑（0.2 μmol/L RO8191）+雷公藤甲素（40 nmol/L雷公藤甲素）組、激活劑組（0.2 μmol/L RO8191）。

2.3 細(xì)胞核形態(tài)觀察 將用75%酒精浸泡過的蓋玻片放入6孔板中，取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，按1×106個/mL密度接種于蓋玻片上，細(xì)胞貼壁后各組細(xì)胞分別更換為對應(yīng)的培養(yǎng)基，每孔終體積為2 mL，培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，預(yù)溫的PBS清洗6孔板，5 min×3次，用PBS配制4%多聚甲醛，滴加到蓋玻片上，室溫靜置10 min，PBS清洗蓋玻片5 min×3次。用Hoechst 33342室溫避光染色10 min，PBS漂洗，5 min×3次。在無菌載玻片中心位置滴加5 μL抗熒光衰減封片劑，蓋玻片烘干后倒扣于載玻片上。避光封片，晾干，4 ℃避光儲藏，觀察細(xì)胞核形態(tài)。

2.4 細(xì)胞抑制率檢測 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞，胰酶消化后，用DMEM-F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，對照組、雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組、激活劑組更換相對應(yīng)的培養(yǎng)基，200μL/孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。在各個時間段結(jié)束前4 h每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h，每孔加150 μL DMSO，震蕩8 min，用酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處的光密度（OD）值，計算抑制率。抑制率=（OD對照值-OD用藥值）/OD對照值×100%。

2.5 細(xì)胞凋亡情況檢測 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用DMEM-F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，各組細(xì)胞分別更換為對應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，2 500 r/min離心5 min（離心半徑8 cm），棄上清，加入4 ℃PBS漂洗，加入195 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，加5 μL AnnexinV-FITC 4 ℃避光孵育15 min，加入10 μL PI染色5 min，在流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.6 細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后按1×106個/mL接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后分別更換相對應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，用胰酶消化后收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min（離心半徑8 cm），用4 ℃PBS漂洗2次后加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃過夜固定，1 000 r/min離心5 min（離心半徑8 cm），PBS漂洗2次，用核糖核酸酶消化30 min，用PI染液避光染色30 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

2.7 Western blotting法檢測γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞，按密度1×106個/mL接種于錐形瓶中，細(xì)胞貼壁后分別更換相對應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔加入蛋白樣品40 μL，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST溶液洗膜3次，10min/次，用5%脫脂奶粉孵育1 h，加入1∶1 000稀釋的γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗，搖床室溫孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入適量ECL超敏發(fā)光液，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)顯影，計算目的蛋白和β-actin蛋白條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組KLE細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)比較 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細(xì)胞的細(xì)胞核增大，數(shù)量增多；激活劑組、對照組KLE細(xì)胞的細(xì)胞核較小，數(shù)量較少。（見圖1）

圖1 各組KLE 細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)（×400）

3.2 各組KLE細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率比較 與雷公藤甲素組比較，激活劑+雷公藤甲素組KLE細(xì)胞24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率均明顯降低（P＜0.05），且雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率均隨時間延長而增加（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組KLE 細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率比較（，n=3）

3.3 各組KLE細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），激活劑組KLE細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；且雷公藤甲素組KLE細(xì)胞凋亡率高于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組KLE 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況

圖4 各組KLE 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況比較（，n=3）

3.4 各組KLE細(xì)胞的細(xì)胞周期比較 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組S期KLE細(xì)胞百分率均明顯升高（P＜0.05），G2/M期KLE細(xì)胞百分率均明顯降低（P＜0.05）；與對照組比較，激活劑組S期KLE細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05），G2/M期KLE細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05）；雷公藤甲素組S期KLE細(xì)胞百分率明顯高于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05），G2/M期KLE細(xì)胞百分率明顯低于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05）；4組G1期KLE細(xì)胞百分率組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖5）

圖5 各組KLE 細(xì)胞的細(xì)胞周期比較（，n=3）

3.5 各組KLE細(xì)胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)量比較 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細(xì)胞γH2AX蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；與對照組比較，激活劑組KLE細(xì)胞γH2AX蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；雷公藤甲素組KLE細(xì)胞γH2AX蛋白相對表達(dá)量明顯高于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)量明顯低于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05）；4組KLE細(xì)胞STAT3蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組KLE 細(xì)胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白表達(dá)Western blotting圖

圖7 各組KLE 細(xì)胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)量比較（，n=3）

4 討論

子宮內(nèi)膜癌占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，且發(fā)病率逐年遞增。早期患者術(shù)后生存率高，但晚期患者發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。雷公藤甲素是從雷公藤中分離提取的一種環(huán)氧二萜類化合物，具有抗炎、抗生育及免疫調(diào)節(jié)等多種作用[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素具有廣譜抗腫瘤作用，能夠抑制人胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞的增殖[7-9]。雷公藤甲素抗腫瘤機(jī)制可能涉及多種途徑，如抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制核因子-κB、調(diào)控半胱天冬氨酸蛋白酶通路、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)、影響血管新生和阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移等[10]。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過程，是具有獨(dú)特細(xì)胞形態(tài)和生物化學(xué)變化的細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞增殖與凋亡在正常情況下維持動態(tài)平衡，細(xì)胞增殖失控或凋亡受阻都可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。細(xì)胞周期是從上一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束的整個過程，一個完整的細(xì)胞周期包括有絲分裂期（M期）和分裂間期（G1期、S期、G2期），細(xì)胞周期阻滯可以減慢細(xì)胞增殖速度、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。陳志等[12]研究表明雷公藤甲素能抑制人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖，通過促進(jìn)p21的表達(dá)，抑制Cyclin D1使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并可通過線粒體途徑誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡。張雅莉等[13]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能改善子宮頸癌患者術(shù)后免疫功能、降低機(jī)體炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，對子宮頸癌具有一定的治療效果。李鑫等[14]研究發(fā)現(xiàn)低濃度雷公藤甲素聯(lián)合高三尖杉酯堿可以抑制KG-1α細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。徐俊偉等[15]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能抑制食管癌Eca-9706細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，從而抑制食管癌的進(jìn)展。本研究中雷公藤甲素組KLE細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞凋亡率高于對照組，S期細(xì)胞百分率升高，G2/M期細(xì)胞百分率降低，且雷公藤甲素組細(xì)胞核形態(tài)增大。DNA損傷是指在DNA復(fù)制過程中，DNA核苷酸序列發(fā)生改變，影響基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。γH2AX是雙鏈DNA損傷的重要生物標(biāo)志物，DNA損傷后可募集并激活A(yù)TM，從而促進(jìn)γH2AX磷酸化，以達(dá)到DNA損傷修復(fù)的作用[16]。本研究結(jié)果表明雷公藤甲素可上調(diào)KLE細(xì)胞中γH2AX表達(dá)，提示雷公藤甲素通過介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞DNA損傷，細(xì)胞周期阻滯停留在S期，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，減慢細(xì)胞增殖，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PD-1/PD-L1是形成腫瘤免疫耐受的關(guān)鍵分子。研究表明，PD-L1在多種實體瘤中高表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在細(xì)胞增殖、存活及分化過程中發(fā)揮重要作用，是致癌信號傳導(dǎo)過程中重要的介質(zhì)，多種癌組織中均檢測到STAT3高表達(dá)。IRF-1是重要的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠被磷酸化的STAT3激活，調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，且IRF-1與PD-L1高表達(dá)密切相關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，IRF-1通過使STAT3發(fā)生磷酸化而上調(diào)PD-L1的表達(dá)[18]。體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，STAT3抑制劑可通過在S期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯而顯著抑制人胰腺癌細(xì)胞的增殖[19]。研究表明，STAT3在肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，且阻斷STAT3表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。依含等[21]研究發(fā)現(xiàn)STAT3可誘捕寡核苷酸抑制STAT3/IRF-1的信號通路，降低前列腺癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。本研究中雷公藤甲素組p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)量低于對照組、雷公藤甲素+激活劑組、激活劑組，提示雷公藤甲素通過抑制STAT3/PD-L1通路誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用。

綜上所述，雷公藤甲素通過誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞DNA損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用，可能是通過調(diào)控STAT3/PD-L1通路發(fā)揮作用。