3,4-二羥基-5-硝基苯甲醛對小鼠及鵪鶉高尿酸血癥模型的降尿酸作用比較

李汾,張光偉,李新華,曾菊絨,胥曉麗,彌曼

(西安醫(yī)學院藥理學和毒理學教研室,陜西西安 710021)

高尿酸血癥是血清尿酸(UA)異常升高,痛風時常發(fā)生。隨著血清UA 水平升高且體液中的UA 超過生理飽和閾值,UA 晶體的形成和沉積會發(fā)生在關節(jié)內(nèi)和關節(jié)周圍。UA 鹽結晶沉積的臨床表現(xiàn)包括急性發(fā)作的劇烈疼痛和影響外周關節(jié)的炎癥[1]。迄今為止,沒有一個成熟的高UA 血癥動物模型能用于觀察抗UA 藥物的藥效。常使用的高UA 血癥動物模型是以氧嗪酸鉀為造模劑的小鼠高UA 血癥模型[2-6],但該模型并不能使高UA 血癥穩(wěn)定維持在一個較高水平,給1次氧嗪酸鉀只能維持2 h。而鵪鶉屬于禽類動物,由于禽類動物缺乏UA酶,能引起自發(fā)性痛風,會有長時間的高UA 血癥出現(xiàn),可能更適于降UA 藥物的篩選。因此,本實驗使用3,4-二羥基-5-硝基苯甲醛 (3,4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde,DHNB)干預這兩種動物高UA 血癥模型并比較其降UA 作用。DHNB被認為是一種有效的黃嘌呤氧化酶抑制劑,被推薦為治療高UA 血癥和痛風的潛在治療劑[7]。臨床常用于抗痛風的黃嘌呤氧化酶抑制劑是別嘌呤醇[8-10]。別嘌呤醇作為本實驗的陽性對照藥物以對比分析DHNB 的降UA 作用,從而分析DHNB的降UA 作用強度及動物模型對該化合物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

酵母提取物購自OXOID Co.Ltd。別嘌呤醇和氧嗪酸鉀購自上海生工股份有限公司。DHNB 由西安棣加生物科技有限公司提供。鵪鶉血清UA 采用UA 測試盒(C012-2-1)檢測,購自南京建成生物工程有限公司。小鼠血清UA 使用UA 比色法測試盒(E-BC-K016-M),谷草轉氨酶(AST)使用AST 比色法測試盒(E-BC-K236-M),谷丙轉氨酶(ALT)使用ALT 比色法測試盒(E-BC-K235-M),肌酐(Cr)使用Cr比色法測試盒(E-BC-K188-M),尿素氮(BUN)使用BUN 比色法測試盒(脲酶法)(E-BC-K183-M),均購自Elabscience。HE染色試劑盒購自Solarbio。

1.2 實驗動物

雄性6～8周昆明小鼠(22～26 g)共70只,雌性黃羽鵪鶉(90～110 g)共40只,均購自成都達碩實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于25℃空調(diào)房中,光照/黑暗循環(huán)12 h。在本實驗室適應3 d后開始實驗,小鼠給藥處理前禁食禁水12 h,鵪鶉采血檢測血清UA 及生化指標前禁食不禁水12 h。

1.3 DHNB對正常小鼠血清UA的影響

取30 只小鼠并隨機分為3 組:正常對照組(0.9%生理鹽水100 mg/kg)、正常給藥組(DHNB 100 mg/kg)、正常陽性對照組(別嘌呤醇100 mg/kg),各組均以腹腔注射方法分別給藥。注射后2.5 h,小鼠心臟取血,測血清UA 值。

1.4 DHNB對高UA血癥小鼠模型血清UA的影響

取40只小鼠并隨機分為4組:對照組(0.9%生理鹽水100 mg/kg)、模型組(0.9%生理鹽水100 mg/kg)、給藥組(DHNB 100 mg/kg)、陽性對照組(別嘌呤醇100 mg/kg)。各組分別腹腔注射1 h后,對照組小鼠腹腔注射0.9%生理鹽水(300 mg/kg),模型組、給藥組和陽性對照組小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀300 mg/kg制作高UA血癥小鼠模型。在注射氧嗪酸鉀后1.5 h收集血液。采血前10 min小鼠腹腔注射40 g/L水合氯醛0.01 mL/g麻醉,心臟取血。4℃、3 000 r/min離心5 min,取血清。使用生化試劑盒測量血清UA、AST、ALT、Cr和BUN。對照組及給藥組動物處死后取心、肺、肝和腎組織進行HE染色。

1.5 DHNB對高UA血癥鵪鶉模型血清UA的影響

黃羽雌性鵪鶉40只隨機分4組:對照組(0.9%生理鹽水100 mg/kg)、模型組(0.9%生理鹽水100 mg/kg)、給藥組(DHNB 100 mg/kg)、陽性對照組(別嘌呤醇100 mg/kg)。除對照組使用普通飼料,其余各組均以酵母粉用量30 g/(kg·d)的混合飼料(酵母粉∶普通飼料為1∶4)飼養(yǎng)21 d制作高UA 血癥鵪鶉模型。第7天、第14天、第21天在鵪鶉的翅下靜脈采血檢測血清UA。第15天、第16天,連續(xù)2 d于晨9點各組分別灌胃1次,第17天各組翅下靜脈采血。使用生化試劑盒測量血清UA、AST、ALT、Cr和BUN。對照組及給藥組動物處死后取心、肺、肝和腎組織進行HE染色。

1.6 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學方法采用SSPS 25.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。定量數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,采用ˉx±s描述;多組之間比較,滿足正態(tài)性及方差齊性,采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DHNB對正常小鼠血清UA的影響

DHNB對正常小鼠血清UA 沒有影響(P＞0.05),別嘌呤醇使正常小鼠血清UA 輕微下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05,圖1)。

圖1 DHNB對正常小鼠血清UA的影響Fig.1 Effects of DHNB on serum uric acid in normal mice

2.2 DHNB對高UA血癥小鼠模型血清UA的影響

高UA 血癥模型組血清UA 值高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),氧嗪酸鉀所造高UA 血癥小鼠模型是成功的。但DHNB使氧嗪酸鉀引起的高UA 血癥小鼠血清UA 稍微下降(P＞0.05),差異無統(tǒng)計學意義,DHNB沒有顯示出明顯降UA 效應。別嘌呤醇使氧嗪酸鉀引起的高UA 血癥小鼠血清UA 明顯下降(P＜0.05,表1)。

表1 DHNB對高UA血癥小鼠模型血清UA的影響Tab.1 The effect of DHNB on serum uric acid in hyperuricemia mouse model(n=10,,μmol/L)

表1 DHNB對高UA血癥小鼠模型血清UA的影響Tab.1 The effect of DHNB on serum uric acid in hyperuricemia mouse model(n=10,,μmol/L)

與模型組比較,*P＜0.05。

2.3 DHNB對高UA血癥鵪鶉模型血清UA的影響

使用酵母抽提物混合飼料所造高UA 血癥鵪鶉模型是成功的,高UA 血癥模型組第17天血清UA值高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。DHNB使酵母抽提物引起的高UA 血癥鵪鶉第17天血清UA 明顯下降(P＜0.05),別嘌呤醇使酵母抽提物引起的高UA 血癥鵪鶉第17天血清UA 顯著下降(P＜0.01,表2)。

表2 DHNB對高UA血癥鵪鶉模型第17天血清UA的影響Tab.2 Effects of DHNB on serum uric acid on day 17 of hyperuricemia quail model(n=10,ˉx±s,μmol/L)

2.4 DHNB對小鼠及鵪鶉的肝腎功的影響

小鼠DHNB 給藥組的AST 值比對照組降低,DHNB給藥組ALT 值比對照組升高,DHNB 組Cr和BUN 均比對照組升高,但差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05,表3)。

表3 DHNB對小鼠肝腎功的影響Tab.3 The effect of DHNB on liver and kidney functions of mice(n=10,ˉx±s)

鵪鶉DHNB 給藥組AST、ALT 值均較對照組降低,DHNB給藥組Cr較對照組降低,BUN 較對照組升高,但差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05,表4)。

表4 DHNB對鵪鶉肝腎功的影響Tab.4 Effects of DHNB on liver and kidney functions of quails(n=10,ˉx±s)

2.5 各組小鼠和鵪鶉臟器的HE染色結果

正常小鼠及高UA 血癥小鼠模型給藥DHNB后,對小鼠心、肺、肝、腎均無明顯毒性作用(圖2)。

圖2 正常小鼠(A～D)及高UA血癥小鼠模型(E～H)DHNB給藥后各臟器的HE染色Fig.2 HE staining of various organs in normal mouse(A-H)and hyperuricemia mouse models(E-H)treated with DHNB(×20)

正常鵪鶉及高UA 血癥鵪鶉模型經(jīng)DHNB給藥后對鵪鶉心、肺、肝、腎均無明顯毒性作用(圖3)。

圖3 正常鵪鶉(A～D)及高UA血癥鵪鶉模型(E～H)DHNB給藥后各臟器HE染色Fig.3 HE staining of various organs in normal quails(A-D)and hyperuricemia quail models(E-H)treated with DHNB(×20)

3 討 論

高UA 血癥和痛風的患病率在全球呈上升趨勢,且高UA 血癥和其他疾病密切相關。首選的一線抗高UA 血癥藥物是黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇,但別嘌呤醇有高發(fā)的嚴重皮膚不良反應。而新型抗痛風藥物黃嘌呤氧化酶抑制劑非布司他雖然效果顯著,但其心血管的不良反應及昂貴價格限制了其臨床應用。因此,對DHNB 的進一步研究有望對臨床抗痛風治療有所幫助。

本實驗DHNB在高UA 血癥小鼠模型中未顯示出血清UA 降低,而DHNB 對高UA 血癥鵪鶉模型中的血清UA 卻有明顯的降低作用。本實驗小鼠和鵪鶉的高UA 血癥模型均成功制備。但在制備小鼠高UA 血癥模型時發(fā)現(xiàn),使用氧嗪酸鉀作為UA 酶抑制劑抑制UA 的氧化代謝,從而使小鼠血中UA升高,但作用非常短暫,血中高UA 水平有峰值但沒有平臺期不能持續(xù)升高血中UA。查閱文獻后發(fā)現(xiàn)幾乎所有的高UA 血癥模型都是使用這種方法,普遍存在這種問題,因此高UA 血癥的模型制備仍很不完善、很不成熟[11-15]。正如YUKIO 等[16]使用氧嗪酸鉀單次腹腔注射給藥,血藥濃度呈鐘形曲線分布。如果要造長期高UA 血癥模型,則每天需多次給予氧嗪酸鉀或者同時配合高嘌呤飲食。但即便如此也不能達到一個較穩(wěn)定的高UA 平臺期[17-18]。還有報道使用基因修飾小鼠造成高UA 血癥模型,但因同時引起嚴重并發(fā)癥導致較高致死率而影響了其應用[19]。究其原因是由于哺乳動物如嚙齒動物體內(nèi)含有UA酶,可將UA 鹽代謝為尿囊素。因此,嚙齒動物是不易發(fā)生高UA 血癥的,由嘌呤經(jīng)黃嘌呤氧化酶生成次黃嘌呤再代謝生成黃嘌呤最終所生成的UA 很快被UA 酶所代謝,從而使血中UA 迅速下降。因此,即便給予高嘌呤飲食也很難引起高UA血癥。而使用UA 酶抑制劑(氧嗪酸鉀)也并不能使血中UA 水平維持穩(wěn)定升高,是由于UA 只有30%被UA 酶所代謝,而70%要靠腎臟排出體外[20]。因而只抑制UA 酶但不抑制腎臟排泄,只能抑制30%UA 的減少,結果使血清中UA 雖有升高但很快被腎臟清除掉。所以使用氧嗪酸鉀并不能長時間維持UA 高水平,只能使UA 水平輕微地短暫升高,繼而下降。CHEN 等[7]研究了DHNB 對成年C57BL/6的降UA 作用,使用allantoxanamide作為造模劑,結果顯示DHNB發(fā)揮了和別嘌呤醇幾乎等同的降UA效果。但在本實驗中使用雄性昆明小鼠,雖然別嘌呤醇的降UA 效果同該文獻中顯示的同樣明顯,但DHNB卻不能顯示出所期望的等同的降UA 效果。

考慮到DHNB不能在小鼠高UA 血癥模型發(fā)揮和別嘌呤醇同樣強度的降UA 作用,而人類和鳥類都沒有UA 酶以氧化UA鹽,決定選用鵪鶉制備高UA 血癥模型。在這些沒有UA 酶的物種中,UA 是最終的主要產(chǎn)物[21-22]。因此,家禽可自發(fā)痛風,是用于高UA 血癥和痛風的實驗研究的合適模型,即使是在正常的非高嘌呤飲食的情況下[23]。在鵪鶉高UA 血癥模型中,別嘌呤醇發(fā)揮了比小鼠高UA 血癥模型更強的降UA 效果,說明鵪鶉對黃嘌呤氧化酶抑制劑可能比哺乳動物小鼠更敏感,因此DHNB 在鵪鶉高UA 血癥模型上顯示了較強的降UA 效應而對小鼠高UA 血癥則無效。這對于很多潛在的具有降UA 作用可用于抗痛風治療的藥物是很有意義的,多數(shù)中草藥都具有較弱的降UA 作用卻又不能達到如同別嘌呤醇那么強效降UA,這種情況使用高UA 血癥鵪鶉模型比小鼠模型更有藥物篩選意義。同時,高UA 血癥鵪鶉模型具有小鼠模型很多不具備的優(yōu)點,造模方便只需飼喂即可,滿足其飲食特性,不需每日給造模劑灌胃處理;從給予酵母提取物高嘌呤飲食后第4天血UA即穩(wěn)步升高,第7天至第10天時達到較高且與正常對照組有明顯差異的高UA 水平,此后一直保持血中高UA水平直至28 d;適合長時間觀察降UA藥效的藥物,尤其是作用弱、維持時間長的中藥。但由于其并不是哺乳動物模型,因此禽類與嚙齒類動物模型之間的區(qū)別對高UA血癥模型的影響也需進一步研究。DHNB大劑量下對小鼠的急毒實驗已在文獻中敘述[7]。本實驗所提示的高UA 血癥鵪鶉模型更適用于降UA 作用較弱的中成藥物藥效的驗證,而小鼠高UA 血癥模型則可以用于降UA 作用很強的如別嘌呤醇等藥物的藥效驗證。