HAmLET誘導小鼠前脂肪細胞3T3-L1成脂分化

張軼博，鐘悅，曾瑞霞

(1.錦州醫(yī)科大學病原生物學教研室，遼寧 錦州 121000；2.營口經(jīng)濟開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院眼科，遼寧 營口115007；3.錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000)

腫瘤細胞致死性人α-乳清蛋白(HAmLET)是在人乳汁酪蛋白成份防止肺炎鏈球菌附著于呼吸道上皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)某些成份可以殺傷A549腫瘤細胞，繼而被證實為一種人α-乳清蛋白與油酸結(jié)合形成的脂蛋白復合物。在對不同細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)HAmLET具有選擇性誘殺傷腫瘤細胞和癌變前細胞，而對成熟的分化細胞沒有顯著的毒性作用[1]。但是，HAmLET殺瘤的機制卻極其復雜，有多條途徑參與，如線粒體通透性增加、與細胞核內(nèi)的組蛋白和染色質(zhì)結(jié)合、抑制蛋白酶體活性、激活細胞自噬凋亡途徑等，但其選擇性作用腫瘤而對成熟細胞無毒性的分子機制仍不清楚[2-3]。上述研究均基于HAmLET對于腫瘤細胞的作用機制，HAmLET同樣可以引起未分化細胞的死亡，因此，針對未分化細胞或胚胎細胞的研究，可能揭示HAmLET選擇性殺傷細胞的機制。

小鼠胚胎成纖維細胞(小鼠前脂肪細胞)3T3-L1細胞是一種未分化細胞，該細胞在快速分裂時呈前脂肪細胞狀態(tài)，在匯合和接觸性抑制后則進入脂肪樣細胞，如果給予合適的條件可以分化為脂肪細胞。影響3T3-L1細胞分化的因素很多，CAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT-enhancer-binding protein α，C/EBPα)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein4，F(xiàn)ABP4)、葡萄糖、胰島素、生長激素、胰島素樣生長因子-I(insulin- llke growth factor-I，IGF-I)、脂肪酸等因子參與脂肪分化的調(diào)節(jié)[4]。目前，最經(jīng)典的脂肪誘導分化的方法是“三聯(lián)誘導法”，即胰島素、地塞米松和IBMX聯(lián)合應用。但是，也有報道顯示油酸等脂肪酸可與胰島素聯(lián)用誘導前脂肪細胞的分化[5-6]。油酸是HAmLET的主要成份，那么HAmLET單獨作用前脂肪細胞時可能會引起細胞的成脂分化。因此，在研究HAmLET對未分化細胞的作用時，除了關(guān)注細胞的死亡情況，還要注意細胞的分化情況。

HAmLET對于腫瘤細胞有殺傷作用，而不影響正常細胞的功能。但是，HAmLET對于未分化細胞如胚胎細胞、淋巴細胞都有一定的殺傷作用。為了探討HAmLET對未分化細胞的作用，我們選擇了小鼠前脂肪細胞3T3-L1作為研究對象，觀察HAmLET短期和長期作用3T3-L1細胞的細胞死亡和分化情況，為HAmLET的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1細胞和U87MG細胞購于上海細胞庫；HAmLET由本實驗室保藏，制備方法見文獻[7]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

用3T3-L1細胞的完全培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基，10%新生牛血清，100 U/mL青/鏈霉素)或U87MG細胞的完全培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100 U/mL青/鏈霉素)進行3T3-L1細胞和U87MG細胞的傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞活性實驗

取3T3-L1細胞或U87MG細胞2～5代細胞以1×105個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)第2天，更換完全培養(yǎng)基并加入不同濃度(0、50、100、200、500 μg/mL)的HAmLET，24 h后或作用1、2、3、5、7 d不同天數(shù)后進行細胞活性檢測。直接在培養(yǎng)基中加入CCK-8檢測液(碧云天生物技術(shù)公司)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。1 h后取出培養(yǎng)板，在酶標儀450 nm處測吸光度OD值。

1.2.3 3T3-L1細胞的誘導分化

(1)3T3-L1細胞用低糖DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)培養(yǎng)于6孔板，每隔2 d換新鮮培養(yǎng)液1次，至細胞密度生長達98%以上；(2)棄細胞培養(yǎng)液，換成DEX(含10 μmoL)、IBMX(含0.5 mmoL)和insulin(含10 μg/mL)以及高糖DMEM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)開始誘導分化；(3)誘導培養(yǎng)2 d后，棄去誘導分化液，換成insulin(含10 μg/mL)及高糖DMEM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)或HAmLET；(4)繼續(xù)誘導培養(yǎng)2 d后，棄去誘導分化液，換成不含任何誘導劑，僅含5%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換新鮮培養(yǎng)液1次；(5)12 d后細胞分化成為成熟的脂肪細胞，或細胞密度生長達98%以上，每隔2 d后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，出現(xiàn)大量脂滴判斷細胞分化成熟，棄去培養(yǎng)基，用PBS液輕輕沖洗2遍。

在每孔加入1 mL 4%的多聚甲醛，在室溫下固定細胞20 min。將多聚甲醛用吸管吸凈，再次用PBS液沖洗2遍，每孔加入1 mL油紅O染色液，室溫下染色30 min。用吸管吸去多余的油紅O染色液，并用三蒸水仔細沖洗2遍，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 3T3-L1細胞脂質(zhì)定量

油紅O染色染色后吸凈培養(yǎng)孔中的三蒸水，每孔加入2 mL異丙醇萃取脂肪細胞內(nèi)的油紅O染液，用吸管吹打至細胞內(nèi)的油紅O染料全部溶解于異丙醇中。室溫靜置30 min。每孔吸出200 μL異丙醇萃取液轉(zhuǎn)入96孔板中，在酶標儀490 nm處測吸光度OD值。

1.2.5 Western Blot

將6孔板實驗后的細胞用胰酶消化后移入1.5 mL離心管中，以1000 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，置于冰上30 min，加入預冷的RIPA裂解液，在振蕩器上震蕩2 min，于冰上靜置10 min，上述實驗操作共3次。待細胞完全裂解后，在4 ℃條件下，以12 000 rpm轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取20 μg上樣至10%SDS-PAGE膠，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。BSA置于室溫下封閉1 h，TBST漂洗3次，每次5 min。分別加入相應的一抗溶液(PPARγ抗體1∶1000、β-actin抗體1∶1000)，置于4 ℃下恒溫孵育12 h。TBST漂洗5 min，漂洗3次。加入山羊抗兔二抗(1∶2000)溶液，置于4 ℃下恒溫孵育1 h，TBST 漂洗5 min，漂洗3次。ECL顯影曝光。采用Image J軟件進行圖像處理，蛋白條帶分析以β-actin作為內(nèi)參對照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HAmLET對3T3-L1細胞的殺傷作用

不同濃度的HAmLET分別作用3T3-L1細胞和U87MG腫瘤細胞24 h，細胞活性實驗結(jié)果顯示3T3-L1細胞的細胞活性在50、100、200、500 μg/mL HAmLET作用下都顯著高于U87MG細胞，而其細胞活性在100和200 μg/mL之間明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。結(jié)果表明對于HAmLET的殺傷作用，未分化細胞3T3-L1細胞比腫瘤細胞U87MG細胞有較大的抵抗力，同時3T3-L1細胞活性在低濃度的HAmLET(100 μg/mL)和高濃度(200 μg/mL)之間顯著變化。

2.2 3T3-L1細胞HAmLET長期作用

分別用濃度100 μg/mL和200 μg/mL的HAmLET作用3T3-L1細胞7 d，在不同天數(shù)檢查其細胞活性結(jié)果顯示200 μg/mL組的細胞存活率在58.2%～66.9%之間，無顯著變化。100 μg/mL組的細胞活性從95.3%(1 d)～74.8%(3 d)～91.0%(7 d)，呈現(xiàn)“V”型現(xiàn)象，見圖2。

圖2 HAmLET作用3T3-L1細胞后的細胞活性

受到HAmLET的長期作用(7 d)后，在光鏡下可以觀察到少數(shù)3T3-L1細胞體積增大，變圓，胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴，見圖3。結(jié)果表明在使用殺傷腫瘤細胞濃度的HAmLET長期作用3T3-L1細胞時，細胞會出現(xiàn)抵抗作用，甚至出現(xiàn)耐受。同時，細胞出現(xiàn)了脂滴的聚集，HAmLET可能引起了細胞的分化。

箭頭所指為細胞內(nèi)脂滴，標尺為100 μm

2.3 HAmLET誘導3T3-L1細胞分化成脂

分別通過經(jīng)典三聯(lián)法和100 μg/mL HAmLET誘導3T3-L1細胞分化12 d后對3T3-L1細胞進行油紅O染色，見圖4。與未誘導組相比，三聯(lián)法和HAmLET都能誘導細胞分化為成熟的脂肪細胞。異丙醇萃取染色后3組細胞內(nèi)的油紅O染液，結(jié)果顯示三聯(lián)法誘導組和HAmLET組相對脂質(zhì)含量都較未誘導組顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而兩者之間的脂質(zhì)含量比較差異較小，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

100 μg/mL HAmLET和三聯(lián)誘導試劑作用3T3-L1細胞12 d；DMEM為未誘導組，IBMX為三聯(lián)誘導組，100 μg/mL HAM為 HAmLET組

DMEM為未誘導組，IBMX為三聯(lián)誘導組，HAM為100 μg/mL HAmLET組，與未誘導組相比，**P<0.01

設置IBMX組OD值為100%。Western Blot檢測結(jié)果顯示與未誘導組相比，三聯(lián)法誘導組和HAmLET組細胞PPAR γ蛋白表達顯著增加，此差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而三聯(lián)法誘導組和HAmLET組之間PPAR γ蛋白表達水平并無顯著差異，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。上述結(jié)果表明100 μg/mL HAmLET能夠誘導3T3-L1細胞分化成脂，而且其作用與經(jīng)典的三聯(lián)誘導試劑效果相當。

誘導分化12 d后Western Blot檢測3組細胞PPARγ蛋白表達情況；DMEM為未誘導組，IBMX為三聯(lián)誘導組，HAM為100 μg/mL HAmLET組，與未誘導組相比，**P<0.01

3 討 論

HAmLET及其類似物抗腫瘤作用已得到廣泛認識[8]，HAmLET具有腫瘤細胞毒性[9]，包括對化療藥物有抗性的癌細胞。而除血細胞、胚胎細胞和永生化非癌細胞對HAmLET的細胞毒作用是敏感的以外，大多數(shù)原代培養(yǎng)細胞顯示出對HAmLET樣化合物毒性的耐受。本研究顯示HAmLET對人腫瘤細胞U87G有明顯的殺傷作用，但是在同一濃度，小鼠前脂肪細胞3T3-L1有明顯的抵抗作用，而長時間作用更是產(chǎn)生了耐受。針對不同種類細胞，HAmLET所展現(xiàn)出細胞毒作用的不同可能與其對細胞上的作用靶點有關(guān)。HAmLET廣譜抗癌活性的另一個解釋是HAmLET的油酸對膜脂質(zhì)、膜蛋白脂質(zhì)堆積和信號傳導具有潛在作用，癌細胞的快速增殖需要細胞膜脂質(zhì)成分的參與，油酸的毒性作用促進了腫瘤細胞的死亡。因此，HAmLET廣譜抗腫瘤作用即使其可以用于多種腫瘤的治療，但是由于對胚胎細胞、紅細胞等細胞的增殖作用也使其應用受到了限制。

3T3-L1細胞是常用的脂肪細胞分化研究模型。在本研究中，我們使用的HAmLET可以誘導3T3-L1細胞形成成熟的脂肪細胞，而且誘導分化的水平與經(jīng)典的三聯(lián)法沒有顯著差異。引起脂肪分化的原因，可能是HAmLET的成份油酸發(fā)揮主要作用。我們的前期研究報道了油酸可以引起脂肪細胞的分化[10]。本研究中，HAmLET應用可使3T3-L1細胞的脂肪分化，油酸在促進分化作用中是必不可少的。同時，OA是HAmLET殺傷腫瘤的重要部分，甚至有人認為HAmLET的細胞毒性作用來自于OA。惡性腫瘤細胞作為一種未分化的細胞，可能在脂肪細胞分化誘導條件下也可以去分化成為脂肪細胞。因此，HAmLET誘導3T3-L1細胞分化的機制可能也存在于腫瘤細胞中，這為研究HAmLET殺傷腫瘤的機制提供了一個新思路。

脂肪細胞的分化受多種因子調(diào)控，如抑制FABP4對油酸誘導的牛前體脂肪細胞分化有顯著影響[11]。PPARγ是脂肪細胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可激活一系列脂肪細胞表型基因的表達，從而調(diào)控前脂肪細胞向脂肪細胞分化的整個過程[12-13]。由于PPARγ在調(diào)控細胞分化和生長中發(fā)揮作用[14]，在腫瘤的研究中PPARγ是重要的抗腫瘤分子[15]，PPARγ的激動劑可以用于腫瘤的治療[16]。本研究中，HAmLET可以同時激活3T3-L1細胞中PPARγ的表達，并且比OA有更強的促進作用，表明HAmLET誘導脂肪分化是通過激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ來實現(xiàn)的，對于其具體的活化機制需進一步研究。由于PPARγ在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中有重要作用，因此它們的表達變化可對HAmLET的抗腫瘤作用起到提示作用。研究結(jié)果顯示HAmLET可促進抗腫瘤作用的PPARγ表達升高，這種情況可能與其細胞所在分化時段有關(guān)，需要在今后的研究中關(guān)注。

本研究使用殺傷腫瘤細胞U87MG細胞濃度的HAmLET短期(24 h，7 d)和長期(12 d)作用3T3-L1前脂肪細胞，發(fā)現(xiàn)3T3-L1細胞對HAmLET有一定的耐受作用，長期作用可以通過激活3T3-L1細胞中的PPARγ誘導細胞分化，但具體的誘導分化機制仍有待進一步研究。通過建立HAmLET作用前脂肪細胞的誘導分化模型，可以為我們探究HAmLET對各種細胞的生物學效應及機制提供一種細胞模型，為HAmLET在臨床上的應用提供實驗數(shù)據(jù)。