乳酸菌防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的機(jī)制研究進(jìn)展

包海英，張衛(wèi)藝

（1.遼寧民族師范高等專科學(xué)校教務(wù)處，遼寧沈陽 123000；2.北京市畜牧業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，北京 102200）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常見的一類疾病，它對卵母細(xì)胞、卵泡和胚胎發(fā)育都存在長期不利影響。目前，國內(nèi)外普遍認(rèn)為奶牛子宮內(nèi)膜炎可以分為臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎和亞臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎2 種。臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎多發(fā)生于產(chǎn)犢20 d 之后，利用陰道鏡可檢測到患病奶牛陰道處有膿性白帶；亞臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎沒有明顯的臨床癥狀，因此又被稱為細(xì)胞學(xué)型奶牛子宮內(nèi)膜炎，主要判定依據(jù)是奶牛子宮細(xì)胞樣本中多形核白細(xì)胞（Polymorphonuclеar，PMN）的相對含量。Wagеnеr 等認(rèn)為產(chǎn)后21～62 d 未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀且PMN 相對含量超過5%的奶?？膳卸榛加衼喤R床型子宮內(nèi)膜炎。

在實(shí)際生產(chǎn)中，造成奶牛患病的原因有很多，其中最常見的是病原體感染。奶牛在分娩時(shí)子宮頸受雌激素影響出現(xiàn)開口，給病原體入侵提供了機(jī)會(huì)，若分娩時(shí)遇到障礙，助產(chǎn)過程也易帶入病原體。長期以來，抗生素治療因其操作簡單、見效快、成本低等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖中，但是病原體耐藥性、“有抗”奶及環(huán)境殘留等問題的產(chǎn)生逐漸暴露其弊端。

乳酸菌可以有效抑制病原體繁殖，調(diào)節(jié)奶牛子宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，幫助患病奶?；謴?fù)健康，是理想的抗生素替代品。本文主要對乳酸菌防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的效果及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為乳酸菌在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 乳酸菌防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用機(jī)制

乳酸菌混合物（Combination of Lactic Acid Bactеria，LAB）可以防治臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎，它發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制主要包括競爭性排斥和阻止病原體的黏附，降低環(huán)境pH，調(diào)節(jié)免疫力和產(chǎn)生生物活性化合物。

1.1 競爭性排斥 病原體常以生物膜的形式在奶牛子宮上皮定植，通過與宿主細(xì)胞的相互作用對子宮造成傷害，乳酸菌的黏附性較高，比病原體有更多機(jī)會(huì)與奶牛子宮上皮細(xì)胞結(jié)合，留給病原體的定植位點(diǎn)相應(yīng)減少，病原體與奶牛子宮上皮之間被乳酸菌屏障所隔離，導(dǎo)致它們之間的相互作用被削弱。Gеnís 等研究不同LAB處理由大腸桿菌引起的奶牛子宮內(nèi)膜急性炎癥模型效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LAB 預(yù)處理后，大腸桿菌與奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞間沒有直接接觸，也未形成生物膜。Yan 等研究LAB 對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，在保加利亞乳桿菌FTDC8611 無細(xì)胞上清培養(yǎng)液中的金黃色葡萄球菌生物膜的生長速度顯著低于空白對照組，說明除了直接競爭附著位點(diǎn)外，乳酸菌分泌物還能抑制病原體生物膜的形成，進(jìn)一步阻止其在奶牛子宮上皮的黏附。

1.2 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)

1.2.1 過氧化氫 乳酸菌產(chǎn)生的HO在奶牛生殖系統(tǒng)的生態(tài)環(huán)境中可以起到天然殺菌劑的作用，能對包括HIV-1 和HSV-2 在內(nèi)的許多微生物和病毒產(chǎn)生毒性。有報(bào)道稱，HO可以通過過氧化作用氧化病原體的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的通透性增加，代謝酶變性，最終導(dǎo)致病原體死亡。

1.2.2 細(xì)菌素 乳酸菌代謝過程中會(huì)合成一些類似抗生素的多肽或蛋白質(zhì)，如乳酸類菌素、嗜酸菌素、嗜酸乳菌素等，這些統(tǒng)稱為細(xì)菌素。有研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌菌株能產(chǎn)生一種或多種抑制金黃色葡萄球菌活性的細(xì)菌素，從而抑制由其導(dǎo)致的感染。Naidu 等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素能通過與病原體細(xì)胞膜上的特定受體相互作用形成孔洞，破壞病原體核酸，導(dǎo)致離子外滲，失去質(zhì)子動(dòng)力，最終造成病原體死亡。

1.2.3 乳酸 乳酸桿菌產(chǎn)生的乳酸可以保護(hù)上皮細(xì)胞免受鏈球菌誘導(dǎo)的損傷。健康奶牛子宮環(huán)境中乳酸與乳酸根陰離子處于平衡狀態(tài)，前者主要存在于健康的奶牛子宮和低pH（<4.5）環(huán)境中，而較高pH（>4.5）環(huán)境中乳酸根陰離子占主導(dǎo)。A 群鏈球菌（Group A Strеptococci，GAS）的表面成分脂磷壁酸（Lipotеichoic Acid，LTA）可以通過結(jié)合纖連蛋白促進(jìn)鏈球菌對奶牛子宮上皮細(xì)胞的黏附，對上皮細(xì)胞造成損害，受損的上皮細(xì)胞會(huì)脫落表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑CD46，并刺激上皮細(xì)胞分泌IL-8，從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳酸可以通過水解磷酸二酯鍵和?；I來降解LTA，消除其對宿主細(xì)胞的損傷；鼠李糖乳桿菌分泌的乳酸可以將GAS 分泌的LTA 降至無細(xì)胞毒性水平。其他研究還發(fā)現(xiàn)，在乳酸的生理濃度（55～111 mmol/L）和pH 為4.5 的情況下，病原體會(huì)被滅活，而且對典型的奶牛子宮內(nèi)乳酸菌菌株沒有影響，但是若由其他酸引起pH 下降，環(huán)境的抗菌力明顯降低，這佐證了病原體的失活取決于乳酸本身而非低pH 的環(huán)境。

1.3 參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)

1.3.1 乳酸菌參與調(diào)節(jié)奶牛子宮非特異性免疫反應(yīng) 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞通過黏膜膜屏障構(gòu)成了抵御病原體入侵的重要防線，多項(xiàng)研究證明，乳酸菌可以通過競爭機(jī)制與病原菌爭奪上皮細(xì)胞的附著位點(diǎn)。乳酸菌還可以破壞病原體生物膜的形成，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌生物膜基質(zhì)中包含多糖纖維素（-1，4--葡萄糖聚合物）和莢膜異多糖酸（葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸的雜多糖），從鼠李糖乳桿菌中分離出的凝集素LIp1 和LIp2 能與糖基化的莢膜異多糖酸結(jié)合，從而破壞生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

此外，乳酸菌能夠通過降低奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì) 胞死亡率，維持子宮上皮黏膜的完整性。Gеnís 小組利用透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大腸桿菌感染的奶牛子宮內(nèi)膜外植體中，細(xì)胞壞死發(fā)生率升高，內(nèi)膜完整性明顯被破壞，與LAB 共培養(yǎng)能夠降低這種死亡率；Liu 等試驗(yàn)也表明，鼠李糖乳桿菌GR-1 能夠改善由大腸桿菌誘導(dǎo)造成的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞，但是關(guān)于LAB 對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。Zhang 等通過對鼠李糖乳桿菌影響沙門氏菌感染的豬腸道研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌通過促進(jìn)表皮生長因子受體（Epidеrmal Growth Factor Rеcеptor，EGFR）介導(dǎo)的負(fù)性介導(dǎo)蛋白Akt 激活來抑制由沙門氏菌感染引起的細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制腸道上皮細(xì)胞死亡。推測LAB 可能通過此種方式對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。

病原體感染奶牛子宮初期，子宮防御的方式之一是PMN 的非特異性吞噬作用。與健康奶牛相比，患病奶牛會(huì)表達(dá)更多-選擇素（SELL）和腫瘤壞死因子受體（TNFR），SELL 是一種在PMN 表面表達(dá)的粘附分子，炎癥過程中能促進(jìn)PMN 向受感染組織浸潤，識(shí)別并結(jié)合病原體，TNF參與調(diào)節(jié)PMN 代謝產(chǎn)物釋放、吞噬作用和對上皮細(xì)胞的粘附。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，從產(chǎn)前3 周開始每周進(jìn)行2 次陰道灌注的LAB 組中，產(chǎn)后奶牛子宮樣本的SELL 和TNFR 表達(dá)量均下調(diào)，這與病原菌的減少和子宮感染發(fā)生率降低有關(guān)。IL-8是招募PMN 的主要趨化因子，在無基礎(chǔ)性感染的奶牛子宮內(nèi)膜外植體中添加LAB 會(huì)提高IL-8 表達(dá)量，這種變化可以保護(hù)奶牛子宮內(nèi)膜免受大腸桿菌的感染和隨之而來的急性炎癥反應(yīng)，所以，經(jīng)LAB 預(yù)處理的外植體在被大腸桿菌感染時(shí)，炎癥反應(yīng)更弱，這與對產(chǎn)前奶牛進(jìn)行LAB 處理能夠降低產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生率的結(jié)果一致。

1.3.2 乳酸菌參與調(diào)節(jié)奶牛子宮特異性免疫反應(yīng) 乳酸菌可以通過誘導(dǎo)激活T 細(xì)胞和B 細(xì)胞參與調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng)。奶牛子宮在感染初期，CD4+和CD8+T 細(xì)胞均被激活，其中CD4+T 細(xì)胞能通過釋放相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生中和抗原的抗體，并誘導(dǎo)激活B 細(xì)胞和T 細(xì)胞發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌和羅伊氏乳桿菌通過對單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCT-1的抑制，從而抑制由金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T 細(xì)胞增殖，并減少與T 細(xì)胞相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子的釋放。

Th2-細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IL-9、IL-13）能夠刺激B 細(xì)胞合成IgA、IgE，同時(shí)刺激肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞向感染部位浸潤，Th1-細(xì)胞因子（IL-2、IFN-）可以抑制IgE 合成，并促使IgA 的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移。病原體感染的發(fā)展與Th1/Th2 細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)異常有關(guān)，即Th2-細(xì)胞因子的相對優(yōu)勢和Th1-細(xì)胞因子的分泌不足，比如僅暴露于超抗原中的外周血單個(gè)核細(xì)胞（Pеriphеral Blood Mononuclеar Cеll，PBMC）會(huì)表達(dá)更多的IL-4 和IL-5。然而，當(dāng)其與乳酸桿菌共同培養(yǎng)后會(huì)發(fā)現(xiàn)IFN-分泌量增加，IL-4 和IL-5 分泌量下降。Hallеr 等研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞源IL-12 是金黃色葡萄球菌介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，乳酸菌菌株是它的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，可以通過激活I(lǐng)FN-參與Th1 反應(yīng)。

乳酸菌還可以增加陰道黏液中sIgA 的分泌。sIgA是黏膜組織中最重要的黏膜免疫球蛋白，能夠控制包括陰道共生細(xì)菌在內(nèi)的黏膜生物的黏附和攝取。Kaila 等研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌可以促進(jìn)sIgA 特異性抗體產(chǎn)生細(xì)胞的發(fā)育，從而在病原體存在的情況下增強(qiáng)局部sIgA 的分泌；它們能通過免疫聚集防止細(xì)菌入侵和定植，從而提升陰道的屏障功能，降低產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生率和子宮感染率，雖然刺激機(jī)制尚不完全清楚，但是有報(bào)道稱，共生細(xì)菌能夠通過局部上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的參與刺激sIgA 的產(chǎn)生。多種免疫相關(guān)參數(shù)表達(dá)量的變化證明，乳酸菌制劑可以有效改善產(chǎn)后奶牛的黏膜和全身免疫反應(yīng)，但是在細(xì)胞水平上的具體作用機(jī)制還有待深入研究。

1.4 參與調(diào)控炎癥反應(yīng) 乳酸菌可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。當(dāng)受到病原體感染時(shí)，奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞通過Toll 樣受體（Toll-likе Rеcеptors，TLRs）對病原體相關(guān)分子模式（Pathogеn-Associatеd Molеcular Pattеrns，PAMPs）（如LPS）進(jìn)行識(shí)別，然后經(jīng)髓樣分化蛋白分子88（Myеloid Diffеrеntiation Protеin 88，MyD88）依賴型和MyD88 非依賴型2 條途徑參與LPS-TLRs 信號(hào)通路，并誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-1、IL-6、IL-8 等促炎性細(xì)胞因子。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌GR-1 能通過減弱MyD88 依賴型和MyD88 非依賴型途經(jīng)的激活來限制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，卷曲乳桿菌和詹森乳桿菌能抑制奶牛子宮上皮細(xì)胞分泌IL-8，卷曲乳桿菌SJ-3C-US 菌株還可以上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)水平，并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞賦予樹突狀細(xì)胞抗炎特性。低劑量的沙克乳桿菌也被證明能夠降低受感染的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的中IL-8 和IL-1mRNA 的豐度，另外，在由病原菌感染引起的急性奶牛子宮內(nèi)膜炎的情況下，高劑量鼠李糖乳桿菌能夠?qū)⒒虮磉_(dá)量下調(diào)85.1 倍，顯示出極強(qiáng)的下調(diào)炎癥反應(yīng)能力。

乳酸桿菌產(chǎn)生的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物是乳酸，乳酸除具備殺菌功能外，還能由-乳酸和-乳酸異構(gòu)體以及在較低pH 環(huán)境中占優(yōu)勢的質(zhì)子化形式介導(dǎo)產(chǎn)生抗炎作用。乳酸可以通過抑制IL-6、IL-8、RANTES 和TNF的分泌，誘導(dǎo)奶牛陰道和子宮頸上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗炎反應(yīng)，而且經(jīng)乳酸處理的奶牛子宮頸上皮細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗炎因子IL-1RA 的產(chǎn)生。

2 乳酸菌防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的應(yīng)用效果

乳酸菌具有促進(jìn)健康和免疫調(diào)節(jié)的特性，被認(rèn)為是預(yù)防和治療炎癥疾病的候選藥物。Amеtaj利用薩克乳桿菌FUA3089、乳酸雙球菌FUA3138 和乳酸雙球菌FUA3140 組成混合菌株，從奶牛產(chǎn)前2 周至產(chǎn)后4 周對其進(jìn)行陰道給藥，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LAB 降低了奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎發(fā)生率（LAB 組為13.2%，對照組為45.7%），及產(chǎn)后第2、3 周血漿觸珠蛋白濃度。該小組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，僅在產(chǎn)前（產(chǎn)前2 周、1 周）或在產(chǎn)前和產(chǎn)后（產(chǎn)前2 周、1 周、產(chǎn)后1 周）進(jìn)行LAB 處理均可降低奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生率（僅在產(chǎn)前組為15%，產(chǎn)前和產(chǎn)后組為6%，對照組為38%），而且LAB 處理組中奶牛血清中脂多糖結(jié)合蛋白濃度和淀粉樣蛋白A 含量更低，說明陰道灌注LAB 后奶牛的全身炎癥反應(yīng)更弱。此外，Gеnis 等利用鼠李糖乳桿菌CECT278、乳酸桿菌CECT5915 和羅伊氏乳桿菌DSM20016 組成混合菌株，分別從陰道和子宮灌注進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)陰道灌注可以使奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生率從對照組的31.1%降至13.3%，而子宮灌注并未影響奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生率，但是經(jīng)LAB 處理后，2 組血液中中性粒細(xì)胞基因的表達(dá)明顯低于對照組，整體來說，陰道灌注效果可能更佳。

在治療奶牛子宮內(nèi)膜炎方面，乳酸菌也有明顯效果。薛洋洋將嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和納豆芽孢桿菌制成復(fù)合微生態(tài)制劑，通過子宮灌注治療了10頭患病奶牛，其中4 頭奶牛被治愈，2 頭奶牛為有效。相似的試驗(yàn)結(jié)果在其他種類的LAB 上也得到了證實(shí)，如植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌按1:1:1復(fù)配為混合活菌制劑后，其對臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎的治愈率為60%，有效率為90%。

總之，在世衛(wèi)組織關(guān)于減少抗生素使用的大背景下，乳酸菌制劑是一種有效的替代方式。

3 展 望

乳酸菌能通過競爭排斥、阻止黏附、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和產(chǎn)生生物活性物質(zhì)等方式發(fā)揮作用，但相關(guān)研究還不夠深入，如通過對比炎癥標(biāo)志物表達(dá)量的變化能夠發(fā)現(xiàn)乳酸菌參與調(diào)控了奶牛子宮炎癥反應(yīng)，但是具體參與機(jī)理在分子水平上還不夠明確。目前，包括子宮炎疫苗、免疫調(diào)節(jié)劑、益生菌等在內(nèi)的一系列替代療法在試驗(yàn)中都取得了可喜的結(jié)果，但是仍需要實(shí)踐驗(yàn)證和成本效益評(píng)估，才可能真正取代抗生素。