細(xì)菌黏菌素耐藥性及其逆轉(zhuǎn)機(jī)制研究進(jìn)展

胡功政 崔小蝶 翟亞軍 賀丹丹

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046）

黏菌素（colistin，COL）屬于陽(yáng)離子多肽類抗生素，因腎臟和神經(jīng)毒性于20世紀(jì)70年代幾乎被棄用，由于多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）革蘭陰性菌的出現(xiàn)，醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床將面臨無(wú)抗菌藥可用的局面，因此COL又被老藥新用，作為治療嚴(yán)重MDR革蘭陰性菌感染的最后一道防線。而隨著COL使用的增長(zhǎng)，細(xì)菌COL耐藥性世界范圍內(nèi)日益增長(zhǎng)，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。研制具有新作用靶點(diǎn)的新抗菌藥異常艱難，而逆轉(zhuǎn)耐藥性的聯(lián)合用藥（與新的化合物或老藥聯(lián)用）是與MDR細(xì)菌斗爭(zhēng)的經(jīng)濟(jì)、有效策略。聯(lián)合用藥可利用藥物間的協(xié)同作用，大幅提高抗菌療效，克服細(xì)菌耐藥性，減緩耐藥性發(fā)展。逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的化合物篩選、逆轉(zhuǎn)作用（聯(lián)合用藥協(xié)同增效）及其機(jī)制研究，近年已引起國(guó)內(nèi)外高度重視［1-4］，并已取得可喜進(jìn)展。

細(xì)菌COL耐藥性，本質(zhì)上是細(xì)菌在COL壓力下、為了生存而產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，與COL的作用機(jī)制密切相關(guān)；而聯(lián)用藥物或佐藥的逆轉(zhuǎn)作用往往也針對(duì)其作用機(jī)制和耐藥機(jī)制，即作用機(jī)制、耐藥機(jī)制與逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制間具有有機(jī)的內(nèi)部聯(lián)系。

1 COL作用機(jī)制

過(guò)去一般認(rèn)為COL對(duì)革蘭陰性菌的作用機(jī)制是膜損害（膜裂解死亡途徑），現(xiàn)在的試驗(yàn)已證明其作用機(jī)制還包括：囊泡-囊泡觸聯(lián)途徑、活性氧（reactive oxygen species，ROS）殺滅途徑及呼吸酶抑制途徑。

1.1 膜裂解死亡途徑

COL可選擇性地與革蘭陰性菌外膜（outer membrane，OM）LPS（起始靶位）結(jié)合，通過(guò)膜裂解殺滅細(xì)菌［5-7］。首先，COL帶正電荷的二氨基丁酸殘基中的游離r-氨基質(zhì)子化，靜電吸引類脂A中帶負(fù)電荷的磷酸頭部，競(jìng)爭(zhēng)性替代Ca2+和Mg2+。隨后COL分子插入疏水性N-末端脂肪酸鏈和D-phe6-L-leu7片段進(jìn)入外膜，減弱鄰近類脂A的組裝，引起外膜膨脹并形成不穩(wěn)定區(qū)。最后，COL橫跨疏水頭部和脂肪酸鏈的表面，引起自促攝入（self-promoted uptake），使內(nèi)膜（internal membrane，IM）稀薄并破壞磷脂雙層的完整性，從而導(dǎo)致IM裂解和細(xì)菌死亡。

1.2 囊泡-囊泡觸聯(lián)途徑

COL分子可借助于靜電作用和兩個(gè)疏水區(qū)，與陰離子的磷脂囊泡（即OM內(nèi)葉和IM的外葉）結(jié)合，介導(dǎo)環(huán)繞周質(zhì)的囊泡-囊泡觸聯(lián)融合，引起囊泡間（OM和IM小葉間）的磷脂交換，導(dǎo)致磷脂組成的特異性喪失和滲透性平衡破壞，使細(xì)菌裂解死亡［5-7］。

1.3 羥基自由基（·OH）誘導(dǎo)的死亡途徑（活性氧ROS殺滅途徑）

COL穿過(guò)外膜和內(nèi)膜時(shí)，使細(xì)菌活性氧（ROS）［超氧化物（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）］水平升高，首先促進(jìn)生成O2-，O2-隨后由超氧化物歧化酶（SOD）轉(zhuǎn)換成H2O2，H2O2將Fe2+氧化成Fe3+并生成·OH（芬頓反應(yīng)）?！H可導(dǎo)致DNA損傷、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡［5，7］。這一過(guò)程不依賴于COL與OM特異性靶位點(diǎn)的結(jié)合。

此外，COL刺激大腸桿菌soxS的表達(dá)，soxS是sodA（編碼含Mn-SOD），fpr（編碼NADPH：鐵氧蛋白氧化還原酶）和ydbK（編碼Fe-S還原酶）等ROS應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活劑［5］。

1.4 呼吸酶抑制途徑

COL穿過(guò)外膜和內(nèi)膜進(jìn)入細(xì)胞后，可加速TCA（三羧酸）循環(huán)和增強(qiáng)呼吸鏈，通過(guò)抑制細(xì)菌呼吸鏈中的NADH氧化酶等關(guān)鍵酶，造成呼吸鏈混亂并生成超氧化物［5-6］。

2 COL耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

沙門菌、大腸桿菌等對(duì)COL的獲得性耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，主要有染色體介導(dǎo)的脂多糖（LPS）修飾［由雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（TCSs）PhoPQ和PmrAB］、質(zhì)粒介導(dǎo)的可轉(zhuǎn)移COL耐藥（mcr基因）及尚未闡明分子機(jī)制的主動(dòng)外排系統(tǒng)等［7-9］。

2.1 染色體介導(dǎo)的LPS修飾（涉及2個(gè)TCSs PhoPQ和PmrAB）

2.1.1 PhoPQ介導(dǎo)LPS類脂的AL-Ara4N修飾 TCS PhoPQ由感應(yīng)子激酶PhoQ和調(diào)控子PhoP組成（圖1）。PhoP通過(guò)感應(yīng)陽(yáng)離子抗菌肽等外部信號(hào)使自身發(fā)生磷酸化而被激活，后者再激活arnBCADTEF（也稱pmrH）的表達(dá)。pmrH編碼4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖（Ara4N）轉(zhuǎn)移酶，使陽(yáng)離子的Ara4N加成到類脂A的磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生L-Ara4N化修飾，導(dǎo)致陽(yáng)離子COL與外膜陰性LPS的親和力降低，使細(xì)菌耐藥［7-9］。MgrB為負(fù)性調(diào)控蛋白，通過(guò)抑制PhoQ而抑制pmrH的表達(dá)。mgrB缺失、變異，均可上調(diào)PhoPQ和pmrH的表達(dá)，導(dǎo)致對(duì)COL耐藥。

圖1 由脂多糖（LPS）修飾介導(dǎo)的沙門菌對(duì)黏菌素的一般耐藥機(jī)制Fig. 1 General mechanism of Salmonella resistance to COL mediated by lipopolysaccharide（LPS）modification

2.1.2 PmrAB介導(dǎo)的類脂A的pEtN修飾 TCS PmrAB由感應(yīng)子激酶PmrB和調(diào)控子PmrA組成（圖1）。沙門菌中，PmrD是PhoPQ和PmrAB兩個(gè)TCSs間的連接蛋白，發(fā)揮正調(diào)控作用。PmrB感應(yīng)外部信號(hào)（如COL等）被激活，通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移使PmrA磷酸化而激活，進(jìn)而上調(diào)pmrC表達(dá)，pmrC編碼磷酸乙醇胺（pEtN）轉(zhuǎn)移酶，使pEtN加成到類脂A的1-磷酸上，產(chǎn)生pEtN修飾，使細(xì)菌耐藥［8-9］。PhoPQ也可通過(guò)激活PmrD，間接激活PmrAB，進(jìn)而刺激pmrC的表達(dá)。PmrA磷酸化后也可上調(diào)pmrH的表達(dá)。

PmrA介導(dǎo)的LPS修飾發(fā)生于類脂A、核心多糖和 O-抗原鏈 3 個(gè)區(qū)域［6，8］。（1）最內(nèi)的類脂 A區(qū)，PmrA除激活pmrC、pmrH外，還可激活L-Ara4N生物合成與類脂A修飾物加合相關(guān)基因ugd（編碼UDP-葡萄糖-脫氫酶）和pbg（編碼L-Ara4N轉(zhuǎn)移酶）的表達(dá)；（2）中心的核心多糖區(qū)，PmrA可激活eptB和cptA基因，后者的產(chǎn)物可介導(dǎo)LPS核心區(qū)磷酸化的庚糖（I）磷酸基團(tuán)的PEtN修飾；（3）最外的O-抗原鏈，O抗原長(zhǎng)度的增加將導(dǎo)致對(duì)COL高度耐藥，PmrA可上調(diào)沙門菌LPS修飾位點(diǎn)Wzzst和Wzzsep基因的轉(zhuǎn)錄，增加LPS中O-抗原量，增加耐藥性。

2.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制

自質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr-1（編碼pEtN轉(zhuǎn)移酶）被發(fā)現(xiàn)以來(lái)［10］，已在全球動(dòng)物和人的腸桿菌科細(xì)菌中相繼檢出。迄今已報(bào)道10種mcr基因（mcr-1-mcr-10）［11］。MCR-1編碼一個(gè)pEtN轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致在pEtN加成到LPS的脂質(zhì)A，增加LPS上的陽(yáng)離子電荷，從而降低COL與LPS的結(jié)合［10］。所有已發(fā)表的MCR-1的晶體結(jié)構(gòu)都表明MCR-1的活性位點(diǎn)有至少一個(gè)共同的鋅離子，證實(shí)MCR-1是一種鋅離子蛋白［12］。mcr-1可同時(shí)位于染色體和質(zhì)粒上，單拷貝mcr-1可致LPS修飾，而多拷貝染色體mcr-1可促進(jìn)耐藥性的穩(wěn)定持續(xù)［13］。位于質(zhì)粒上的mcr基因加速了COL耐藥性在不同細(xì)菌種屬之間的傳播，因此為解決COL耐藥日益嚴(yán)重的問(wèn)題，中國(guó)已禁止將COL作為飼料添加劑用于促生長(zhǎng)，許多歐洲國(guó)家也減少了COL在畜牧業(yè)中的應(yīng)用［14］。

2.3 未闡明分子機(jī)制的主動(dòng)外排系統(tǒng)

采用正向（激活）或反向（基因缺失或外排泵抑制）研究均證明，外排泵如AcrAB-TolC（大腸桿菌、沙門菌等），KpnEF（肺炎克雷伯菌），以及MexXYOprM（綠膿桿菌）等在COL耐藥性中十分重要［8-9］。外排泵抑制劑CCCP能逆轉(zhuǎn)多種細(xì)菌對(duì)COL的耐藥性，無(wú)論涉及pmrB、mgrB變異，還是涉及mcr-1陽(yáng)性，均有逆轉(zhuǎn)效果［15］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌主動(dòng)外排系統(tǒng)（AcrAB-TolC）ΔacrB時(shí)，并不明顯改變對(duì)COL的敏感性，但當(dāng)ΔtolC或ΔacrB與CpxAR系統(tǒng)激活協(xié)同作用時(shí)，菌株對(duì)COL的敏感性顯著增強(qiáng)［16-19］。而SoxRS可通過(guò)上調(diào)AcrAB-TolC介導(dǎo)陰溝和阿氏腸桿菌對(duì)COL的異質(zhì)性耐藥［20］。盡管現(xiàn)已證明外排泵在COL耐藥性中有重要作用，但其具體分子機(jī)制并不清楚。

3 佐藥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌COL耐藥性的研究進(jìn)展

3.1 逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的藥物或化合物

研發(fā)新抗菌藥耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高、風(fēng)險(xiǎn)大，而抗生素佐藥（adjuvants）針對(duì)細(xì)菌的非必須功能，并增強(qiáng)抗生素活性，可提供經(jīng)濟(jì)有效的方法逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性。

目前，應(yīng)用佐藥逆轉(zhuǎn)COL耐藥性已成為研究熱點(diǎn)，有多種方法用于佐藥篩選，如表型檢測(cè)（MIC測(cè)定、棋盤試驗(yàn)等）、分子對(duì)接技術(shù)、生物信息學(xué)方法［4］和萬(wàn)古霉素低溫拮抗作用篩選方法［21］等。萬(wàn)古霉素低溫拮抗作用是有用的較新的特異性篩選平臺(tái)，E.coli在應(yīng)激期間對(duì)萬(wàn)古霉素變得敏感，這種表型可由滅活涉及外膜生物合成尤其是LPS核心多糖合成所必需的基因所逆轉(zhuǎn)。由于涉及非必需的外膜生物合成的基因損害，常常使革蘭陰性菌對(duì)經(jīng)典的作用于革蘭陽(yáng)性菌的抗生素敏感，故在低溫下即15℃對(duì)萬(wàn)古霉素拮抗作用的篩選檢測(cè)，可檢出擾亂外膜的非致死分子即逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的化合物。已有研究利用該篩選方法對(duì)1 440種之前批準(zhǔn)的藥物進(jìn)行了篩選，篩選鑒定出1種活性化合物噴他脒（pentamidine），能夠逆轉(zhuǎn)革蘭陰性菌的COL耐藥性，突顯了這種篩選方法的特異性。

已報(bào)道逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的佐藥約60余種，主要包括（1）抗寄生蟲(chóng)藥物：如抗原蟲(chóng)藥噴他脒、水楊酰苯胺類抗蠕蟲(chóng)藥五羥氯柳胺、氯硝柳胺、碘醚柳胺等［21-25］；（2）大環(huán)內(nèi)酯類抗革蘭陽(yáng)性菌抗生素克拉霉素、阿奇霉素等［26］；（3）其他藥物：褪黑素［27］、紫檀芪（抗癌）［28］、疊氮胸苷［29］、阿司匹林等；（4）天然化合物：如白藜蘆醇、熊果酸、蛇床子素、丁香酚［30-33］；（5）藥物衍生物：如苯并咪唑、色胺和苯氨乙酮衍生物和［34-35］；（6）新的先導(dǎo)化合物：如廣譜佐藥SLAP-S25［1］、OmpA抑制劑AOA-2［36］；（7）小分子化合物 ：二氨基咪唑［37］、dephostatin［38］和帶正電荷的二胺嗎啡代寡核苷酸肽［39］。

3.2 逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的分子機(jī)制

逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的機(jī)制研究報(bào)道不斷增加，但仍處于初步探索階段，大多數(shù)僅針對(duì)相應(yīng)藥物的某一方面機(jī)制進(jìn)行研究且不深入，復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)機(jī)制闡明仍面臨著挑戰(zhàn)。目前已報(bào)道的逆轉(zhuǎn)COL耐藥的機(jī)制主要分為以下幾個(gè)方面：與COL作用機(jī)制相關(guān)的逆轉(zhuǎn)機(jī)制，與COL耐藥機(jī)制相關(guān)的逆轉(zhuǎn)機(jī)制、影響外膜蛋白表達(dá)的逆轉(zhuǎn)機(jī)制以及綜合逆轉(zhuǎn)機(jī)制。

與COL作用機(jī)制相關(guān)的逆轉(zhuǎn)機(jī)制主要有：（1）損害細(xì)菌外膜：通過(guò)外漏蛋白質(zhì)或核酸含量的測(cè)定、膜完整性和通透性試驗(yàn)、細(xì)菌的溶解檢測(cè)等試驗(yàn)證明 ：如噴他脒［21］、氯羥柳胺［22］、粉防己堿［40］等逆轉(zhuǎn)細(xì)菌（肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌）COL耐藥性，其機(jī)制在于損害細(xì)菌外膜而增加了細(xì)菌外膜的通透性；（2）增強(qiáng)氧化應(yīng)激：質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力（PMF）的破壞會(huì)減少ATP的生成，增加氧氣消耗和氧化應(yīng)激。當(dāng)外排泵受到抑制時(shí)，通過(guò)PMF、細(xì)胞內(nèi)ATP水平、耗氧量及菌體內(nèi)氧化還原電位測(cè)定等證明，氯硝柳胺能使大腸桿菌解偶聯(lián)氧化磷酸化，破壞菌株的氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，是逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的機(jī)制之一［41］。

與COL耐藥機(jī)制相關(guān)的逆轉(zhuǎn)機(jī)制主要有：（1）抑制mcr-1的表達(dá)或抑制MCR-1蛋白，如粉防己堿可抑制 mcr-1 的表達(dá)［40］；蛇床子素［32］、紫檀芪［28］、苯氨乙酮衍生物（能通過(guò)氫鍵與MCR-1蛋白互作，抑制MCR-1晶體所導(dǎo)致的磷酸乙醇胺（pEtN）轉(zhuǎn)移反應(yīng)，抑制MCR-1的酶活性）［35］、丁香酚［33］不僅可抑制mcr-1的表達(dá)，而且其酚羥基還可與MCR-1蛋白的鋅原子結(jié)合，與COL聯(lián)用對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用；帶正電荷的二胺嗎啡代寡核苷酸肽［39］是以mRNA為靶位、阻止翻譯的MCR-1反義分子，能恢復(fù)mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌對(duì)COL的敏感性。（2）下調(diào)TCS pmrAB表達(dá)，如小分子二氨基咪唑［37］及亞硝苯胺類化合物dephostatin［38］，能顯著下調(diào)或阻斷TCS pmrAB，逆轉(zhuǎn)類脂A修飾，阻斷細(xì)菌（沙門菌）對(duì)COL的耐藥性。（3）外排泵機(jī)制：基因缺失技術(shù)證明，沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株JS主動(dòng)外排系統(tǒng)ΔtolC時(shí)，能夠明顯改變對(duì)COL的敏感性，菌株對(duì)COL的敏感性顯著增強(qiáng)［19］。采用表型改變、外排泵活性、分子對(duì)接、轉(zhuǎn)錄組、基因缺失、熒光探針檢測(cè)等試驗(yàn)及細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗生素濃度變化證明，多類逆轉(zhuǎn)藥物（如氯羥柳胺［22］、熊果酸［31］、CCCP［15］和粉防己堿［40］）均有外排泵抑制作用，能使COL耐藥的大腸桿菌或沙門菌恢復(fù)敏感性。

影響外膜蛋白表達(dá)的逆轉(zhuǎn)機(jī)制：AOA-2通過(guò)下調(diào)OmpA和上調(diào)OmpA25的表達(dá)量，增強(qiáng)COL對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的殺菌活性［36］。

綜合逆轉(zhuǎn)機(jī)制，如SLAP-S25通過(guò)膜損害、代謝改變和細(xì)胞內(nèi)抗生素蓄積［1］多種機(jī)制恢復(fù)細(xì)菌對(duì)多種抗生素包括COL的敏感性；褪黑素能增加外膜的通透性、促進(jìn)氧化損傷和抑制外排泵［27］，逆轉(zhuǎn)由MCR介導(dǎo)的陰性菌對(duì)COL耐藥性。粉防己堿通過(guò)增強(qiáng)COL的膜損傷能力、破壞了細(xì)菌的質(zhì)子動(dòng)力、外排泵功能和抑制MCR-1蛋白來(lái)逆轉(zhuǎn)由MCR介導(dǎo)的沙門菌對(duì)COL的耐藥性（圖2）［40］。

圖2 逆轉(zhuǎn)革蘭陰性菌黏菌素耐藥性的分子機(jī)制Fig. 2 Molecular mechanism of reversing COL resistance in gram negative bacteria

4 存在問(wèn)題與展望

近年文獻(xiàn)報(bào)道的逆轉(zhuǎn)細(xì)菌COL耐藥性的佐藥已有60余種，但因有效性、安全性、特異性和合理用量等問(wèn)題尚無(wú)一個(gè)成功用于臨床。這些佐藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理作用各異，其共性逆轉(zhuǎn)機(jī)制除膜損害、mcr-1表達(dá)降低或MCR-1活性抑制得到清晰的闡明外，對(duì)其他方面分子機(jī)制的研究尚不系統(tǒng)深入。例如，抑制外排泵、增加氧化損傷被證明是逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的重要機(jī)制，但革蘭陰性菌外排泵有多種，除最重要的外排系統(tǒng)AcrAB-TolC外，依賴TolC的RND外排泵還有AcrAD-TolC、AcrEF-TolC、AcrABTolC等多種，每種外排泵又有多個(gè)組分，且其表達(dá)受marA、soxS、robA、ranA等全局調(diào)控基因的調(diào)控。佐藥抑制何種外排泵、如何抑制外排泵而逆轉(zhuǎn)COL耐藥性及其量效關(guān)系？又如氧化損傷涉及ROS產(chǎn)生、清除、TCA循環(huán)、呼吸鏈等環(huán)節(jié)，佐藥通過(guò)影響何種環(huán)節(jié)，來(lái)逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對(duì)COL的耐藥性？其量效關(guān)系如何？目前對(duì)佐藥或聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的分子機(jī)制遠(yuǎn)未闡明，該方面的研究總體處于初步階段，是制約安全高效佐藥篩選及聯(lián)用措施建立的關(guān)鍵瓶頸。

隨著組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白質(zhì)組）技術(shù)的應(yīng)用，結(jié)合差異基因的缺失與回補(bǔ)，將推動(dòng)佐藥的具體靶點(diǎn)（如外排泵、氧化應(yīng)激和代謝途徑）得以揭示，令新的佐藥篩選更具針對(duì)性；而對(duì)逆轉(zhuǎn)作用的量效關(guān)系研究，將使得聯(lián)合用藥方案或其復(fù)方制劑中佐藥用量的確定有科學(xué)的理論依據(jù)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，一批新的逆轉(zhuǎn)COL耐藥性的高效佐藥將陸續(xù)篩選發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)耐藥性的研究理論將不斷的豐富、深化和完善。