酶促重組等溫擴(kuò)增實(shí)時熒光法快速檢測肺炎支原體方法的建立及應(yīng)用

胡海洋 應(yīng)婉琴 何軍 呂芷賢 謝小平 鄧仲良

（1. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫系，衡陽 421001；2. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院，衡陽 421001 3. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，衡陽 421001）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）是引起社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的重要病原體［1］，主要通過呼吸道飛沫傳播，傳染性強(qiáng)［2］。肺炎支原體肺炎一般起病緩慢，潛伏期較長，約為1-3周。臨床癥狀主要有發(fā)熱、流感樣癥狀，如鼻塞、流涕、肌肉酸痛、乏力、咽痛、咳嗽和胸痛等，還可引發(fā)呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥和肺外并發(fā)癥，造成機(jī)體多系統(tǒng)損傷，如壞死性肺炎、胸腔積液、支氣管哮喘、皮膚損害、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等［3-4］。若不能早期快速診斷，延誤治療，可加重病情，嚴(yán)重患者可發(fā)生死亡，因此建立肺炎支原體早期快速診斷的方法，對于肺炎支原體的治療和控制支原體肺炎的流行具有十分重要的意義。

肺炎支原體的鑒定包括分離培養(yǎng)、抗體檢查、分子生物學(xué)等方法。分離培養(yǎng)是診斷肺炎支原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于支原體培養(yǎng)和形態(tài)觀察困難，培養(yǎng)時間長，檢出率較低，已不能滿足臨床快速診斷需要［5-6］?？贵w檢查方法包括ELISA、熒光抗體試驗(yàn)等，檢查簡單、快速和敏感，但靈敏度較低，在健康人群中出現(xiàn)高背景的干擾性抗體，存在非特異性的交叉反應(yīng)，可能會導(dǎo)致一定的假陽性結(jié)果［7］，不能用于支原體早期篩查，適應(yīng)用于肺炎支原體感染的回顧性調(diào)查。分子生物學(xué)是檢測肺炎支原體核酸最主要檢查方法，包括PCR、等溫擴(kuò)增技術(shù)等。由于基于PCR的一系列檢測方法（常規(guī)PCR、實(shí)時熒光PCR）檢測程序復(fù)雜，檢測時間較長，需要熱循環(huán)儀儀器，成本較高，對試驗(yàn)技術(shù)條件要求較高，且受儀器、設(shè)備和電力以及空間等諸多因素的限制，不利于快速檢測以及在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用［8-9］。與其他的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，等溫擴(kuò)增技術(shù)大大縮短了反應(yīng)時間、降低了對儀器的依賴［10］。常見的等溫擴(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［11］、重組酶聚合酶等溫擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）［12］、依賴核酸序列擴(kuò)增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）［13］、鏈替代擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）［14］、滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）［15］等。目前，等溫擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種檢測病原體的研究，如葡萄卷葉伴隨病毒3、鮑曼不動桿菌、沙眼衣原體等［16-18］，這些快速檢測方法的建立為開發(fā)新的診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

酶促重組等溫擴(kuò)增技術(shù)（enzymatic recombinase amplification，ERA）是一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，是RPA技術(shù)的改良版本［19］。ERA技術(shù)操作簡單，耗時短，相比于普通PCR（反應(yīng)時間1.5 h）［20］，LAMP（反應(yīng)時間 1 h）［21］，ERA 技術(shù) 15-20 min 即可完成檢測。此外，該方法重復(fù)性好，操作簡單，無需專業(yè)背景的操作人員，也不需要大型精密儀器，僅需要便攜式熒光儀即可。目前，還尚未發(fā)現(xiàn)將該方法運(yùn)用到肺炎支原體檢測的研究。因此，本研究基于ERA技術(shù)建立快速檢測肺炎支原體的實(shí)時熒光檢測方法，利用ERA技術(shù)對肺炎支原體P1基因進(jìn)行擴(kuò)增，在反應(yīng)體系中引入熒光探針，用熒光儀對發(fā)出的熒光進(jìn)行分析檢測。在保證痕量高靈敏度、高特異性檢測的情況下，極大的降低對時間及環(huán)境的要求，使得利用基因分子檢測技術(shù)建立快速、低耗的社區(qū)肺炎支原體核酸檢測技術(shù)成為可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和臨床標(biāo)本 肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29342）由南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病毒所提供；34份發(fā)熱呼吸道候癥群臨床病例的咽拭子標(biāo)本由南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.1.2 儀器和試劑 ERA熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（蘇州先達(dá)基因科技有限公司）、QIAamp DNA提取試劑盒（QIAGEN GmbH）、肺炎支原體核酸檢測試劑盒（圣湘生物科技股份有限公司）、ABI 7500熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific）

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫檢索并下載肺炎支原體保守基因P1的基因組（＞NC_000912.1：180858-182404），ERA引物和探針設(shè)計(jì)與常規(guī)PCR不同，根據(jù)以下參數(shù)，使用在線軟件Primer BLAST設(shè)計(jì)引物和探針：引物長度為30-35個核苷酸；Tm值為50-75℃；GC含量為30%-70%；探針長度為46-52個核甘酸，其中至少30個位于THF位點(diǎn)的5'端，另外至少15個位于其3'端；熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)只能標(biāo)記在胸腺嘧啶（T）上，且熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)間距在2-5個堿基；THF為替換位于熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的某堿基；且探針的3'端需加上阻斷基團(tuán)。引物和探針均盡可能避免引物二聚體。使用BLAST分析引物和探針特異性，確保與其他病原體不會發(fā)生錯配。詳情如表1和圖1所示。所有寡核苷酸引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 ERA實(shí)時熒光法引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences of ERA real-time fluorescence method

圖1 ERA實(shí)時熒光法引物和探針序列Fig. 1 Primers and probe sequences for ERA real-time fluorescence method

1.2.2 核酸提取 使用QIAamp DNA提取試劑盒對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床樣本進(jìn)行核酸提取，-80℃保存。

1.2.3 ERA實(shí)時熒光法快速檢測肺炎支原體方法的建立 向內(nèi)含重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、鏈置換DNA聚合酶凍干粉的反應(yīng)管中加入50 μL的反應(yīng)體系，包括21.2 μL的水，20 μL的溶解劑，10 μmol/L的正向引物和反向引物各2.1 μL，0.6 μL的探針（10 μmol/L），2 μL 的模板和 2 μL 激活劑。其中，2 μL的激活劑加在反應(yīng)管蓋中，通過短暫離心使激活劑進(jìn)入預(yù)混合液中，再次快速離心。迅速將離心后的反應(yīng)管放入事先調(diào)好程序的qPCR儀中，在37℃孵育20 min，每分鐘監(jiān)測一次熒光，實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)，同時設(shè)置陰性對照。

1.2.4 ERA系統(tǒng)條件優(yōu)化 針對肺炎支原體P1基因，分別設(shè)計(jì)兩條上游引物和下游引物，分別用F1、F2、R1、R2表示，并交叉配對為4組引物對，將不同的引物對加入反應(yīng)體系，通過熒光曲線觀察優(yōu)化結(jié)果；選定最佳引物后，觀察不同的反應(yīng)溫度（25℃、30℃、35℃、40℃）對反應(yīng)體系的影響。每次反應(yīng)中肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株模板濃度為105copies/μL，以無酶水作為陰性對照。

1.2.5 敏感性檢測 確定一段包含上下游引物在內(nèi)的肺炎支原體部分序列，將其克隆至pUC57載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋至終濃度為106、105、104、103、102、101、100copies/μL， 用 建立好的ERA實(shí)時熒光法對每個樣品進(jìn)行檢測，同時以無酶水作為陰性對照，評價該方法的敏感性。

1.2.6 特異性檢測 用建立好的ERA實(shí)時熒光法分別對肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，AB）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAE）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SAU）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，HIB）、鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci，Cps）和肺炎支原體（MP）進(jìn)行檢測，病原體的模板濃度均為105copies/μL，以無酶水作為陰性對照，評價該方法的特異性。

1.2.7 臨床樣本驗(yàn)證 收集肺炎支原體感染者和健康人的樣本共34例，同時用ERA熒光法和肺炎支原體核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）檢測，同時以無酶水作為陰性對照。以熒光定量PCR法的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，評價基于ERA實(shí)時熒光法的診斷敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。

2 結(jié)果

2.1 ERA實(shí)時熒光法的建立和條件優(yōu)化

用本研究建立的ERA實(shí)時熒光法同時對肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株和陰性對照進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對照的熒光曲線無變化，幾乎保持水平狀態(tài)，而肺炎支原體產(chǎn)生的熒光曲線在10 min左右起峰迅速，反應(yīng)20 min時幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)，熒光值遠(yuǎn)超過陰性對照（NTC）產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，表明該方法具有可行性（圖2-A）。隨后，分別用4組引物對P1基因進(jìn)行ERA實(shí)時熒光檢測，結(jié)果顯示由F2R1組成的引物對相較于其他引物對（F1R1、F1R2、F2R2）起峰速度快，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度高，與陰性結(jié)果之間的差異更為顯著，因此將F2R1作為后續(xù)研究的引物對用于ERA實(shí)時熒光法快速檢測肺炎支原體（圖2-B）。接下來，又分別對25℃、30℃、35℃、40℃這4個溫度進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果顯示該方法的溫度適用范圍廣，在25-40℃均可以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，完成對肺炎支原體的檢測；當(dāng)反應(yīng)溫度為25℃時，反應(yīng)速度最為緩慢，熒光曲線在15 min內(nèi)幾乎無變化，隨后熒光值才緩慢上升；其他3個溫度（30℃、35℃、40℃）幾乎同時起峰，其中30℃時的反應(yīng)速度較慢，熒光值也略低，35℃和40℃在反應(yīng)初期熒光曲線就明顯上升，40℃溫度下的曲線比35℃反應(yīng)略快些，但由于在該條件下反應(yīng)18 min后熒光值明顯下降，此時35℃下的熒光曲線仍保持穩(wěn)定狀態(tài)（圖2-C），因此選擇35℃作為ERA實(shí)時熒光法檢測肺炎支原體的最佳反應(yīng)溫度。

圖2 ERA實(shí)時熒光法的建立（A）和條件優(yōu)化（B-C）Fig. 2 Establishment（A）and condition optimization（B-C）of ERA real-time fluorescence method

2.2 敏感性分析

將建立好的ERA實(shí)時熒光法對10倍梯度稀釋的質(zhì)粒進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，該方法對肺炎支原體質(zhì)粒的檢出限為103copies/μL（圖3）。

圖3 ERA實(shí)時熒光法敏感性分析Fig. 3 Sensitivity analysis via ERA real-time fluorescence method

2.3 特異性分析

對肺炎支原體和其他6種呼吸道病原體（KPN、AB、PAE、SAU、HIB和Cps）運(yùn)用已建立好的ERA實(shí)時熒光法進(jìn)行快速檢測，結(jié)果如圖4顯示，只有肺炎支原體產(chǎn)生熒光曲線，完成快速擴(kuò)增，而其他病原體均無擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，與陰性結(jié)果保持一致，表明該方法特異性好，與其他病原體無交叉反應(yīng)。

圖4 ERA實(shí)時熒光法特異性分析Fig. 4 Specificity analysis via ERA real-time fluorescence method

2.4 臨床樣本驗(yàn)證

為驗(yàn)證ERA實(shí)時熒光法與熒光定量PCR法的符合程度，同時用這兩種方法對34例臨床樣本進(jìn)行檢測，以熒光定量PCR法的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，ERA實(shí)時熒光法的檢測結(jié)果如圖5（圖中水平虛線為檢出限閾值）所示，8例陰性樣本（-1--8）的結(jié)果均為陰性，26例陽性樣本（1-26）中得到25個陽性結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)（表2），ERA實(shí)時熒光法的診斷敏感度為96.15%（25/26）、診斷特異度為100%（8/8）、陽性預(yù)測值為100%（25/25）、陰性預(yù)測值為88.89%（8/9），說明ERA實(shí)時熒光法跟標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR方法陽性和陰性預(yù)測值有很好的一致性。

表2 ERA實(shí)時熒光法與熒光定量PCR法的比較Table 2 Comparison between ERA real-time fluorescence method and fluorescence qPCR method

圖5 ERA實(shí)時熒光法的臨床樣本驗(yàn)證Fig. 5 Clinical sample validation via ERA real-time fluorescence method

3 討論

肺炎支原體是是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染、尤其是非典型肺炎的重要病原體，臨床癥狀以咳嗽、發(fā)熱、咽喉痛和肌肉疼為主［22］，與腺病毒、流感病毒、SRAS等其他呼吸道病毒相似，易漏診和誤診。分離培養(yǎng)是診斷肺炎支原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但肺炎支原體屬于苛養(yǎng)菌，生長條件要求高，培養(yǎng)時間長，已不能滿足臨床快速診斷需要［23］?？贵w的產(chǎn)生需要窗口期，因此抗原抗體反應(yīng)不能用于支原體早期篩查［24］。PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，但對儀器、環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員要求較高，操作復(fù)雜［25］。因此，建立一種肺炎支原體早期快速簡單的新診斷方法尤為重要。

肺炎支原體基因組有4組重復(fù)序列，其中，肺炎支原體的黏附相關(guān)蛋白P1包含了3組，分別是RepMP2/3，RepMP4 和 RepMP5［26］，其高度保守性適用于肺炎支原體的核酸診斷。因此，本研究選擇肺炎支原體P1基因RepMP4區(qū)的部分片段作為靶基因來建立ERA實(shí)時熒光法進(jìn)行快速核酸檢測，通過熒光觀察來優(yōu)化反應(yīng)條件，評價其敏感性和特異性，并對臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果表明本研究建立的ERA實(shí)時熒光法檢測肺炎支原體可實(shí)現(xiàn)快速檢測，起峰時間在10 min左右，20 min后反應(yīng)幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)，相較于RPA、LAMP、SEA的起峰時間分別是14 min、70 min和22 min［27-29］，該方法進(jìn)一步提高了反應(yīng)速度，減少了檢測時間，可滿足現(xiàn)場快速檢測的需求；敏感性分析利用肺炎支原體構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行確定，通過ERA實(shí)時熒光法對梯度稀釋的質(zhì)粒進(jìn)行檢測，該方法對肺炎支原體的檢出限為103copies/μL，與LAMP檢測肺炎支原體的結(jié)果一致［30］，遠(yuǎn)高于SEA技術(shù)的敏感性［29］。雖然ERA實(shí)時熒光法的檢出限低于實(shí)時熒光PCR法，但較高的閾值可防止由于檢測方法過于敏感而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；對肺炎支原體和其他6種呼吸道病原體進(jìn)行ERA實(shí)時熒光法檢測，除肺炎支原體外，其他病原體均為陰性結(jié)果，未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，顯示了該方法對肺炎支原體的特異性；以熒光定量PCR結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對34分臨床樣本進(jìn)行監(jiān)測分析，檢測出25份陽性結(jié)果，9份陰性結(jié)果，該方法的診斷敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為96.15%、100%、100%、88.89%，與RTFQ-PCR的檢測效能相當(dāng)［31］。

盡管ERA實(shí)時熒光法可以快速、敏感、特異地檢測出肺炎支原體，但該方法的探針設(shè)計(jì)復(fù)雜，價格較貴，且在高溫條件下的結(jié)果不太穩(wěn)定，產(chǎn)生“跳躍”現(xiàn)象，有待進(jìn)一步探究與完善。綜上，本研究建立的ERA實(shí)時熒光法檢測肺炎支原體具有檢測周期短、敏感性好、特異性高的特點(diǎn)，還可以在常溫下進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求簡單，僅需一臺熒光儀即可。此外，該方法操作簡單，非專業(yè)人員也可以完成檢測，滿足現(xiàn)場檢查的需求，使得利用基因分子檢測技術(shù)建立快速低耗的社區(qū)肺炎支原體核酸檢測技術(shù)成為可能。

4 結(jié)論

本研究針對肺炎支原體P1基因設(shè)計(jì)并建立了ERA實(shí)時熒光法，并應(yīng)用于肺炎支原體的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2R1引物對的擴(kuò)增效果最佳，在35℃條件下反應(yīng)20 min即可達(dá)到平臺期，反應(yīng)敏感性為103copies/μL，與其他病原體無交叉反應(yīng)，臨床診斷敏感度、診斷特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為96.15%、100%、100%、88.89%，表明該方法具有快速簡單，敏感性好，特異性高等特點(diǎn)。